Ⅳ和Ⅳ+Ⅴ型狼瘡性腎炎患者血清microRNA標(biāo)志物的芯片初篩*

張志恒,肖紅波,王 琪，王 艷，熊祖應(yīng)△

(安徽醫(yī)科大學(xué)北京大學(xué)深圳醫(yī)院：1.臨床學(xué)院；2.腎內(nèi)科，廣東深圳 518036)

·論 著·

Ⅳ和Ⅳ+Ⅴ型狼瘡性腎炎患者血清microRNA標(biāo)志物的芯片初篩*

張志恒1,2,肖紅波2,王 琪2，王 艷2，熊祖應(yīng)1,2△

(安徽醫(yī)科大學(xué)北京大學(xué)深圳醫(yī)院：1.臨床學(xué)院；2.腎內(nèi)科，廣東深圳 518036)

目的應(yīng)用微小核糖核酸(microRNA)芯片技術(shù)初步篩選Ⅳ、Ⅳ+Ⅴ型狼瘡性腎炎患者血清microRNA，探討血清microRNA在狼瘡性腎炎病理分型中的作用。方法從北京大學(xué)深圳醫(yī)院腎內(nèi)科生物標(biāo)本庫中選?、?、Ⅳ+Ⅴ型狼瘡性腎炎血清各4例，作為試驗組；同時選取4例健康人血清作為對照組，使用microRNA芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)的血清microRNA。結(jié)果Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型共有部分microRNA，其中22個有顯著差異，Ⅳ型特異性microRNA有29個，Ⅳ+Ⅴ型特異性microRNA有3個。結(jié)論血清microRNA具有作為鑒別Ⅳ、Ⅳ+Ⅴ型狼瘡性腎炎生物標(biāo)志物的潛能。

狼瘡腎炎；腎臟病理分型；微RNAs；microRNA芯片

狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是臨床上繼發(fā)性腎病的常見病因。腎活檢可以明確LN腎臟病理分型，從而指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后，但腎活檢是一項有創(chuàng)性操作，具有一定風(fēng)險，不易重復(fù)檢測。為此，探尋可部分替代重復(fù)腎活檢，對鑒別LN病理類型有一定臨床價值的生物標(biāo)志物顯得極為重要。

微小核糖核酸(microRNA，簡稱miRNA)是一類非編碼、由19～23個核苷酸組成的小分子單鏈RNA，它們通過與靶目標(biāo)mRNA的3′-UTR及5′-UTR區(qū)堿基互補配對，進(jìn)而調(diào)節(jié)mRNA降解或抑制mRNA翻譯，參與多種生理和病理過程[1]。近年來研究表明，miRNA可穩(wěn)定存在于血清、血漿、尿液等體液中[2-3]，且與許多病理、生理過程密切相關(guān)，具有作為腫瘤、腎病綜合征等多種疾病生物標(biāo)志物的潛能[4-7]。血清miRNA在LN及其腎臟病理分型中是否可作為生物標(biāo)志物目前還不清楚。本課題采用miRNA芯片技術(shù)檢測并比較Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型LN及健康對照組miRNA差異性表達(dá)，初步探討血清miRNA在LN腎臟病理分型中作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2014年1月在本醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎活檢確診為Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型LN患者各4例，且近3個月內(nèi)未經(jīng)過免疫抑制劑及激素沖擊治療，前者標(biāo)記為A1、A2、A3和A4，后者標(biāo)記為B1、B2、B3和B4，共8例作為試驗組。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡大于或等于18周歲，排除LN外的慢性疾病，包括原發(fā)性高血壓、糖尿病、其他結(jié)締組織病等，腎臟病理符合2003年國際腎臟病學(xué)會/腎臟病理學(xué)會(ISN/RPS)LN分類標(biāo)準(zhǔn)[8]。同時選取年齡、性別等匹配的健康人作為對照組，分別標(biāo)記為C1、C2、C3和C4。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意，所有患者均簽訂知情同意書。

1.2 血清采集 試驗組用無肝素真空管采集患者血液，室溫下2 500 r/min離心15 min后收集血清。將血清儲存在-80 ℃冰箱至試驗時取用。對照組血清采集方法相同。

1.3 miRNA芯片掃描和數(shù)據(jù)分析 樣品采用miRNA標(biāo)記試劑盒miRCURYTM Array Power Labeling Kit標(biāo)記樣本RNA，與第7代Exiqon miRCURY LNATM(V18.0版本)雜交并洗滌。該芯片包括3 100個捕獲探針覆蓋miRBase數(shù)據(jù)庫18.0版本人、小鼠和大鼠3個物種全部miRNA，同時覆蓋與上述物種相關(guān)的所有病毒miRNA。芯片雜交實驗及后續(xù)結(jié)果分析在上海康成生物技術(shù)公司完成。對Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型LN與對照組血清差異表達(dá)miRNA進(jìn)行篩選，經(jīng)中位數(shù)法標(biāo)準(zhǔn)化后，計算各miRNA差異倍數(shù)，篩選上調(diào)和下調(diào)miRNA。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 選取芯片讀數(shù)原始值大于或等于100，同時差異倍數(shù)大于或等于3或小于或等于1/3為顯著差異，其中前者為上調(diào)，后者為下調(diào)，采用t檢驗，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用MEV4.9版本軟件對差異表達(dá)miRNA進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 本研究中12個樣本臨床資料結(jié)果見表1。

表1 所有入選對象臨床資料

2.2 腎臟病理結(jié)果 經(jīng)腎活檢證實為Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型LN患者，兩組患者的腎臟病理見圖1。

A、B分別代表Ⅳ型LN的PASM染色和PAS染色，C、D分別代表Ⅳ+Ⅴ型LN的PASM染色和PAS染色。PASM染色提示Ⅳ+Ⅴ型LN基底膜病變較Ⅳ型LN明顯。PAS染色提示兩種類型LN腎組織都有增生性病變。

圖1 患者腎活檢組織六胺銀染色(PASM染色)和過碘酸雪夫染色(PAS染色)病理圖片

2.3 miRNA芯片檢測結(jié)果如下 Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型兩組有部分相同miRNA表達(dá)，且表達(dá)差異符合篩選要求者22個，其中上調(diào)17個，下調(diào)5個，見表2、3；兩組不同病理類型Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型間特異性miRNA篩選比較發(fā)現(xiàn)，Ⅳ型有29個，其中上調(diào)22個，下調(diào)7個，見表4、5；Ⅳ+Ⅴ型有3個，均為下調(diào)，見表6。

表2 Ⅳ型和Ⅴ+Ⅳ型LN共有部分miRNA及其表達(dá)上調(diào)情況

續(xù)表2 Ⅳ型和Ⅴ+Ⅳ型LN共有部分miRNA及其表達(dá)上調(diào)情況

表3 Ⅳ型和Ⅴ+Ⅳ型LN共有部分miRNA及其表達(dá)下調(diào)情況

2.4 聚類分析 將血清miRNA在Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型LN患者表達(dá)的聚類圖進(jìn)行雙層聚類分析，可直觀觀察到同一血清miRNA在不同樣本中表達(dá)情況。見圖2。

表4 Ⅳ型LN患者特異性miRNA及其表達(dá)上調(diào)情況

表5 Ⅳ型LN患者特異性miRNA及其表達(dá)下調(diào)情況

表6 Ⅳ+Ⅴ型LN患者特異性miRNA及其表達(dá)下調(diào)情況

A1、A2、A3、A4代表Ⅳ型LN患者，B1、B2、B3、B4代表Ⅳ+Ⅴ型LN患者；“has”表示人類種族；其中每一列代表一個樣本，每一行代表一種miRNA，根據(jù)不同miRNA在不同樣本的表達(dá)量進(jìn)行聚類分析，紅色代表高表達(dá)，綠色代表相對較低的表達(dá)。

圖2 血清miRNA在Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型LN患者表達(dá)的聚類圖

3 討 論

miRNA是一類非編碼、內(nèi)源性小單鏈RNA分子。1993年Lee等[9]首次在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)第一個miRNA(lin-4)，隨后，科學(xué)家們應(yīng)用隨機克隆、測序和生物信息學(xué)預(yù)測等多種手段，發(fā)現(xiàn)miRNA在細(xì)胞分裂、凋亡、傷口愈合和免疫應(yīng)答等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[10-13]。同時因其在體液中具有高穩(wěn)定性和疾病特異性，相比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)類生物標(biāo)志物，其低復(fù)雜性、無后加工修飾、可合成高親和“捕獲”試劑、能進(jìn)行“信號”擴增特性，使其成為生物標(biāo)志物研究熱點[14]。

體液miRNA作為生物標(biāo)志物研究，在腎臟病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和LN方面均有報道。研究發(fā)現(xiàn)血清miR-106a、miR-17、miR-20a、miR-203、miR-92a等具有作為診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的潛能，miR-342-3p、miR-223、miR-20a在活動性LN患者中表達(dá)下調(diào)，與LN相關(guān)[15]；尿miR-155與LN患者蛋白尿程度和狼瘡活動指數(shù)相關(guān)，miR-146a與狼瘡患者腎小球濾過率相關(guān)[16]；血漿miR-126 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中表達(dá)上調(diào)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中無此現(xiàn)象，提示其可作為狼瘡患者診斷標(biāo)志物。這些研究發(fā)現(xiàn)部分miRNA具有成為系統(tǒng)性紅斑狼瘡和LN生物標(biāo)志物的潛力，但未見miRNA與LN病理類型關(guān)系研究報道。

miRNA芯片是大規(guī)模篩選組織、體液miRNA的有效檢測手段，具有高特異度、高靈敏度、樣本用量少等特點，目前已被廣泛采用。本研究采用第7代Exiqon miRCUY LNATM(V18.0版本)miRNA表達(dá)譜芯片，相比普通miRNA芯片，其特異度、靈敏度更高，可更廣泛篩選血清中miRNA，減少miRNA漏篩發(fā)生率。

本研究所選患者的臨床與病理資料結(jié)果顯示(表1和圖1)，試驗組A組為Ⅳ型LN，B組為Ⅳ+Ⅴ型LN，均為本院腎內(nèi)科確診LN患者；對照組中4例入選者為健康志愿者。本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型LN患者血清中有部分相同miRNA，其中22個有顯著差異，并且最高差異率達(dá)7倍以上；Ⅳ型特有miRNA 29個，Ⅳ+Ⅴ型miRNA特有3個(特有指Ⅳ型與Ⅳ+Ⅴ型之間比較)。推測以上54個miRNA可能有鑒別Ⅳ型及Ⅳ+Ⅴ型LN的潛能，并且差異miRNA數(shù)量較多，差異性非常顯著，說明LN患者血清miRNA可能是很好的生物標(biāo)志物。上述數(shù)據(jù)中，兩組之間差異最為明顯者如hsa-miR-4762-5p、hsa-miR-297，利用miRNA靶基因在線預(yù)測軟件MIRDB對上述靶基因進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)包括FAT1、JAG1、SSBP2等在內(nèi)的基因均可影響腎臟功能，但目前未見其與LN相關(guān)的研究。實驗結(jié)果中還有其他部分miRNA，文獻(xiàn)報道也較少，這些miRNA的作用尚不清楚，值得探討。另外這54個miRNA相對于對照組均有顯著差異性，這些miRNA是否參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡或LN發(fā)病過程，也需要進(jìn)一步研究。

本研究中采用的芯片技術(shù)篩查只是初步研究，且可能會有假陽性或假陰性結(jié)果。另有藥物、狼瘡并發(fā)癥等可能也對實驗結(jié)果造成影響，因此需要采用實時熒光定量PCR技術(shù)或其他方法進(jìn)行較大樣本驗證，從而判斷上述miRNA是否有助于鑒別Ⅳ和Ⅳ+Ⅴ型LN患者病理分型，或采用更大樣本量判斷多種類型LN，將是未來研究的方向之一。

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The screen of serum microRNA in Ⅳand Ⅳ+Ⅴ lupus nephritis patients*

ZhangZhiheng1，2，XiaoHongbo2，WangQi2,WangYan2，XiongZuying1,2△

(1.ClinicalCollege;2.DepartmentofNephrology,PekingUniversityShenzhenHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Shenzhen，Guangdong518036，China)

ObjectiveTo preliminary screen serum microRNA which was related to class Ⅳ and class Ⅳ+Ⅴ lupus nephritis(LN) by using microRNA array technology，and explore the role of serum microRNA in renal pathological classification of lupus nephritis.MethodsEight serum samples of lupus nephritis patients from biological specimen library in our hospital were enrolled.Experimental group was composed of 4 class Ⅳ cases and 4 class Ⅳ+Ⅴ cases，control group was composed of 4 healthy persons.MicroRNA array was used to screen the differentially expressing microRNA.ResultsThere were part of same miRNA in class Ⅳ and classⅣ+Ⅴ LN，among which expression of 22 miRNA were significantly different，29 miRNA of classⅣ was unique，3 miRNA of class Ⅳ+Ⅴ was unique.ConclusionSerum miRNA has a potential to serve as a biomarker to identify class Ⅳ and classⅣ+Ⅴ lupus nephritis.

lupus nephritis;renal pathology;microRNAs;microRNA array

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.001

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動項目資助(S2013040015040)。

：張志恒(1989-)，在讀碩士。主要從事狼瘡性腎炎病理工作?！?/p>

，E-mail:xiongzy2005@163.com。

R692

A

1671-8348(2015)27-3745-03

2015-03-07

2015-06-03)