新疆婦女宮頸病變組織miR-146a/133b的表達(dá)及臨床意義*

馬 麗，馬彩玲△，盧 暢，陳艷霞

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科/新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，烏魯木齊 830054)

論著·臨床研究

新疆婦女宮頸病變組織miR-146a/133b的表達(dá)及臨床意義*

馬 麗1，馬彩玲1△，盧 暢2，陳艷霞1

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科/新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，烏魯木齊 830054)

目的探討miR-146a/133b在新疆維、漢民族宮頸組織中的差異性表達(dá)及其臨床意義。方法采用RT-qPCR法檢測miR-146a/133b在石蠟包埋的宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量，分析其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義。結(jié)果與宮頸炎組織比，CIN和宮頸癌組織miR-146a/133b的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且隨宮頸病變的加重，兩者的表達(dá)水平逐漸升高，宮頸癌組織中維、漢民族miR-146a存在差異性表達(dá)(P<0.05)。結(jié)婚年齡小于20歲、腫瘤直徑大于或等于4 cm、有HPV感染的宮頸癌組織中miR-146a/133b呈高表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論miR-146a/133b參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，可能成為宮頸癌病情預(yù)測及評(píng)估新的分子標(biāo)志物。

宮頸腫瘤；維吾爾族；miR-146a；miR-133b；乳頭狀瘤病毒

宮頸癌是僅次于乳腺癌，嚴(yán)重威脅著女性健康的惡性腫瘤。新疆維吾爾族婦女宮頸癌的現(xiàn)狀是發(fā)病率高(459/10萬～527/10萬)，晚期宮頸癌比例高及病死率高(15.78/10萬)[1-2 ]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是一個(gè)多階段、多基因參與的復(fù)雜過程。miRNA是約19～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過誘導(dǎo)降解或抑制靶mRNA的翻譯，參與細(xì)胞增殖[3-4]、分化[5]、腫瘤生長[6]和轉(zhuǎn)移[7]等生命活動(dòng)。本研究旨在探討miR-146a/133b在新疆維、漢婦女宮頸組織中的差異性表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 樣本取自2010年9月至2013年9月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科保存的維吾爾族及漢族宮頸石蠟組織共180例，包括宮頸炎(對(duì)照)35例，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ級(jí)31例，CINⅡ級(jí)37例，CINⅢ級(jí)41例，宮頸癌36例。各組內(nèi)維吾爾族、漢族年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器 miRNeasy FFPE Kit(德國QIAGEN公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR Mix(美國Thermo公司)，miR-146a、miR-133b特異RT引物、PCR引物及U6 PCR引物(上海生工公司)。核酸蛋白測定儀Nanodrop 1000(Thermo Scientific，美國)，iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detecter System(BIO RAD，美國)，PCR儀C1000 Thermal Cycler(BIO RAD，美國)，凝膠成像儀Universal Hood Ⅱ(BIO RAD，美國)。

1.3 方法

1.3.1 提取總RNA 遵循RNeasy FFPE Kit說明，經(jīng)二甲苯脫蠟、蛋白酶K消化組織、DNeasyⅠ去除DNA、離心柱吸附RNA、無RNA酶水洗脫，得到總RNA。檢測RNA溶液吸光度，計(jì)算RNA濃度和純度，1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：包括總RNA 200 ng、Buffer 4.0 μL、dNTP 2.0 μL、RNase Inhibitor 1.0 μL、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL、逆轉(zhuǎn)錄引物1.0 μL，加Water至20.0 μL。反應(yīng)條件：42.0 ℃ 60 min，70.0 ℃ 5 min，-20.0 ℃保存cDNA。

表1 引物序列

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 熒光定量PCR反應(yīng)體系25.0 μL：包括2×SYBR Green I Master mix 12.5 μL，正向引物1.0 μL，反向引物1.0 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3.0 μL，Water 7.5 μL。反應(yīng)條件：95.0 ℃ 3 min，95.0 ℃ 10 s，52.8 ℃(miR-146a)/59.2 ℃(miR-133b)/60.0 ℃(U6)30 s 40個(gè)循環(huán)，55.0～95.0 ℃ 10 s 81個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，設(shè)陰性對(duì)照。記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以n=2-△△Ct表示miR-146a/133b的表達(dá)水平，計(jì)算△△Ct=(CtmiR-146a/133b-CtU6)宮頸鱗癌組-(平均CtmiR-146a/133b-平均CtU6)宮頸炎組。見表1。

2 結(jié) 果

2.1 miR-146a/133b在宮頸組織中的表達(dá)分析 在宮頸炎、CIN和宮頸癌3組中隨宮頸病變的加重，miR-146a/133b的表達(dá)水平逐漸升高，CIN和宮頸癌組的表達(dá)水平顯著高于宮頸炎組(P<0.05)。宮頸癌組中維、漢民族miR-146a的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PmiR-146a=0.038，PmiR-133b=0.050)。見表2、3。

表2 miR-146a實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果分析

2.2 miR-146a/133b的表達(dá)量與宮頸癌臨床病理因素的相關(guān)性分析 結(jié)婚年齡小于20歲、產(chǎn)次大于或等于2次、腫瘤直徑大于或等于4 cm的宮頸癌組織中miR-146a的表達(dá)水平顯著高于結(jié)婚年齡大于20歲、生產(chǎn)0～1次、腫瘤直徑小于4 cm的宮頸癌組織中miR-146a表達(dá)(P<0.05)。結(jié)婚年齡小于20歲、腫瘤直徑大于或等于4 cm的宮頸癌組織中miR-133b的表達(dá)水平顯著高于結(jié)婚年齡大于或等于20歲、腫瘤直徑小于4 cm的宮頸癌組織中miR-133b表達(dá)(P<0.05)。有高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染的宮頸癌組織中，miR-146a/133b的表達(dá)水平顯著高于無HPV感染者。見表4。

表3 miR-133b實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果分析

表4 miR-146a/133b的表達(dá)量與宮頸癌臨床特征的相關(guān)性分析

續(xù)表4 miR-146a/133b的表達(dá)量與宮頸癌臨床特征的相關(guān)性分析

3 討 論

miR-146a基因位于5號(hào)染色體長臂3區(qū)4帶(5q34)，其在宮頸癌組織中表達(dá)增高，可能起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用[8]。miR-133b基因位于6號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶2號(hào)次亞帶(6p12.2)，通過靶向作用于轉(zhuǎn)錄因子Sp1抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[9]；負(fù)向調(diào)節(jié)CXCR4促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)宮頸病變組織中miR-146a/133b的表達(dá)量顯著高于宮頸炎組，且宮頸癌組中維吾爾族miR-146a的表達(dá)量顯著高于漢族，提示miR-146a的表達(dá)可能存在民族差異。miR-146a/133b在結(jié)婚年齡、產(chǎn)次方面存在差異表達(dá)，過早的性生活，早年經(jīng)陰道分娩、多次陰道分娩對(duì)宮頸的創(chuàng)傷及妊娠對(duì)內(nèi)分泌的改變都是宮頸發(fā)生病變的危險(xiǎn)因素。有研究提出miR-146a在結(jié)腸癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，與腫瘤增殖情況相一致，且表達(dá)量與患者腫瘤大小密切相關(guān)[11]。腫瘤直徑是宮頸癌臨床分期的重要指標(biāo)之一，其直接反應(yīng)了宮頸病變的嚴(yán)重程度。本研究中miR-146a/133b的表達(dá)量與腫瘤直徑顯著相關(guān)，但未顯示與年齡、初潮年齡、孕次、病理類型、病理分級(jí)、肌層浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、宮旁轉(zhuǎn)移和淋巴血管間隙浸潤有關(guān)。

持續(xù)的高危型HPV感染是宮頸癌的危險(xiǎn)因素。有報(bào)道提出轉(zhuǎn)染HPV16 E5基因后HaCaT細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)顯著升高[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)HPV16 E6使SiHa細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-16E6的C33A細(xì)胞中的miR-92上調(diào)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲[13]。Zheng等[14]發(fā)現(xiàn)高危型HPV E6/E7與轉(zhuǎn)錄因子如E2F、c-Myc等的相互作用促進(jìn)了miRNA的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在HPV陽性的宮頸癌組織中高表達(dá)，與Gocze等[15]的結(jié)果一致，由此推測miR-146a和HPV對(duì)宮頸癌的發(fā)病起協(xié)同作用。

綜上所述，在宮頸病變組織中miR-146a/133b的表達(dá)顯著高于宮頸炎組，且隨宮頸病變的進(jìn)展而表達(dá)上調(diào)，表達(dá)水平與結(jié)婚年齡、產(chǎn)次、腫瘤直徑、是否感染HPV相關(guān)，miR-146a的表達(dá)可能存在民族差異。miR-146a/133b可能成為宮頸癌病情預(yù)測及評(píng)估的新的分子標(biāo)志物。

[1]瑪依努爾·尼牙孜，李麗，陳鳳，等．新疆維吾爾族女性人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌相關(guān)性的流行病學(xué)調(diào)查[J]．臨床腫瘤學(xué)雜志，2011，16(4)：322-325．

[2]姜淑清，王濤，士送愛，等．新疆策勒縣宮頸癌的流行病學(xué)調(diào)查研究[J]．中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2006，20(5)：379-381．

[3]Viticchiè G，Lena AM，Latina A，et al.MiR-203 controls proliferation，migration and invasive potential of prostate cancer cell lines[J].Cell Cycle，2011，10(7):1121-1131.

[4]Shatseva T，Lee DY，Deng Z，et al.MicroRNA miR-199a-3p regulates cell proliferation and survival by targeting caveolin-2[J].J Cell Sci，2011，124(Pt 16):2826-2836.

[5]Kawasaki H，Taira K.Retraction:hes1 is a target of microRNA-23 during retinoic-acid-induced neuronal differentiation of NT2 cells[J].Nature，2003，426(6962):100.

[6]Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(7):2257-2261.

[7]Huang Q，Gumireddy K，Schrier M，et al.The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis[J].Nat Cell Biol，2008，10(2):202-210.

[8]Wang X，Tang S，Le SY，et al.Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth[J].PLoS One，2008，3(7):e2557.

[9]Qiu T，Zhou X，Wang J，et al.MiR-145，miR-133a and miR-133b inhibit proliferation，migration，invasion and cell cycle progression via targeting transcription factor Sp1 in gastric cancer[J].FEBS Lett，2014，588(7):1168-1177.

[10]Duan FT，Qian F，F(xiàn)ang K，et al.miR-133b，a muscle-specific microRNA，is a novel prognostic marker that participates in the progression of human colorectal cancer via regulation of CXCR4 expression[J].Mol Cancer，2013，12:164.

[11]曾長青，黃良祥，鄭羽，等．miR-146a在結(jié)腸癌中的表達(dá)及意義[J]．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34(3)：396-400．

[12]GrecoD，KiviN，QianK，etal.Humanpapillomavirus 16 E5 modulates the expression of host microRNAs[J].PLoS One，2011，6(7):e21646.

[13]Yu Y，Zhang Y，Zhang S.MicroRNA-92 regulates cervical tumorigenesis and its expression is upregulated by human papillomavirus-16 E6 in cervical cancer cells[J].Oncol Lett，2013，6(2):468-474.

[14]Zheng ZM，Wang XH.Regulation of cellular miRNA expression by human papillomaviruses[J].Biochim et Biophys Acta，2011，1809(11/12):668-677.

[15]Gocze K，Gombos K，Juhasz K，et al.Unique microRNA expression profiles in cervical cancer[J].Anticancer Res，2013，33(6):2561-2567.

The expression and clinical significance of miR-146a/133b in Xinjiang women with cervical lesion*

MaLi1，MaCailing1△，LuChang2，ChenYanxia1

(1.DepartmentofGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity/StateKeyLabIncubationBaseofXinjiangMajorDiseasesResearch，Urumqi,Xinjiang830054，China；2.DepartmentofPathology，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi，Xinjiang830054，China)

ObjectiveTo explore the different expression and clinical significance of miR-146a/133b in cervical tissue in uyghur and Han women in Xinjiang．Methods The relative expression of miR-146a/133b in paraffin embedding tissues of cervicitis，CIN and cervical cancer was detected by the RT-qPCR.And analyzed the clinical significance in the development of cervical cancer．Results Compared with cervicitis，the expression of miR-146a/133b increased significantly in CIN and cervical cancer(P<0.05)．With the cervical lesion was aggravating，the expression level increased．In cervical cancer tissue，the expression of miR-146a were different between Uyghur and Han women(P<0.05)．Marriage age<20 years old,tumor diameter≥4 cm,with HPV infection in cervical cancer tissue,miR-146a/133b had high expression (P<0.05).ConclusionMiR-146a/133b are involved in incidence and development of cervical cancer，they may become new prognostic and evaluating molecular markers in cervical cancer．

uterine cervical neoplasms；uyghur；miR-146a；miR-133b；papilloma virus

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.007

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160278)；新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLIB-XJMDR-2012-5)。

：馬麗(1989-)，碩士，主要從事宮頸惡性腫瘤研究?！?/p>

，E-mail:hymcl@sina.com。

R737.3

A

1671-8348(2015)27-3765-03

2015-03-010

2015-05-16)