正交設(shè)計優(yōu)選枳椇子中總黃酮的提取工藝

田智勇,柴 鄭,徐亞菲,趙凈凈,凌春生

(河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開封475004)

正交設(shè)計優(yōu)選枳椇子中總黃酮的提取工藝

田智勇,柴 鄭,徐亞菲,趙凈凈,凌春生*

(河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開封475004)

目的研究枳椇子總黃酮的超聲提取最佳工藝條件;方法利用超聲提取法,以藥材目數(shù)、料液比、超聲溫度、超聲功率為考察因素,枳椇子中蘆丁的含量為考察指標(biāo),紫外分光光度法測定(417 nm)結(jié)果最佳提取工藝:干燥藥材(20～40目)中加入14倍量的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液,超聲功率:160 W、溫度:70℃、時間:60 min時含量最高,為1.17 mg/g?；貧w方程為A=0.033 3C―0.022 3(r=0.999 3),蘆丁在5.84～23.36μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率為96.92%。結(jié)論超聲法提取枳椇子中的蘆丁優(yōu)勢明顯,有效成分溶出快、用時短、效率高,紫外測定其含量靈明度較高、準(zhǔn)確。

枳椇子;總黃酮;蘆丁;超聲提取

枳椇子藥效廣泛,能抗癌、抗肝臟毒、抗炎、抗菌、抗病毒、抗自由基[1-3],致瀉、解痙,同時對心血管系統(tǒng)也有作用。現(xiàn)有文獻(xiàn)[4-6]報道,枳椇子中的黃酮類化合物對急性酒精中毒有預(yù)防作用,能減輕有毒物質(zhì)對肝細(xì)胞的損傷。2-苯基色原酮為黃酮類化合物的母核,與顯色劑(10g/L AlCl3的乙醇溶液)[7]反應(yīng)生成的絡(luò)合物在紫外下有吸收,在一定濃度范圍內(nèi)下其濃度與吸光度符合朗伯―比爾定律。枳椇子總黃酮常見提取方法有:傳統(tǒng)提取法(浸漬法、煎煮法、滲漉法、回流法);堿提酸沉法;溶劑萃取法等。這些方法提取時間長、溶劑用量大、提取率不高,而超聲法[8]是利用超聲輻射所產(chǎn)生劇烈的機(jī)械振動、微擾效應(yīng)、等物理作用產(chǎn)生的強(qiáng)大瞬間壓差能夠快速破壞植物的細(xì)胞壁。加速胞內(nèi)成分的釋放,傳質(zhì)過程加快,有效成分的溶出也加快。我們采用超聲法對枳椇子總黃酮進(jìn)行單因素及正交試驗,優(yōu)選出枳椇子中蘆丁的最佳提取方案[9]。與常見方法相比,省時、高效、節(jié)能、簡便、易行。將其用于提取當(dāng)中,選出最佳提取工藝,對枳椇子的開發(fā)利用有重要的現(xiàn)實意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV755B紫外全波長掃描儀(上海奧析科學(xué)儀器有限公司);紫外―可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司);JY-3002電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司);AB135-S型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo儀器公司);KQ-300型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司);SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DFY-250搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司); GZX-DH-50X5S-Ⅱ電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.2 材料

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所,批號: 100080―201307);枳椇子(河南禹州藥材批發(fā)市場);甲醇(天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司,批號:402086―06650);乙醇(安徽安特食品股份有限公司,批號: 20131007);石油醚60～90℃(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);氯化鋁(武漢云曦化工有限責(zé)任公司)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精稱干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1.50 mg于25 m L容量瓶中,加甲醇超聲溶解并定容至刻度, (C=60.00μg/m L)。

2.2 供試品溶液的制備

稱枳椇子(20～40目)10.00 g,加入14倍體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液,超聲提取(功率:160 W、溫度: 70℃下、時間:60 min),抽濾,石油醚(60～90℃)脫脂后,精密吸取4.0 m L加入2.0 m L的10 g/L AlCl3乙醇溶液,用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液定容至25 m L容量瓶中,室溫靜置20 min,待測。

2.3 蘆丁最大吸收波長的確定

精密吸取“2.1項”蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1.5 m L加2 m L的10 g/L AlCl3乙醇溶液,超聲混勻,甲醇定容至10 m L容量瓶,室溫靜置20 min,得濃度為8.76μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以甲醇為空白對照予200～800 nm波長范圍內(nèi)測定吸光度,見圖1。

圖1 蘆丁全波長掃描圖

如圖1所示,波長在274 nm和417 nm處有2個最大吸收峰,波長417 nm處吸收峰斜率比274 nm處小,波長偏差Δλ對應(yīng)的吸光度偏差ΔA比其他區(qū)域小,實驗誤差相對較小。實驗中以417 nm為最大吸收波長。

2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 m L,加入2.0 m L的10 g/L AlCl3乙醇溶液,超聲混勻,靜置5 min,體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至10 m L,超聲混合均勻,靜置20 min。對吸光度和濃度作圖,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A= 0.033 3C―0.022 3,r=0.999 3,線性范圍在5.84～23.36μg/m L,線性良好。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 精密度實驗 取“2.1項”母液2 m L,加2 m L的10 g/L AlCl3乙醇溶液,超聲混勻,靜置5 min,體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液稀釋至10 m L容量瓶,混合均勻,室溫靜置20 min,在波長417 nm處測吸光度A,重復(fù)6次,計算得RSD=0.37%,表明儀器精密度良好,結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果(n=6)

2.5.2 重復(fù)性實驗 稱取枳椇子藥材(20～40目)顆粒10.00 g,按照“2.2項”制備供試品溶液,在417 nm處測吸光度,測定6次,計算得RSD=0.73%,表明此方法重復(fù)性良好,結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果(n=6)

2.5.3 穩(wěn)定性實驗 稱取枳椇子藥材(20～40目) 10.00 g,按照“2.2項”制備供試品溶液,在417 nm處測吸光度,于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h測定1次,計算得RSD=1.64%,枳椇子樣品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=8)

2.5.4 加樣回收實驗 精密稱取枳椇子藥材(20～40目)的干燥提取物18.64 mg加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至50 m L,于417 nm處測其吸光度:A(樣)= 0.312(c=10.04μg/m L),取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,于417 nm處測其吸光度:A(標(biāo))=0.363(c= 11.57μg/m L)。精密量取上述的枳椇子樣品溶液(10.04μg/m L)9份各1 m L,并將其分為3組,按 1∶0.8、1∶1、1∶2三個梯度分別加入上述的對照品溶液(11.57μg/m L),按照“2.2項”進(jìn)行顯色操作,于417 nm處測其吸光度A,計算平均回收率為96.92%,RSD=1.73%。表明誤差和操作過程中的損失在限度范圍內(nèi),該實驗方法比較可靠,結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.6 總黃酮超聲提取工藝的優(yōu)選

2.6.1 單因素實驗考察 ①原料目數(shù):精密稱取枳椇子藥材10.00 g,共5份,枳椇子原料目數(shù)為10～20目、20～40目、40～60目、60～80、80～100目,分別加入12倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液,于60℃、功率128 W下超聲提取60 min,按2.2項下方法制備供試品溶液,在417 nm處測吸光度,計算蘆丁提取率分別為:0.64、0.79、0.84、0.73、0.67 mg/g。故選擇過40～60目篩。②乙醇濃度:精密稱取(過40～60目篩)枳椇子藥材10.00 g,共5份,分別加入12倍量體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、95%的乙醇溶液,于60℃、超聲功率為128 W條件下超聲提取60 min,按2.2項下方法制備供試品溶液,在417 nm處測吸光度,計算蘆丁提取率分別為:0.70,0.72,0.74,0.69, 0.65 mg/g。應(yīng)選擇體積分?jǐn)?shù)70%乙醇。③料液比:精密稱取(過40～60目篩)枳椇子藥材10.00 g,共5份,分別加入6,8,10,12,14倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇,于60℃、超聲功率為128 W條件下超聲提取60 min,按2.2項下方法制備供試品溶液,在417 nm處測吸光度,計算蘆丁提取率分別為:0.64,0.68,0.70,0.81,0.73 mg/g。故選擇料液比為1∶12。④超聲溫度:精密稱取(過40～60目篩)枳椇子藥材10.00 g,共5份,分別加入12倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液,超聲功率為128W,分別于30、40、50、60、70℃下超聲提取60 min,按2.2項下方法制備供試品溶液,在417 nm處測吸光度,計算蘆丁提取率分別為:0.52,0.64,0.66,1.03,0.73 mg/g。故選擇超聲溫度為60℃。⑤超聲時間:精密稱取(過40～60目篩)枳椇子藥材10.00 g,共5份,分別加入12倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液,于60℃、128 W下,依次提取15、30、60、90、120 min,按2.2項下方法制備供試品溶液,在417 nm處測吸光度,計算蘆丁提取率分別為:0.53,0.69,0.84,0.73,072 mg/g。故選擇超聲時間60 min。⑥超聲功率:精密稱取(過40～60目篩)枳椇子藥材10.00 g,共5份,分別加入12倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液,于60℃下,超聲功率分別為64、96、128、160、200 W下提取60 min,按2.2項下方法制備供試品溶液,在417 nm處測吸光度,計算蘆丁提取率分別為:0.70、0.72、0.79、0.75、0.74 mg/g。故選擇超聲功率128 W。

2.6.2 超聲提取工藝的優(yōu)化 結(jié)合上述的單因素考察的結(jié)果及實際情況,選擇超聲溫度、超聲功率、料液比、原料目數(shù)4個因素,每個因素選取3個水平,如表5所示。以蘆丁含量為考察指標(biāo),按L9(34)進(jìn)行正交試驗,如表6所示。確定最佳提取工藝。方差分析結(jié)果如表7。

表5 正交實驗考察因素

表6 超聲提取正交實驗結(jié)果(n=9)

表7 方差分析結(jié)果(α=0.05)

按上述正交表的要求稱取干燥后的不同目數(shù)范圍的枳椇子藥材10.00 g,共9份,進(jìn)行實驗,按照“2.2項”配制供試品,于417 nm處測定蘆丁含量,結(jié)果見上表。超聲法提取蘆丁的工藝中超聲溫度對提取率的影響最為顯著,其影響程度大小順序為:A＞C＞D＞B,枳椇子中蘆丁最佳提取工藝為:A3B3C3D1,超聲溫度:70℃、超聲功率:160 W、料液比:1∶14、原料目數(shù):20～40目。

2.7 驗證實驗

稱取干燥后的枳椇子藥材顆粒(20～40目) 10.00 g,3份,按正交表中的最優(yōu)方案提取枳椇子中的蘆丁,按照“2.2項”配制供試品,于417 nm處測定蘆丁含量,三批結(jié)果見表8。

表8 樣品中蘆丁含量的測定

3 結(jié)論

我們實驗通過對多種影響因素的考察,得出提取枳椇子總黃酮的最佳提取工藝:P=160 W、T= 70℃、料∶液=1∶14、原料目數(shù)=20～40(目),體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液為提取溶劑,超聲1 h。按照“2.2項”配制供試品,于417 nm處測定蘆丁含量。測得含量為1.17 mg/g。

4 討論

黃酮類化合物蘆丁分子結(jié)構(gòu)中5'、3'、4'上有羥基,可用10 g/L AlCl3或Al(NO3)3溶液為顯色劑,由于枳椇子中蘆丁的含量較低,后者使用時要加入NaOH溶液(使蘆丁水解)測定的結(jié)果誤差較大,除此之外,硝酸根有氧化性。而用10 g/L AlCl3的乙醇溶液為顯色劑,干擾較小、顯色較靈敏、操作簡單,適用于定量分析。所以我們實驗用10 g/L AlCl3乙醇溶液為顯色劑。我們實驗中還考察了顯色時間、顯色劑的量對含量測定的影響,結(jié)果表明,加入顯色劑2 m L、20 min后,測量值基本不變。所以實驗中選用2 m L顯色劑,顯色20 min后測定其含量,結(jié)果較為準(zhǔn)確。我們實驗用的對照品為蘆丁,主要是由于蘆丁在黃酮類化合物中具有代表性,相對來說是價格便宜、容易得到的對照品;而蘆丁在枳椇子中的含量并不高,所以實驗中應(yīng)根據(jù)蘆丁的理化性質(zhì)嚴(yán)格控制實驗條件,盡可能的降低實驗誤差,從而得到較準(zhǔn)確的實驗結(jié)果。

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[責(zé)任編輯 李武營]

Optimizing the Ultrasonic Extracting method of Total Flavonoids from Hovenia dulcis Thunb by Orthogonal Design

TIAN Zhiyong，CHAI Zheng，XU Yafei，ZHAO Jingjing，LING Chunsheng*
（Phɑrmɑceuticɑl College of Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

Objectiveto optimize the extracting method of total flavonoids from TurnjujubeMethodsextracting total flavonoids from Turnjujube by ultrasonication extraction，considering the size of raw material，material-toliquid ratio，extraction temperature，extraction frequency as affecting factor by L9（34）orthogonal design；using rutimun as a reference substance，the rutimun in Turnjujube was determined by UV absorption wave at 417 nm.Resultsthe best extraction condition by ultrasonication extraction was to use 70%alcohol at 70℃for 1 hours with 160W，material-to-liquid ratio 20～40 mesh granule，and the resultant total flavonoids yield was 1.17mg/g，equation of regression：A=0.033 3C―0.022 3（r=0.999 3），the linearity of rutimun was obtained with in the range of 5.84～23.36μg/m L，the average recovery was 96.92%.Conclusionthe method is convenient and reliable，this result provide a suitable method research.

Hovenia dulcis Thunb；Total flavonoids；Rutin；Ultrasonic extraction

TQ460.6

A

1672―7606(2015)04―0247―05

2015-08-12

田智勇,(1968―),男,河南南陽人,博士,副教授,從事藥物化學(xué)教學(xué)與研究工作。

*通信作者:凌春生(1957―),男,河南周口人,碩士,副教授,碩士生導(dǎo)師,從事藥物制劑教學(xué)與的研究工作。