PI3K/Akt信號通路在嚴重燒傷大鼠血清誘導BMSCs遷移中的作用*

李茂華，滕 苗，果 磊

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院燒傷整形外科 400016)

論著·基礎(chǔ)研究

PI3K/Akt信號通路在嚴重燒傷大鼠血清誘導BMSCs遷移中的作用*

李茂華，滕 苗，果 磊△

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院燒傷整形外科 400016)

目的探討嚴重燒傷大鼠血清對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)遷移的影響及作用機制。方法建立嚴重燒傷大鼠模型，并制備嚴重燒傷大鼠血清。實驗分為正常培養(yǎng)組(含10%胎牛血清，C組)、燒傷血清組(含10%燒傷大鼠血清，B組)、燒傷血清+阻斷劑組(含10%燒傷大鼠血清+終濃度為10 μmol/L的PI3K信號通路抑制劑LY294002，B+LY組)，MTT法檢測各組細胞活性；Transwell小室檢測各組細胞遷移情況；Western blot檢測各組細胞p-Akt、Akt蛋白表達；免疫熒光檢測各組細胞微管結(jié)構(gòu)。結(jié)果與C組比較，B組燒傷血清處理24 h后，BMSCs細胞活性增高(P<0.01)，p-Akt水平升高(P<0.05)，細胞微管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)解聚，遷移數(shù)量增高(P<0.001)；加入抑制劑后，與B組比較，B+LY組BMSCs細胞活性降低(P<0.01)，遷移數(shù)量降低(P<0.001)，p-Akt水平降低(P<0.05)，細胞微管結(jié)構(gòu)變化不明顯。結(jié)論嚴重燒傷大鼠血清可促進BMSCs細胞遷移，可能與燒傷血清中細胞因子激活PI3K/Akt信號通路相關(guān)，進而引起B(yǎng)MSCs細胞微管結(jié)構(gòu)變化，促進BMSCs遷移。

燒傷；間質(zhì)干細胞；微管；遷移；PI3K/Akt；信號通路

嚴重燒傷有別于一般創(chuàng)傷，損傷組織。以及免疫防御系統(tǒng)可分泌大量炎癥介質(zhì)、細胞因子和燒傷毒素。燒傷后，在毛細血管通透性增加導致全身循環(huán)血量下降以前，即可發(fā)生心肌缺血缺氧損害和心功能減退，從而誘發(fā)或加重燒傷休克，即“休克心現(xiàn)象”[1]，加重多器官損害，是導致患者死亡的主要原因。燒傷后各臟器結(jié)構(gòu)、功能損傷修復，以及燒傷創(chuàng)面的愈合一直是臨床救治的難點。

間充質(zhì)干細胞(MSCs)是來源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的一類成體干細胞，其取材簡便、來源廣泛，具有自我更新、快速增殖及多向分化潛能，且能分泌多種細胞因子，調(diào)節(jié)微環(huán)境，能夠向損傷組織遷移，分泌細胞因子減緩全身及局部炎癥，減少受損組織細胞的凋亡，促進血管生成，激活內(nèi)源性干細胞，減輕器官組織功能紊亂，提高動物模型的生存率[2]，為燒傷臨床治療開拓新的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)將載有綠色熒光蛋白(GFP)的人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSCs)移植在燒傷小鼠創(chuàng)面，hBMSCs可向血管內(nèi)皮樣細胞分化，促進燒傷創(chuàng)面愈合[3]。但嚴重燒傷時，損傷組織微環(huán)境對MSCs有何種影響，目前尚不明確。呂根法等[4]研究發(fā)現(xiàn)燒傷血清作用下的心肌細胞存在PI3K/Akt和p38信號通路的交叉對話，并可能對心肌細胞產(chǎn)生調(diào)控作用。PI3K/Akt通路是膜受體信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導的重要途徑，可被細胞因子和理化因素激活，具有調(diào)控物質(zhì)代謝、基因表達、細胞遷移、增殖和存活等多種生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)在BMSCs向膠質(zhì)瘤的定向遷移過程中，PI3K信號通路發(fā)揮了作用[5]。嚴重燒傷血清能否激活PI3K/Akt通路，促進BMSCs向損傷組織、細胞遷移，進而促進損傷組織修復、創(chuàng)面愈合，目前尚未見文獻報道。

本實驗擬采用嚴重燒傷大鼠血清模擬嚴重燒傷微環(huán)境培養(yǎng)BMSCs，觀察燒傷血清對BMSCs活性、遷移的影響，探討PI3K/Akt通路在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器 SD大鼠BMSCs細胞株及BMSCs細胞完全培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)；胎牛血清(FBS，Gibco,USA)；MTT(碧云天生物技術(shù)研究所)；α-tubulin單克隆抗體(Proteintech,USA)；β-actin單克隆抗體(Proteintech,USA)；Akt單克隆抗體(Abcam,USA)；p-Akt單克隆抗體(Cell Signaling,USA)；山羊抗兔IgG二抗(Proteintech,USA)；FITC標記熒光二抗(Proteintech,USA)；LY294002(Santa Cruz,USA)；HEPA Class 100型CO2孵箱(Thermo，USA)；M88自動酶標儀(Thermo，USA)；Fusion FX7凝膠成像分析系統(tǒng)(VILBER lour MAT，F(xiàn)rench)，激光共聚焦(LSM 510 META，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 嚴重燒傷大鼠血清的制備 取體質(zhì)量200～280 g 的雄性SD 大鼠30 只(第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)，參考文獻[6]，制成40%TBSA的Ⅲ度燙傷模型。傷后 6 h在無菌操作下抽取腹主動脈血，室溫凝血，4 ℃過夜，使血凝塊盡量收縮。吸出血清，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清液，56 ℃加熱30 min 以滅活補體。上清液分裝，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗分組 取第3代生長狀態(tài)良好BMSCs，實驗隨機分為：正常培養(yǎng)組(C組)、燒傷血清組(B組)、燒傷血清+阻斷劑組(B+LY組)，待細胞融合達80%～90%時，加入無血清BMSCs細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓同化24 h，C組加入含10%胎牛血清(FBS)的BMSCs培養(yǎng)基，B組加入含10%燒傷大鼠血清的BMSCs培養(yǎng)基，B+LY組加入抑制終濃度為10 μmol/L的PI3K信號通路抑制劑LY294002+含10%燒傷大鼠血清的BMSCs培養(yǎng)基，作用24 h后進行相應檢測。

1.2.3 MTT法檢測BMSCs細胞活性 按1.2.2分組處理細胞，以2×105個/200 μL接種于96孔板，每組6個復孔，24 h后吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入150 μL甲基亞砜(DMSO)振蕩10 min，用自動酶標儀在570 nm處測定吸光值(A)，本實驗重復3次。

1.2.4 Transwell小室檢測細胞遷移 按1.2.2分組處理細胞，調(diào)整細胞濃度為4×104個/400 μL接種于Transwell小室上室中，C組Transwell小室下室加入600 μL含10%FBS的BMSCs細胞培養(yǎng)基，B組下室內(nèi)加入600 μL含10%燒傷大鼠血清的BMSCs細胞培養(yǎng)基，B+LY組在Transwell上室加入抑制終濃度為10 μmol/L的PI3K信號通路抑制劑LY294002，下室內(nèi)加入600 μL含10%燒傷大鼠血清的BMSCs細胞培養(yǎng)基，放入 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后取出Transwell小室，將上室培養(yǎng)基吸盡，用棉簽擦拭上室中的細胞，PBS清洗1次，并將小室置于4%多聚甲醛中室溫固定20 min，PBS清洗1次，結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗，顯微鏡下觀察小室半透膜下表面細胞并計數(shù)，每組按照上下左右中隨機選取5個視野，取5個視野細胞總數(shù)的均數(shù)進行統(tǒng)計分析，以遷移至小室半透膜下表面細胞個數(shù)的均數(shù)表示細胞的遷移能力。

1.2.5 Western blot檢測Akt、p-Akt蛋白的表達 按1.2.2分組處理細胞，收集細胞進行離心沉淀，按總蛋白提取試劑盒說明書提供的方法提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取40 μg/孔蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，5%BSA室溫封閉2 h，分別加入Akt(1∶500)、p-Akt(1∶500)抗體，4 ℃過夜；次日，TBST洗膜3次，加入1∶4 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h，化學發(fā)光、顯影，凝膠成像儀獲取圖像，Image J 軟件進行灰度分析，結(jié)果以p-Akt與Akt灰度值比值表示。本實驗重復3次。

1.2.6 免疫熒光染色觀察細胞微管結(jié)構(gòu) 按1.2.2分組處理細胞，以1×103個/mL密度接種于無菌玻片的24孔板中，24 h后，用4%的多聚甲醛室溫固定細胞爬片30 min，0.1% Triton X-100破膜20 min，5%山羊血清37 ℃封閉30 min，滴加兔抗大鼠的α-tubulin單克隆抗體(1∶100)，4 ℃過夜；滴加熒光二抗(1∶100)，37 ℃避光孵育1 h，滴加DAPI(1∶100)，37 ℃避光孵育5 min，抗熒光淬滅劑封片，每步操作前均要用PBS洗3遍，每遍5 min，但血清封閉后不洗，直接加一抗。激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測BMSCs活性 C組、B組、B+LY組細胞活性分別為1.76±0.09、1.93±0.06、1.57±0.2(F=9.10，P<0.01)。與C組比較，B組細胞增多，活性增高(t=3.50，P<0.01)；加入抑制劑后，B+LY組細胞活性較B組降低(t=3.80，P<0.01)。

A：C組；B：B組；C:B+LY組。

圖1 3組BMSCs細胞遷移情況(×100)

2.2 Transwell小室檢測細胞遷移 與C組比較，B組每100倍視野下遷移至小室半透膜下表面的細胞增多(t=7.14，P<0.01)，B+LY組遷移至小室半透膜下表面的細胞數(shù)量較B組明顯減少(t=9.13，P<0.01)。見圖1、表1。

表1 3組BMSCs細胞遷移數(shù)比較個)

2.3 Western blot檢測Akt、p-Akt蛋白的表達 24 h后，各組p-Akt/Akt比值分別為0.42±0.04、0.95±0.02、0.63±0.02，B組細胞Akt磷酸化水平較C組增高(t=20.29,P<0.01)，加入抑制劑后，B+LY組細胞Akt磷酸化水平較B組降低(t=16.68,P<0.01)，見圖2。

2.4 免疫熒光染色觀察細胞微管結(jié)構(gòu) C組細胞微管以胞核為中心向四周呈放射狀分布，B組細胞微管出現(xiàn)解裂增多，排列紊亂，B+LY組微管結(jié)構(gòu)與C組相似，見圖3。

a：P<0.05,與C組比較;b:P<0.05，與B+LY組比較。

圖2 3組BMSCs細胞Akt活化狀態(tài)

A：C組；B：B組；C:B+LY組。

圖3 3組BMSCs細胞微管的分布及形態(tài)變化

3 討 論

嚴重燒傷后引起的臟器損害和功能下降，特別是燒傷合并多器官功能障礙綜合征，是導致患者死亡的主要原因，燒傷后各臟器結(jié)構(gòu)和功能損傷的確切機制仍不完全明了，嚴重燒傷一直是困擾醫(yī)學界的難題。近年，干細胞與組織工程學的飛速發(fā)展，為大面積燒(創(chuàng))傷的修復開辟了新的途徑。目前已有研究表明MSCs可促進燒傷創(chuàng)面愈合，胡克蘇等[7]將人臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)移植修復燒傷皮膚，研究發(fā)現(xiàn)UC-MSCs移植治療可能通過抑制皮損局部炎性反應，減少淋巴細胞的浸潤，促進血管的再生和成纖維細胞的生長促進損傷皮膚的修復。此外，研究將BMSCs移植到嚴重燒傷大鼠體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)移植后BMSCs能夠向受損肝組織定植，對燒傷引起的肝損傷有明顯的修復作用，其機制可能與抑制細胞凋亡有關(guān)[8]。MSCs移植后，其定向遷移至受損部位是其發(fā)揮作用的前提，損傷組織分泌細胞黏附因子、趨化因子和生長因子等相互調(diào)節(jié)，可影響MSCs的黏附、遷移。燒傷后患者血清中含有集落刺激因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素生長因子-1(IGF-1)、表皮生長因子(EGF)等。嚴重燒傷患者血清可顯著刺激人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSCs)快速增殖，不引起細胞凋亡，能減少細胞衰老[9]。但嚴重燒傷血清能否促進MSCs遷移尚不清楚。

PI3K/Akt信號通路最早被發(fā)現(xiàn)在胰島素刺激及其應答的調(diào)控中起重要作用。隨著研究的深入和下游底物的不斷發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路作為一條非常重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路被人們所認識。Akt是PI3K信號通路的直接下游效應分子，PI3K可被PDGF、IGF、胰島素、成纖維生長因子(FGF)、重組人EGF、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)等細胞因子與其受體結(jié)合而激活，活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad[10]、mTOR[11]、Caspase9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27 Kip1等，進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡，以及遷移等[12]。研究發(fā)現(xiàn)，用PI3K/Akt抑制劑LY294002和Wortmannin可減弱SDF-1α和bFGF誘導的MSCs遷移[13-14]。

本實驗以嚴重燒傷血清處理BMSCs模擬體內(nèi)嚴重燒傷環(huán)境，實驗結(jié)果表明，燒傷血清處理24 h后，BMSCs細胞活力、細胞遷移數(shù)量較正常培養(yǎng)組增高，且p-Akt水平增高，表明嚴重燒傷血清可促進BMSCs細胞遷移，且可激活PI3K/Akt信號通路。為進一步證實燒傷血清誘導PI3K/Akt信號通路活化是否參與BMSCs細胞的遷移，加入PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002后，BMSCs細胞遷移能力明顯受抑，表明嚴重燒傷血清可促進BMSCs細胞遷移，可能與其激活PI3K/Akt信號通路相關(guān)。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)嚴重燒傷血清處理BMSCs后，BMSCs細胞微管結(jié)構(gòu)解聚/聚合動態(tài)失衡，發(fā)生解聚，同時細胞遷移能力增強，但用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002作用后BMSCs細胞微管結(jié)構(gòu)與正常培養(yǎng)組相似，且細胞遷移能力減弱，說明嚴重燒傷血清可能激活BMSCs細胞PI3K/Akt信號通路，進而影響細胞微管結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使細胞骨架解聚/聚合的動態(tài)平衡被打破，朝解聚方向移動，以利于細胞遷移。

有研究表明，細胞遷移需要微管介導的細胞體的收縮、伸展等一系列過程，缺氧可使表皮細胞微管動力學發(fā)生變化，增強細胞遷移能力[15]。PI3K/Akt信號通路可影響許多細胞結(jié)構(gòu)，特別是腫瘤細胞。核糖體蛋白S6激酶[p70(S6K)]是PI3K/Akt信號通路下游信號分子，p70(S6K)可通過肌動蛋白纖維交聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)細胞骨架動力學。過表達p70(S6K)可促進卵巢癌細胞定向遷移[16]。p70(S6K)可快速激活Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1、細胞分裂周期蛋白42以及他們下游信號分子p21小GTP酶活化激酶1[16]。抑制p70(S6K)可導致其下游蛋白表達下調(diào)及肌動蛋白骨架結(jié)構(gòu)重組。但在嚴重燒傷環(huán)境下，嚴重燒傷血清中哪些物質(zhì)激活PI3K/Akt信號通路，通過調(diào)控細胞微管骨架結(jié)構(gòu)變化，進而促進細胞遷移能力的具體作用機制還有待進一步研究。

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Role of PI3K/Akt signal pathway in BMSCs migration induced by serum of rats with severely burn*

LiMaohua，TengMiao，GuoLei△

(DepartmentofBurnandPlasticSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016,China.)

ObjectiveTo study the effects of severely burned rats serum on migration of BMSCs and mechanism.MethodsSeverely burned rats model was established，and the preparation of severely burned rats serum.Experimental groups:normal training group(containing 10% fetal bovine serum，group C)，burn serum group(containing 10% burns in the rat serum，group B)，burn serum+blockers(10% burns in the rat serum+final concentration of 10 μmol/L PI3K signaling pathway inhibitor LY294002 training，group B+LY).Activity of cells was examined with MTT;migration of cells was examined with Transwell chambers testing;protein expression of p-AKT/AKT was determined with Western blot;microtubule structure of cells was examined with immunofluorescence.ResultsCompared with group C，group B burn serum treatment after 24 h，BMSCs activity(P<0.01)，p-AKT levels(P<0.05),increased migration quantity(P<0.001);cell microtubule structures appear rupture，after adding inhibitor，compared with group B，group B+LY BMSCs activity(P<0.01)，to reduce the number of migration(P<0.001)，p-lower AKT(P<0.05)，cell microtubule structure similar to the normal group.ConclusionSeverely burned rats serum can promote BMSCs migration，may burn serum cytokine activation of PI3K/AKT signal pathway，resulting in cell microtubule structure change，promote the migration of BMSCs.

burns；mesenchymal stem cells；microtubules；migration；PI3K/Akt；signaling pathway

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.003

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目(cstc2013jcyjA10069)

：李茂華(1989-),碩士，研究方向為創(chuàng)面愈合與瘢痕防治?！?/p>

，E-mail:cqguolei@sina.com。

R34

A

1671-8348(2015)27-3752-04

2015-03-07

2015-06-13)