子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜窗口期模型的建立*

曹 芳，黃曉陽，葛素梅，許 科，陳 莉

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院生殖中心 213000)

·技術(shù)與方法·

子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜窗口期模型的建立*

曹 芳，黃曉陽，葛素梅，許 科，陳 莉△

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院生殖中心 213000)

目的研究子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)患者窗口期的子宮內(nèi)膜容受性，構(gòu)建EMs大鼠內(nèi)膜窗口期動(dòng)物模型。方法取性成熟SD大鼠22只，通過手術(shù)將SD大鼠自體子宮內(nèi)膜組織移植至同側(cè)腹壁及對(duì)側(cè)子宮系膜上，建立誘發(fā)型EMs大鼠動(dòng)物模型。術(shù)后4周隨機(jī)選取2只大鼠解剖觀察異位內(nèi)膜的生長情況，確定造模成功后，將EMs模型大鼠與雄鼠同籠交配，次日觀察陰栓，妊娠第5天剖腹觀察20只模型大鼠異位內(nèi)膜的存活情況，并對(duì)在位子宮內(nèi)膜及異位內(nèi)膜進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果20只妊娠第5天大鼠均有明顯的異位病灶，在腹壁及系膜上均呈小包塊樣生長，且與周圍組織有不同程度的粘連，光鏡下見異位子宮內(nèi)膜形態(tài)具有正常子宮內(nèi)膜基本組織結(jié)構(gòu)，EMs大鼠造模成功；所有EMs模型大鼠與雄鼠同籠交配次日均見陰栓，妊娠第5天大鼠非手術(shù)側(cè)子宮腔內(nèi)不同程度積液，在位及異位內(nèi)膜均處于分泌期。結(jié)論通過自體子宮內(nèi)膜移植法成功建立了EMs大鼠模型；EMs模型大鼠子宮內(nèi)膜處于胚胎著床窗口期，為研究EMs子宮內(nèi)膜容受性提供了動(dòng)物模型。

子宮內(nèi)膜異位癥；模型，動(dòng)物；大鼠

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是指子宮內(nèi)膜組織在子宮腔被覆內(nèi)膜及宮體基層以外的其他部位生長、浸潤，主要臨床表現(xiàn)為慢性盆腔痛及不孕。育齡婦女是主要患病人群，其中不孕癥患者中發(fā)病率高達(dá)40%～50%[1]。目前體外受精-胚胎移植技術(shù)(IVF-ET)是治療EMs合并不孕癥的有效手段。隨著現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)的廣泛發(fā)展，對(duì)EMs不孕患者行 IVF-ET時(shí)胚胎移植率可達(dá)85%，但妊娠率遠(yuǎn)低于單純輸卵管因素者[2]，表明EMs患者子宮內(nèi)膜可能存在影響胚胎著床的諸多不利因素。目前評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性的方法是在子宮內(nèi)膜窗口期對(duì)在位子宮內(nèi)膜進(jìn)行分子生物學(xué)標(biāo)志檢測(cè)，對(duì)子宮內(nèi)膜有一定的創(chuàng)傷，在人體中很難進(jìn)行對(duì)照研究。因此本研究首先建立了EMs大鼠子宮內(nèi)膜窗口期的動(dòng)物模型，為研究EMs患者圍著床期的子宮內(nèi)膜容受性的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠22只，鼠齡10周，雌性，未孕。體質(zhì)量230～260 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(蘇)2008-0004。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建 無菌條件下，氯胺酮麻醉，將大鼠固定在手術(shù)板上，腹部備皮，常規(guī)消毒，取下腹部正中切口約2.0～3.0 cm，膀胱背側(cè)找到右側(cè)子宮并游離，近端離右子宮角1.0 cm處結(jié)扎，遠(yuǎn)端離卵巢2.0 cm處結(jié)扎，并結(jié)扎兩端的子宮系膜血管，切除約1.5 cm長的一段子宮，迅速置于盛有37 ℃生理鹽水的培養(yǎng)皿中，縱向切開子宮腔，剝?nèi){膜層，取約4 mm×5 mm大小的子宮內(nèi)膜及肌層組織兩塊。用1號(hào)不吸收線分別縫至右側(cè)內(nèi)腹壁膜和左側(cè)子宮系膜處，內(nèi)膜面朝向腹腔，整理脂肪，逐層連續(xù)縫合腹部切口，常規(guī)關(guān)腹，肌內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染，待其自然蘇醒，常規(guī)喂養(yǎng)。手術(shù)4周后，隨機(jī)取2只大鼠解剖觀察病灶生長的情況。

1.2.2 妊娠雌鼠模型構(gòu)建 采用雌雄合籠交配法,建立妊娠雌鼠模型。將其余20只模型大鼠與雄鼠于當(dāng)日18:00合籠飼養(yǎng)，次日雌雄分籠,抓取雌鼠觀察陰道口有無陰栓,發(fā)現(xiàn)陰栓證明交配成功,受孕妊振,記錄為第1天,妊娠后與雄鼠分開飼養(yǎng)。

1.2.3 觀察指標(biāo) 大體觀察:妊娠第5天，將大鼠脊椎脫臼處死，常規(guī)開腹，觀察模型大鼠的異位內(nèi)膜生長情況，病灶大小，及與周圍組織的粘連程度。組織形態(tài)學(xué)觀察：處死大鼠后立即取出模型組和假手術(shù)組大鼠卵巢，右側(cè)腹壁異位內(nèi)膜包塊，左側(cè)子宮系膜異位內(nèi)膜包塊及左側(cè)未行手術(shù)的在位子宮，立即置于4%甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，HE染色，顯微鏡下觀察在位、異位內(nèi)膜及正常大鼠子宮內(nèi)膜的組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及差異。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 手術(shù)4周后，隨機(jī)選取解剖的2只大鼠病灶生長良好，形成包塊，與周圍組織粘連，EMs大鼠造模完成。20只EMs模型大鼠與雄鼠同籠次日，陰道口均發(fā)現(xiàn)陰栓,妊娠第5天，常規(guī)開腹，肉眼觀移植物生長大多良好，腹壁及系膜上異位內(nèi)膜形成大小不等的包塊，呈隆起透亮的小囊狀，內(nèi)部充滿透明液體，表面血管清晰可見(圖1)。所有異位病灶都與周圍組織有不同程度的粘連，尤其與腹壁、子宮腸管粘連嚴(yán)重，難以分離。大部分病灶被子宮旁韌帶的脂肪包裹，EMs模型大鼠非手術(shù)側(cè)子宮腔內(nèi)充滿液體。

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 低倍鏡下見移植物形成的囊壁由內(nèi)向外分別為上皮細(xì)胞層、間質(zhì)細(xì)胞層及少量纖維結(jié)締組織，可見數(shù)個(gè)腺腔樣結(jié)構(gòu)。腹壁上的異位內(nèi)膜包塊生長在皮下筋膜層與腹肌之間，沒有明顯的外膜，僅有一些纖維組織包裹；系膜上的異位內(nèi)膜，腔內(nèi)面的上皮及周圍間質(zhì)與在位子宮內(nèi)膜相比變薄。異位內(nèi)膜腺腔明顯擴(kuò)張，形成了“鋸齒狀”結(jié)構(gòu)，見圖2。高倍鏡下見腹壁及系膜上的異位內(nèi)膜包塊中的肌層變薄甚至消失。在位子宮內(nèi)膜下層腺體豐富，且腺上皮細(xì)胞均為柱狀或立方狀，異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈低柱狀，增生明顯，部分腺腔內(nèi)有分泌物和炎細(xì)胞存在。在位及異位子宮內(nèi)膜腺體某些細(xì)胞出現(xiàn)核下空泡，處于分泌期，見圖2。

A：異位內(nèi)膜在腹壁形成包塊;B:異位內(nèi)膜在子宮系膜形成包塊，左側(cè)子宮腔內(nèi)充滿液體。

圖1 子宮異位內(nèi)膜包塊

A:大鼠子宮內(nèi)膜(100×)；B:大鼠子宮內(nèi)膜(400×)。C:腹壁上異位子宮內(nèi)膜(100×);D:腹壁上異位子宮內(nèi)膜(400×)。E:卵巢上異位子宮內(nèi)膜(100×)；F:卵巢上異位子宮內(nèi)膜(400×)。G:系膜上異位的子宮內(nèi)膜(100×);H:系膜上異位的子宮內(nèi)膜(400×)。

圖2 子宮內(nèi)膜HE染色結(jié)果

3 討 論

IVF-ET是治療EMs合并不孕癥的有效手段，胚胎的質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性是成功著床的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)[3]。子宮內(nèi)膜容受性是指母體子宮內(nèi)膜在特定時(shí)期內(nèi)對(duì)胚胎的接受能力，即允許胚胎黏附直至植入的特定階段。目前EMs對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響尚存在爭(zhēng)議[4-6]，由于實(shí)際操作及倫理學(xué)方面的約束，很難在人體中進(jìn)行EMs的對(duì)照研究，EMs動(dòng)物模型是研究EMs發(fā)生發(fā)展機(jī)制的主要途徑。大鼠生命力較強(qiáng)，激素水平較高，性周期短且規(guī)律，因此選擇大鼠造模對(duì)移植物的成活和移植后的觀察均較為有利。

自體內(nèi)膜移植建立EMs大鼠模型的理論依據(jù)主要為子宮內(nèi)膜種植學(xué)說，成功移植的前提是內(nèi)膜的完整性。部分學(xué)者建立大鼠誘發(fā)性EMs模型時(shí)，將大鼠子宮內(nèi)膜與肌層分離，只種植內(nèi)膜組織到腹腔[7-8]。Uchiide等[9]報(bào)道將大鼠完整的子宮片段縱形切開后移植到腹腔內(nèi)，子宮內(nèi)膜組織能成活，其生物學(xué)行為接近人類EMs病灶。為保證子宮內(nèi)膜基底層完整性，本研究將大鼠右側(cè)完整的子宮片段縱形切開后，取內(nèi)膜和肌層組織同時(shí)進(jìn)行移植。

EMs的發(fā)生發(fā)展是異位子宮內(nèi)膜經(jīng)黏附、侵襲及新血管形成等多階段逐步演變的過程，異位內(nèi)膜本身及其周圍組織新生血供的建立是子宮內(nèi)膜異位種植存活的基礎(chǔ)條件[10-13]。因大鼠子宮系膜薄，脂肪多，在系膜上縫合子宮內(nèi)膜組織出血多，對(duì)技術(shù)要求高，常用內(nèi)膜移植到腹壁的方法建立大鼠EMs模型。由于子宮系膜上血供非常豐富，本研究將子宮內(nèi)膜不僅移植到同側(cè)腹腔，同時(shí)在對(duì)側(cè)系膜上移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩處異位內(nèi)膜均生長良好，呈透亮的小囊狀，內(nèi)部充滿積液，表面血管可見。與以往將子宮內(nèi)膜片放入腹壁肌層與皮下筋膜之間的方法相比，帶有肌層組織的內(nèi)膜易縫合固定，且內(nèi)膜不易破壞，鏡下見肌層及內(nèi)膜基底層均保持完整，異位內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)近似于正常子宮內(nèi)膜基本結(jié)構(gòu)，但是異位內(nèi)膜包塊中的肌層較薄，與在位子宮及正常子宮的肌層相比血管減少，有不同程度的纖維化。大體觀察所有異位病灶與腹膜、腸管等周圍組織有著不同程度的粘連，甚至難以分離，和臨床上患者病灶多與周圍組織粘連相符，大鼠EMs模型造模成功。

在本研究中發(fā)現(xiàn)大部分大鼠子宮系膜異位包塊較腹壁上大，與周圍組織粘連較嚴(yán)重，鏡下觀察系膜上的異位內(nèi)膜腺體也更豐富，可能與系膜上異位內(nèi)膜得到的血供營養(yǎng)更多有關(guān)。通過將術(shù)后4周造模成功的EMs模型大鼠與雄鼠同籠交配，妊娠第5天大鼠子宮內(nèi)膜腺體豐富，腺腔擴(kuò)張明顯，處于窗口期，此時(shí)子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)最大程度接收胚胎著床的能力，為后續(xù)研究EMs患者子宮內(nèi)膜容受性對(duì)胚胎著床的影響提供了有價(jià)值的基礎(chǔ)模型。

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Establishment of the endometriosis rat model in intimal window period*

CaoFang，HuangXiaoyang，GeSumei，XuKe，ChenLi△

(ReproductiveCenter,ChangzhouWomenandChildrenHealthHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity，Changzhou，Jiangsu213000，China)

ObjectiveTo research the endometrial receptivity by established the endometriosis rat model in intimal window period.MethodsThe autologous endometrial tissues of 22 sexually mature SD rats were transplanted into the homonymy abdominal wall and offside uterine mesometrium.After four weeks，we randomly dissected two rats and observed the growth of etopic endometrium.The EMs rats were mated with male rats in the same cage and vaginal plug was observed in the next day.The histomorphology of eutopic and ectopic endometrial was observed in the fifth day of pregnancy.ResultsEctopic endometrium was grown in the abdominal wall and mesometrium，which formed a small bulge cystic mass in 20 rats.All foci was showed adhesion to the surrounding tissues in a different extent.In the light microscope，the morphology of ectopic endometrial was as the same as nomal endometrium.The establishment of the endometriosis rat mode is successful.Vaginal plug was positive the next day.Nonoperative side uterine was full of fluid in the fifth day of pregnancy.Eutopic and ectopic endometrium were in the secretory phase..ConclusionIt is a successful method to establish a rat model of endometriosis by autotransplantion of endometrium.The endometrium of EMs model rats is in embryo implantation window period，and it provides a convenient model for studying endometrial receptivity.

endometriosis;model,animal;rat

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.019

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013NJMU213)

：曹芳(1982-)，碩士，助理研究員，主要從事生殖醫(yī)學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:shaoshan686@sina.com。

R711.71

A

1671-8348(2015)27-3805-03

2015-03-20

2015-05-24)