TALE-TFs構(gòu)建方法的建立及優(yōu)化

王媛媛，蘇攀柯，黃愛龍，胡接力△

(1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南洛陽 471000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

·技術(shù)與方法·

TALE-TFs構(gòu)建方法的建立及優(yōu)化

王媛媛1，蘇攀柯1，黃愛龍2，胡接力2△

(1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南洛陽 471000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

教育部感染性疾病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

目的 在傳統(tǒng)方案的基礎(chǔ)上建立一種經(jīng)濟(jì)有效且易于操作的類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子轉(zhuǎn)錄因子(TALE-TFs)的構(gòu)建和功能檢測(cè)方案。方法采用基于PCR的Golden gate克隆法分別嘗試構(gòu)建類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物(TALEs)的六聚體、五聚體、四聚體和三聚體，比較構(gòu)建結(jié)果，選擇最優(yōu)效果方案進(jìn)行TALE-TFs的構(gòu)建。采用片段置換反應(yīng)(FSR)構(gòu)建了含有TALE-TFs結(jié)合片段的RFP質(zhì)粒pminCMV，并與TALE-TFs進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，觀察紅色熒光驗(yàn)證TALE-TFs的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果TALEs中所含的串聯(lián)重復(fù)模塊越少，獲得的構(gòu)建產(chǎn)物越多。共轉(zhuǎn)染時(shí)，TALE-TFs使得pminCMV成功啟動(dòng)表達(dá)。結(jié)論該研究為不同條件下實(shí)驗(yàn)方案的選擇提供了依據(jù)，并利用含有TALE-TF結(jié)合片段和紅色熒光的質(zhì)粒建立了快捷直觀的轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證方法。

類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物;質(zhì)粒構(gòu)建;轉(zhuǎn)錄;轉(zhuǎn)染

類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物(TALEs)蛋白家族是來自于植物病原體-黃單胞桿菌的天然細(xì)菌效應(yīng)蛋白。它類似于真核生物的轉(zhuǎn)錄因子，通過識(shí)別特異DNA序列來調(diào)節(jié)宿主基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)菌定植。TALEs蛋白中部包含一段由串聯(lián)重復(fù)單體構(gòu)成的DNA特異識(shí)別和結(jié)合區(qū)域，其中每個(gè)單體含有大約34個(gè)氨基酸。而TALEs的重復(fù)部分是由數(shù)個(gè)重復(fù)單體加約含20個(gè)氨基酸殘基的0.5個(gè)重復(fù)單位構(gòu)成[1]。天然形成的TALEs具有大約1.5～33.5個(gè)數(shù)量不等的單體，雖然每個(gè)單體在序列上是高度保守的，但是他們的第12 和13位點(diǎn)的氨基酸卻有所不同，這兩個(gè)位點(diǎn)被命名為重復(fù)可變雙殘基(RVD)。每個(gè)RVD中有一個(gè)簡單密碼來指定識(shí)別一個(gè)特定的堿基，從而決定了TALEs核苷酸結(jié)合的特異性。如NI(Asn/Ile)對(duì)應(yīng)A、NG(Asn/Gly)對(duì)應(yīng)T、HD(His/Asp)對(duì)應(yīng)C、NN(Asn/Asn)對(duì)應(yīng)G/A[2-3]。人工定制的TALEs可以運(yùn)用到基因組工程的多個(gè)方面，包含起轉(zhuǎn)錄修飾作用的TALE-TFs和基因組剪輯作用的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)等[4-7]。

人工定制TALEs技術(shù)作為一個(gè)全新而又有效的基因組工程策略將會(huì)成為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所必備的技術(shù)之一，因此本課題組針對(duì)TALE-TFs的構(gòu)建進(jìn)行嘗試，希望建立一套適合本實(shí)驗(yàn)室使用，而制備手段又更為優(yōu)化快捷和直觀的實(shí)驗(yàn)方案。一般實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建方案多采用以初次Golden Gate反應(yīng)生成TALEs六聚體為基礎(chǔ)，經(jīng)過2次Golden Gate反應(yīng)最終形成十八聚體。本實(shí)驗(yàn)對(duì)初次Golden Gate反應(yīng)形成TALEs三聚體、四聚體、五聚體和六聚體分別進(jìn)行了構(gòu)建嘗試，在兼顧獲取難度和識(shí)別的目的基因長短的基礎(chǔ)上選擇了五聚體進(jìn)行了下一步構(gòu)建。在功能測(cè)定方案上改變傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建和定量RT-PCR相結(jié)合的方案，采用聯(lián)合片段置換反應(yīng)(FSR)[8](不需要進(jìn)行酶切連接的克隆技術(shù)，由本課題組在前期建立的基因克隆技術(shù))構(gòu)建了帶有目的基因片段和紅色熒光報(bào)告基因的質(zhì)粒，通過共轉(zhuǎn)染的方式來直接觀察TALE-TFs的轉(zhuǎn)錄效率。這為本課題組下一步進(jìn)行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)奠定了基礎(chǔ)，并為其他構(gòu)建者提供經(jīng)驗(yàn)和新的方案參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 合成引物(生工生物工程上海有限公司)，TALEs單體模板(Addgene提供)，Herculase Ⅱ fusion polymerase(購自Agilent Technologies)，BsmBI、BsaI-HF、AfeI(購自NEW England Biolabs)，T7 DNA ligase、Tag-B polymerase(購自Enzymatics)，DL2000 DNA Marker(購自寶生物大連有限公司)，PlasmiSafe ATP-dependent DNase (購自Epicentre),轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM-2000 (購自Invitrogen)，質(zhì)粒提取試劑、質(zhì)粒載體pEGFP-N1、腺病毒Ad-RFP(購自Promega)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞293HEK、DH5a感受態(tài)(重慶醫(yī)科大學(xué)教育部感染性疾病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物制備 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要本課題組制備了一系列的引物(表1)。

1.2.2 以TALEs單體質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增 分別選擇TALEs單體質(zhì)粒NI、NG、HD、NN為模板，根據(jù)其所在串聯(lián)結(jié)構(gòu)的位置，選擇相應(yīng)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物選擇方案見表2。PCR反應(yīng)采用100 μL反應(yīng)體系：單體模板質(zhì)粒(5 μg/μL)1 μL，dNTP(100 μmol/L)1 μL，Herculase Ⅱ PCR buffer(5 ×)20 μL，20 μmol/L primer mix 2 μL，Herculase Ⅱ fusion polymerase 1 μL，Distilled water補(bǔ)足到100 μL。PCR反應(yīng)程序按照：95 ℃ 預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳和膠回收，執(zhí)行產(chǎn)物純化后備用。

1.2.3 利用Golden Gate反應(yīng)制備環(huán)形多聚體 采用配對(duì)引物(表2)分別進(jìn)行環(huán)形六聚體、五聚體、四聚體、三聚體的組裝，多聚體構(gòu)建方案，以五聚體為例見圖1A。比較結(jié)果，決定最后要選擇的多聚體構(gòu)建方案，對(duì)照靶識(shí)別的序列，構(gòu)建識(shí)別3個(gè)連續(xù)序列的多聚體，每個(gè)所含重復(fù)單體數(shù)目相同。均采用10 μL反應(yīng)體系：BsmI(10 U/μL)0.75 μL，Tango buffer(10×)1 μL，DTT(10 mM)1 μL，T7 Ligase(3 000 U/μL)0.25 μL，ATP(10 mM)1 μL，6個(gè)單體按照選擇個(gè)數(shù)各1 μL，不足10 μL時(shí)用Distilled water補(bǔ)足。Golden Gate反應(yīng)結(jié)束后，采用PlasmiSafe ATP-dependent DNase消化降解非環(huán)形結(jié)構(gòu)后純化產(chǎn)物。降解方法見產(chǎn)品說明。

表2 TALEs構(gòu)建的引物選擇方案

1～18：TALEs中單體對(duì)應(yīng)所識(shí)別堿基在靶識(shí)別片段中的位置。

1:Hexmaer1;2:Hexmaer2;3:Hexmaer3;4:Trimer;5:Tetramer;6:Pentamer;7:Pentamer1;8:Pentamer2;9:Pentamer3。

圖1 TALEs多聚體的構(gòu)建

1.2.4 第2次Golden Gate反應(yīng)形成最后的TALEs結(jié)構(gòu)并轉(zhuǎn)化 用Hex-F和Hex-R為引物對(duì)構(gòu)建的多聚體進(jìn)行擴(kuò)增，3個(gè)多聚體擴(kuò)增后的片段結(jié)合TALE-TFs的骨架質(zhì)粒進(jìn)行第2次Golden Gate反應(yīng)。反應(yīng)體系為：骨架質(zhì)粒(100 ng/μL)1 μL，BsaI-HF(20 U/μL)0.75 μL,NE Buffer 4(10×)1 μL,BSA(10×)1 μL,ATP(10 mM)1 μL,T7 ligase(3 000 U/μL) 0.25 μL,3個(gè)純化的多聚體每個(gè)1 μL，Distilled water補(bǔ)足到10 μL。產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)化。

1.2.5 構(gòu)建含有TALE-TF識(shí)別序列和報(bào)告基因的質(zhì)粒 先從腺病毒Ad-RFP上利用引物F RFP-N1和R RFP-N1對(duì)RFP片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所獲得的PCR產(chǎn)物利用FSR克隆技術(shù)替換到pEGFP-N1上，獲得質(zhì)粒pRFP。再利用引物Fmin和Rmin對(duì)pRFP進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)在Fmin及Rmin的引物序列中加入了TTAATTAA的酶切位點(diǎn)，可使其酶切后再自連。此外在Fmin序列中實(shí)驗(yàn)還加入了靶識(shí)別序列，T ACCAC AAGAA CACTA，識(shí)別序列以T開頭，后每個(gè)RVD對(duì)應(yīng)1個(gè)堿基，共識(shí)別15個(gè)堿基。PCR產(chǎn)物經(jīng)過酶切連接后將形成1個(gè)含有目標(biāo)靶點(diǎn)序列和RFP報(bào)告基因的質(zhì)粒pminCMV。

1.2.6 采用共轉(zhuǎn)染的方式驗(yàn)證TALE-TF的轉(zhuǎn)錄活性 采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine2000分別將TALE-TFs載體質(zhì)粒、pEGFP-N1、和pminCMV 3個(gè)質(zhì)粒和TALE-TFs、pEGFP-N1和pminCMV 3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞，利用熒光顯微鏡對(duì)自然光下細(xì)胞、綠色熒光和紅色熒光進(jìn)行觀察，判斷構(gòu)建質(zhì)粒TALE-TFs的轉(zhuǎn)錄活性，驗(yàn)證其功能。轉(zhuǎn)染方法見試劑說明。

2 結(jié) 果

2.1 Golden Gate反應(yīng)制備環(huán)形多聚體 在實(shí)驗(yàn)開始之初，作者采用了以六聚體為基礎(chǔ)的TALEs構(gòu)建方案，構(gòu)建完成后采用引物Hex-F和Hex-R進(jìn)行擴(kuò)增，得到六聚體線性結(jié)構(gòu)后電泳(圖1B)。如圖所示，在750 bp左右的位置存在較弱的六聚體條帶，顯示其獲取效率較低。為了提高多聚體獲取效率，作者推測(cè)構(gòu)建更短的多聚體應(yīng)該更容易。為此，分別構(gòu)建了三聚體、四聚體和五聚體，同樣引物PCR得到電泳條帶分別在小于500 bp、500 bp左右和750～500 bp之間(圖1C)。這些結(jié)果顯示，與之前的推測(cè)相符，片段越小多聚體的獲得效率就越高，所獲得的電泳條帶的濃度越大。結(jié)合靶識(shí)別片段的長度及序列，本研究最終選擇構(gòu)建以五聚體為基礎(chǔ)的TALEs構(gòu)建方案。3個(gè)五聚體經(jīng)過2次Golden Gate反應(yīng)，得到TALEs最終的十五聚體結(jié)構(gòu)。3個(gè)五聚體均采用引物Hex-F和Hex-R進(jìn)行PCR,電泳結(jié)果均為750～500 bp(圖1D)。

2.2 pminCMV質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果 第1步，對(duì)pRFP進(jìn)行構(gòu)建，構(gòu)建程序見圖2A。首先從Ad-RFP中擴(kuò)增出RFP片段，電泳(圖2B)，所得電泳條帶在約800 bp處，與預(yù)期相符。再采用片段置換反應(yīng)將該RFP片段克隆到pEGFP-N1中，獲得pRFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，利用引物F1.1CMV和R RFP-N1做PCR挑選出陽性克隆(圖2B)，結(jié)果顯示篩選的5個(gè)克隆中有4個(gè)750～500 bp條帶，為陽性克隆，測(cè)序結(jié)果證明載體構(gòu)建正確。第2步，采用引物Fmin及Rmin對(duì)pRFP質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增后，酶切PCR擴(kuò)增片段，然后自身連接環(huán)化，即構(gòu)建為pminCMV質(zhì)粒(圖2C)。pRFP質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果為大小約4 500 bp的片段(圖2D左)，生成的pminCMV質(zhì)粒采用引物F N14710和R SV40進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行克隆篩選。PCR產(chǎn)物電泳，得到1 200 bp附近條帶的為陽性克隆(圖2D右)。

2.3 TALE-TF的轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證 將TALE-TFs骨架質(zhì)粒、pEGFP-N1和pminCMV共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞作為陰性對(duì)照(圖3)。轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下可見大量綠色熒光，紅色熒光未見。結(jié)果提示，TALE-TFs骨架質(zhì)粒不能將pminCMV激活使其發(fā)出紅色熒光。將目標(biāo)TALE-TFs、pEGFP-N1和pminCMV共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，紅色熒光易明顯可見(圖3)。由此可見，作者構(gòu)建的TALE-TFs質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)錄活性，可使含有目的識(shí)別片段的pminCMV成功表達(dá)出紅色熒光。

圖3 TALEs-TF在HEK293細(xì)胞中的活性

3 討 論

在TALEs與DNA的特異性識(shí)別的分子密碼被破譯之后，人們便開始試圖將其作為特定基因位點(diǎn)的靶向修飾工具。為了確保TALEs識(shí)別的特異性，它所識(shí)別的靶基因片段應(yīng)至少大于10 bp,TALEs結(jié)構(gòu)中應(yīng)至少含有9.5個(gè)重復(fù)單元。所以說，TALEs結(jié)構(gòu)中重復(fù)序列單元的構(gòu)建，對(duì)于這一靶向修飾技術(shù)的建立具有重大意義，而這一環(huán)節(jié)又恰恰成為了這一技術(shù)的難點(diǎn)。因而，從TALEs技術(shù)發(fā)展至今的3、4年時(shí)間里，國外出現(xiàn)了大量關(guān)于此項(xiàng)技術(shù)的研發(fā)和改進(jìn)的報(bào)道。

目前人工構(gòu)建TALEs技術(shù)主要包含有較為昂貴的全序列人工合成[9]，Golden Gate克隆法[4,10]，連續(xù)克隆組裝法[11-12]、利用基因固相合成的高通量技術(shù)[13]和長粘末端的LIC(ligation-independent clonging)[14]組裝方法等。其中最常用的為Golden Gate克隆法，它是利用了IIS型限制性核酸內(nèi)切酶[4,7,15-18]識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)分離的特點(diǎn)，通過相同的IIS型限制性核酸內(nèi)切酶設(shè)計(jì)不同黏性末端的方式，實(shí)現(xiàn)了一次性酶切連接反應(yīng)之后片段按照指定次序進(jìn)行連接，構(gòu)建出本研究所需要的堿基識(shí)別順序。本實(shí)驗(yàn)就是在以基于PCR的Golden Gate克隆法為基礎(chǔ)，對(duì)這一方法進(jìn)行嘗試和適當(dāng)改進(jìn)，建立一套適合于本課題需要和盡可能方便簡潔的具體實(shí)驗(yàn)方案。

在該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的初始階段，作者選擇常用的以首次Golden Gate反應(yīng)構(gòu)建TALEs六聚體的實(shí)驗(yàn)方案。六聚體純化電泳后發(fā)現(xiàn)電泳條帶很弱，重回收效果不佳(圖1B)。于是作者對(duì)五聚體、四聚體、三聚體分別進(jìn)行了構(gòu)建嘗試后發(fā)現(xiàn)形成的多聚體結(jié)構(gòu)越小它的獲得效率越高(圖1C)。綜合考慮DNA識(shí)別序列的長度，本研究最終選擇了構(gòu)建五聚體。鑒定TALE-TFs的轉(zhuǎn)錄效率是考察本實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。據(jù)研究報(bào)道，TALE-TFs的轉(zhuǎn)錄效率的檢測(cè)方案常采用將TALE-TFs質(zhì)粒、報(bào)告基因質(zhì)粒和含有目的識(shí)別片段的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，在報(bào)告基因熒光顯微鏡下確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率的前提下，對(duì)細(xì)胞做定量RT-PCR，驗(yàn)證TALE-TFs的轉(zhuǎn)錄活性。此方案結(jié)果雖然真實(shí)可靠，但是方法較為繁瑣，包含轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒構(gòu)建和RT-PCR，且RT-PCR的結(jié)果受質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率、mRNA的提取效果，DNA污染等諸多因素影響，于是本研究采用將目的基因和報(bào)告基因合二為一的質(zhì)粒構(gòu)建方案，并采用了課題組前期構(gòu)建的FSR克隆技術(shù)，使得質(zhì)粒構(gòu)建快速高效。所獲得的pminCMV轉(zhuǎn)錄效率驗(yàn)證質(zhì)粒在結(jié)果驗(yàn)證方面表現(xiàn)更為直觀，操作更為簡潔。

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Establishment and optimization for TALE-TFs construction*

WangYuanyuan1,SuPanke1,HuangAilong2,HuJieli2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471003China; 2.KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseases,MinistryofEducation,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016China)

Objective To optimize the method of transcription activator-like effector transcription factors (TALE-TFs) construction,some improvement and adaption were made based on the traditional methods.Methods We first constructed the basic tandem fragments with different length,including trimer,tetramer,pentamer and hexamer by Golden Gate cloning technique and PCR,then the procedure with the highest efficacy was chosen to construct our TALE-TFs.To determine the function of the TALE-TFs,the plasmid pminCMV with the specific binding sequence of TALE-TFs was constructed by fragment substitution reaction (FSR).The transcription activating function of TALE-TFs was confirmed by the intensity of red fluorescence,after TALE-TFs,pEGFP-N1 and pminCMV plasmid were co-transfected into 293HEK cells.Results An optimized method for TALE-TFs construction and functional assay was established.Conclusion This method can potentially be wildly used in fields that the expression of some constitutively expressed genes needs to be modified.

transcription activator-like effectors; plasmid construction;transcription; transfect

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.023

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81000732)。

王媛媛(1982-)，碩士，主管檢驗(yàn)師，主要從事生物化學(xué)檢驗(yàn)方面的研究。

△通訊作者，E-mail:hujieli1977@gmail.com。

R34

A

1671-8348(2015)15-2079-05

2014-11-08

2015-02-16)