不同低氧時(shí)間誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞miR-214表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

楊 姣，吳緒偉，張力燕，肖 誼，張鈺旋，李艷麗，邢西遷△

(1．昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院呼吸內(nèi)一科 650051)

·論 著·

不同低氧時(shí)間誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞miR-214表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

楊 姣1，吳緒偉2，張力燕1，肖 誼2，張鈺旋2，李艷麗2，邢西遷2△

(1．昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院呼吸內(nèi)一科 650051)

目的 觀察不同低氧時(shí)間誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs) 微小RNAs(miRNA)-214表達(dá)的變化。方法將原代培養(yǎng)的大鼠PASMCs分別于低氧下培養(yǎng)0、6、12、24和48 h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞miR-214的表達(dá)情況。結(jié)果大鼠PASMCs的miR-214表達(dá)隨低氧時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)升高趨勢(shì)，除低氧6 h組與低氧0 h組相比較，miR-214的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各組之間miR-214的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論低氧誘導(dǎo)后，miR-214在PASMCs中的表達(dá)上調(diào)，且隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-214的表達(dá)有逐漸增加的趨勢(shì)。

微RNAs-214；缺氧；肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸大小的內(nèi)源性非編碼RNA，它可通過(guò)識(shí)別靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)，并與之結(jié)合阻止翻譯或?qū)е耺RNA降解，從而抑制靶基因的表達(dá)[1]。研究表明,一些miRNAs參與了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展，可能在肺動(dòng)脈高壓的防治方面起到重要作用[2-3]。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)增殖、遷移是肺動(dòng)脈高壓形成的重要因素，但miR-214是否參與低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖、遷移，尚不明確。本研究選取大鼠PASMCs作為研究對(duì)象，觀察不同低氧時(shí)間誘導(dǎo)的PASMCs miR-214的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究miR-214對(duì)PASMCs的調(diào)控作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，4周齡，體質(zhì)量約180～200 g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部。

1.1.2 儀器與試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素和D′-Hanks 緩沖液(GIBCO，進(jìn)口分裝)，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于Sigma公司，小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體、山羊抗小鼠IgG、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒均購(gòu)于Santa Cruz公司，磷酸鹽緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)，TRIzol(Invitrogen，美國(guó))；miRNeasy Mini Kit(Qiagen，德國(guó))，miRNA Q-PCR Detection Kit(Gene Copoeia，美國(guó))。Realtime-PCR儀(ABI 7500型)，DG-Ⅲ雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀(北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心)，高速離心機(jī)(SIGMA，1-13)，二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó) Hereus)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定 肺動(dòng)脈平滑肌提取、培養(yǎng)參照文獻(xiàn)。在立體顯微鏡下分離大鼠肺動(dòng)脈，采用Ⅱ型膠原酶法提取原代平滑肌細(xì)胞，按每瓶3 ×104活細(xì)胞數(shù)接種在25 mL培養(yǎng)瓶里，放入37 ℃孵箱里靜置培養(yǎng)。細(xì)胞免疫熒光鑒定：使用α-SM-actin單克隆抗體，滴加cy3標(biāo)記的熒光二抗Anti-Mouse IgG，用DAPI染核，熒光顯微鏡下拍片。鑒定為平滑肌細(xì)胞，且比例占97%以上，取3～5代的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 細(xì)胞處理及分組 細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)50%融合后，加入無(wú)血清的DMEM/F 12培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中放置24 h，使細(xì)胞周期同步化。傳代培養(yǎng)后，分組設(shè)計(jì)：細(xì)胞置于3% O2、92% N2、5% CO2的混合氣體的低氧條件下培養(yǎng)，分為H0 h組、H6 h組、H12 h組、H24 h組、H48 h組，分別培養(yǎng)0、6、12、24、48 h。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)miR-214的表達(dá) 分別收集各組細(xì)胞，采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，異丙醇法濃縮RNA，瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA的完整性。采用ABI公司TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit和特異miRNA的莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Gene Copoeia miRNA檢測(cè)試劑盒，在RT-PCR儀上擴(kuò)增和檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s)。選取GAPDH作為內(nèi)參，miR-214的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果 細(xì)胞免疫熒光顯示，細(xì)胞質(zhì)中有較強(qiáng)的紅色熒光，呈與細(xì)胞縱軸平行的絲狀排列，而細(xì)胞核未著色，表明為PASMCs，見圖1。

圖1 PASMCs的細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果(IF×400)

2.2 各組PASMCs miR-214表達(dá)情況 RT-PCR 結(jié)果顯示：PASMCs的miR-214表達(dá)隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)。除H6 h組與H0 h組比較，miR-214的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，H12 h組、H24 h組、H48 h組分別與H0 h組比較，PASMCs miR-214的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；另外除H0 h組與H6 h組外，其余各組之間PASMCs miR-214的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

*：P<0.05，與其他各組比較。

圖2 各組PASMCs miR-214表達(dá)情況

3 討 論

慢性阻塞性肺疾病患者在長(zhǎng)期慢性低氧條件下，PASMCs出現(xiàn)增殖、遷移，引起肺血管重建，最終導(dǎo)致低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展[4]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行原代提取和培養(yǎng)大鼠PASMCs，細(xì)胞熒光免疫方法鑒定發(fā)現(xiàn)，第5代PASMCs的純度可達(dá)97%以上，說(shuō)明組織貼壁法培養(yǎng)的原代PASMCs的純度較高，可以滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

miRNAs是一種小分子非編碼單鏈RNA，它可通過(guò)識(shí)別靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)，并與之結(jié)合阻止翻譯或?qū)е耺RNA降解，介導(dǎo)靶基因mRNA水平的降低或者抑制其蛋白的翻譯而發(fā)揮功能[5]。近年來(lái)研究表明，miRNAs與肺動(dòng)脈高壓發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miR-21、miR-30、miR-204、miR-322、miR-451等在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生中異常表達(dá)，其中過(guò)表達(dá)miR-204可抑制肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展[2-3,6]。

miR-214在多種腫瘤中的作用已經(jīng)得到了較深入研究，在乳腺癌細(xì)胞、食管鱗狀細(xì)胞癌、肝癌中miR-214呈低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-214顯著抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及肝癌細(xì)胞增殖和遷移[7-9]。近來(lái)有研究表明，大鼠心肌梗死后心室重塑過(guò)程中心肌組織中miR-214的表達(dá)上調(diào)[10]，另外miR-214在成肌細(xì)胞分化中高表達(dá)，且調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和分化[11]，這些研究表明miR-214在肌細(xì)胞中亦存在異常表達(dá)，可調(diào)控肌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

本實(shí)驗(yàn)明確了miR-214在低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，表明隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-214的表達(dá)呈逐漸增加的趨勢(shì)。Sarkar等[6]的實(shí)驗(yàn)表明，低氧24 h后PASMCs的miR-214表達(dá)較常氧狀態(tài)培養(yǎng)的PASMCs增加2倍，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，筆者推測(cè)miR-214可能參與了低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖、遷移過(guò)程，提示miR-214可能對(duì)PASMCs的生物學(xué)行為調(diào)控有重要作用。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)深入研究miR-214在PASMCs中的作用及機(jī)制，探討其在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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The expression changes of miR-214 in hypoxic induced pulmonary artery smooth muscle cells of rats*

YangJiao1,WuXuwei2,ZhangLiyan1,XiaoYi2,ZhangYuxuan2,LiYanli2,XingXiqian2△

(1.FirstDepartmentofRespiratory,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China;2.FirstDepartmentofRespiratory,theAffiliatedYan′anHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650051,China)

Objective To observe the changes of microRNA-214 (miR-214) expression in rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) induced by different hypoxia time,and lay the foundation to explore the effect and mechanism of regulation of miR-214 on PASMCs proliferation.Methods The primary cultured PASMCs were cultured under hypoxic 0 h,6 h,12 h,24 h,48 h,respectively.The real time quantitative PCR was used to detect miR-214 expression in each group PASMCs.Results The expression of miR-214 in hypoxia group PASMCs was sustained as time increased,apart from hypoxic hypoxia 6h group and 0h group,the expression of miR-214 was no significant difference (P>0.05);the expression of miR-214 among other groups PASMCs was significantly different (P<0.05).Conclusion The expression of miR-214 in PASMCs increased after induction of hypoxia.We speculated that miR-214 may be involved in the regulation of hypoxia induced PASMCs proliferation.

MiRNA-214;anoxia;pulmonary artery smooth muscle cells

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.19.003

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81100037，81360049)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011FB154，2013FZ231，2013FZ230)。

楊姣(1980-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

△通訊作者，Tel：15911743143；E-mail：xingxiqianmd@yahoo.com。

R363

A

1671-8348(2015)19-2600-02

2014-10-18

2015-03-11)