STR-PCR在異基因造血干細胞移植中植入效果監(jiān)測的應用

張 濤，王 芳，朱素敏，毛 偉，黃 霞

(重慶市血液中心輸血研究所 400015)

論著·臨床研究

STR-PCR在異基因造血干細胞移植中植入效果監(jiān)測的應用

張 濤，王 芳，朱素敏，毛 偉，黃 霞△

(重慶市血液中心輸血研究所 400015)

目的 建立適用于重慶地區(qū)造血干細胞移植后監(jiān)測的PCR擴增熒光標記短串聯(lián)重復序列(STR-PCR)檢測方法，為造血干細胞移植療效評價提供可靠依據。方法收集術前供者、受者EDTA抗凝靜脈血及受者術后不同時間EDTA抗凝靜脈血，采用STR-PCR技術對65例allo-HSCT患者的15個STR位點和1個性別位點進行分析。結果65例異基因造血干細胞移植術的病例，術后檢測患者STR位點呈現(xiàn)受者源、供者源和供受者嵌合3種狀態(tài)，有54例的移植后監(jiān)測呈現(xiàn)供者源狀態(tài)，8例移植后監(jiān)測到嵌合體狀態(tài)，3例移植后監(jiān)測呈現(xiàn)受者源狀態(tài)，且發(fā)現(xiàn)3種狀態(tài)之間可相互轉化，每種狀態(tài)的最早檢出時間和持續(xù)時間及轉化時間存在差異,其中出現(xiàn)供者源狀態(tài)的最早時間是術后第17天，持續(xù)最長時間為7多個月。而出現(xiàn)嵌合狀態(tài)的最早時間為術后第16天，最晚在移植后5個月才監(jiān)測到嵌合。在嵌合持續(xù)時間上，持續(xù)時間最短為2個月，持續(xù)時間最長者達7個月。結論allo-HSCT患者術后STR位點轉化情況存在差異，要建立起適用于該地區(qū)的STR-PCR方法需要正確留取供受者標本，同時應掌握好恰當?shù)臋z測時機和適宜的STR位點。

造血干細胞移植；PCR擴增熒光標記；短串聯(lián)重復序列；效果監(jiān)測

造血干細胞移植術后植入狀況的監(jiān)測對于判斷移植成功與否及疾病轉歸具有重要影響[1]，一直以來也是臨床醫(yī)生較為關注的一個問題。近年來通過PCR擴增熒光標記的短串聯(lián)重復序列(shore tandem repeat,STR)并結合毛細管電泳技術，可以敏感顯示出造血干細胞移植物的植入狀態(tài)，目前已有諸多文獻報道了其在造血干細胞移植后監(jiān)測中的應用價值[2-5]。但限于技術支持、標準缺乏等方面的原因，臨床對這一技術的應用仍少見和不規(guī)范，實驗人員對監(jiān)測時機、位點選擇等缺乏統(tǒng)一意見。因此，筆者擬采用STR-PCR方法，對重慶地區(qū)65例接受異基因造血干細胞移植術患者移植前、后及供者的基因型進行檢測和追蹤監(jiān)測，探討STR-PCR方法在異基因造血干細胞移植植入監(jiān)測中有關監(jiān)測時機、位點選擇、指導意義等方面的具體應用，以及建立適用于本地區(qū)人群特點的異基因造血干細胞移植植入后的STR-PCR監(jiān)測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究者來自第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院、第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院等幾所三甲醫(yī)院血液科，于2009～2012年行異基因造血干細胞移植的血液病患者共計65例。其中外周血干細胞移植60例，臍帶血移植5例。其中男30例，女35例；患者移植年齡0.9～58.0歲，中位年齡29歲；診斷為白血病患者51例，地中海貧血1例，再生障礙性貧血6例，骨髓增生障礙綜合征4例，淋巴瘤3例，免疫缺陷型高免疫球蛋白M(IgM)連鎖血癥1例。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集前與臨床醫(yī)生溝通，交流STR-PCR技術要點、實驗原則、臨床意義等。按照實驗設計要求，移植前收集供、受者術前新鮮EDTA抗凝靜脈血5 mL即時送檢，移植后每7～15天收集1次受者外周血樣，至受者達到可評價的終點(即臨床治愈或死亡)時為止。

表1 65例造血干細胞移植病例植入存活狀況檢測結果(n)

表2 存在嵌合現(xiàn)象的移植病例嵌合監(jiān)測情況

1.2.2 基因組DNA提取 分別取新鮮EDTA抗凝全血300 μL，按Gentra鹽析法DNA提取試劑盒說明的步驟進行DNA提取。用紫外分光光度儀測定DNA水平后4 ℃保存。

1.2.3 DNA擴增程序 對16個STR位點(D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539D、2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA和Amelogenin性別判斷標記)進行PCR復合擴增：PCR反應總體積25 μL，其中含Re-mix液10 μL，Primer set液5 μL，Gold Taq酶0.5 μL，模板DNA 10 μL。按下述條件進行PCR反應(2700型擴增儀)：95 ℃11 min→(94 ℃ 1 min→59 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min)×28 個循環(huán)→60 ℃ 60 min→4～25 ℃保溫。

1.2.4 電泳樣品制備 取1.5 μL擴增產物,加入Hi-Di甲酰胺10.0 μL和GeneScan-500Liz分子量標記0.7 μL對擴增產物進行變性，按1.5∶10.0∶0.7比例混勻后于95 ℃變性3 min,隨即冰浴3 min。

1.2.5 電泳 取電泳樣品2 μL于96孔板內,ABI 3100利用POP-4(Performance Optimized Polymer4)膠、36 cm毛細管進行全自動電泳。電壓3 000 V收集1.5 h。利用Data Collection收集數(shù)據。用Gene-MapperTMSoftware version 3．5根據DNA片斷長度及等位基因梯分析各位點基因型。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，分類變量資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 65例造血干細胞移植病例植入存活狀況檢測結果 65例造血干細胞移植病例中，有2例僅監(jiān)測到受者源狀態(tài)，沒有出現(xiàn)供者基因型，顯示移植失敗。54例監(jiān)測完全表現(xiàn)為供者源型，其中監(jiān)測到出現(xiàn)供者源狀態(tài)的最早時間是術后第17天，最長時間為7個多月后患者仍為供者源狀態(tài)。其余8例監(jiān)測到有供受者嵌合狀態(tài)，其中2例先為供者源狀態(tài)后轉化為嵌合狀態(tài)，2例先由嵌合狀態(tài)最終轉化為供者源狀態(tài)，此4例轉化時間均存在差異。其余4例監(jiān)測一直為嵌合狀態(tài)。監(jiān)測出現(xiàn)嵌合狀態(tài)的最早時間為術后第16天，最晚在移植后5個月。在嵌合持續(xù)時間上，持續(xù)時間最短為2個月，持續(xù)時間最長者達7個月。同時根據監(jiān)測結果，發(fā)現(xiàn)HLA-ABDR不全相合移植和全相合移植之間移植效果存在差異，3/6～5/6相合移植中監(jiān)測到轉化為供者源狀態(tài)的比例是58%，而6/6相合移植中轉化為供者源狀態(tài)的比例是92.45%，兩組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.90，P<0.01)，HLA全相合移植效果優(yōu)于3/6～5/6相合移植，見表1。

2.2 8例監(jiān)測到嵌合狀態(tài)患者的具體結果 不同患者嵌合狀態(tài)的出現(xiàn)時間并不一致，即使是同一患者，其嵌合狀態(tài)也存在變化。受嵌合比例的變化和檢測能力的影響，在具體檢出嵌合體的位點上也存在變化。即使已全轉為供者源狀態(tài)后患者仍有可能轉變?yōu)榍逗象w狀態(tài)，通過臨床信息追蹤，發(fā)現(xiàn)嵌合狀態(tài)的出現(xiàn)常伴隨患者疾病復發(fā)或加重甚至死亡等情況，且65例病例中在整個監(jiān)測過程中監(jiān)測到有嵌合現(xiàn)象的患者疾病預后均較差，見表2。

表3 16例HSCT患者中15個STR基因位點的區(qū)分度

2.3 排除性別位點后的15個STR基因位點的區(qū)分度 由于醫(yī)院采集標本的困難及患者依從性的原因，65例病例患者在移植前和移植后均留有標本進行STR檢測，并能與供者的STR結果進行比較的例數(shù)為16例。計算這16例患者移植前后15個STR位點的各自的區(qū)分度發(fā)現(xiàn)，區(qū)分度最低者TPOX位點為50.00%，最高者D8S1179位點為93.78%，其余多數(shù)位點區(qū)分度波動在75.00%～87.50%，平均區(qū)分度為78.75%,見表3。

3 討 論

STR由于具有高度的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性，作為遺傳學DNA分子標記，目前已廣泛應用于遺傳制圖、連鎖性分析、親子鑒定、疾病基因定位和物種多態(tài)性研究等諸多領域[6]。但在各個地區(qū)，具體應用STR-PCR技術時均面臨諸多的實際問題,比如標本的留取，檢測時機及檢測位點的選取等。如何建立適用于本地區(qū)的異基因造血干細胞移植植入后的STR-PCR監(jiān)測方法，無疑值得探討。

首先面臨的一個問題便是監(jiān)測標本的選擇問題。在已有的研究中，有選取患者移植前后血液標本進行比對的，有選取患者移植后血液標本和口腔黏膜標本進行比對的，在這些研究中，往往忽略了對供者標本的留取并對其STR位點進行分析和比對。單純留取患者移植前后血液標本進行自身比對或者移植后與口腔黏膜標本進行自身比對，均不能直觀、可靠地作為參考，并且有研究報道隨著移植時間的延長，患者口腔黏膜也有轉化為供者型的可能。本實驗中留取移植前供、受者血液標本進行STR位點分析，移植后再留取患者標本進行STR位點分析，并與移植前標本及供者血液標本進行比對，直觀可靠、清晰明了地觀察到患者移植后的嵌合狀態(tài)，有效排除了許多因素的影響。強調留取供者標本及移植前患者標本，雖然有可能增加患者檢測費用，但隨著此項技術的普及和檢測標本量的增加，相關的檢測費用會進一步下降。

其次，應用STR-PCR技術時監(jiān)測時機的選擇也是一個值得重視的問題。嵌合體的形成是一個動態(tài)變化過程。完全的供者源狀態(tài)和混合嵌合體可以出現(xiàn)在移植后的不同時期,并可隨病情的演化和時間的推移而相互轉化,因此對嵌合體進行持續(xù)監(jiān)測比間斷性監(jiān)測更具有臨床指導意義。只有選擇了適當?shù)臋z測時間,才能更好地監(jiān)測到嵌合體的變化狀況及獲得有意義的信息,以便及時做出相應的治療措施。在本實驗中，觀察到了65例病例中轉變?yōu)楣┱咝偷淖钤鐣r間和最遲時間，同時也觀察到嵌合體出現(xiàn)的最早時間和最遲時間，并了解了嵌合體可以長期持續(xù)存在一段時間等情況。綜合已有的研究報道，筆者認為移植后最遲不超過7 d即應留取移植檢測標本，在最初的前3個月內，應每7～15天留取標本，加強早期的移植后患者嵌合率的監(jiān)測。隨著病情發(fā)生變化，更應及時留取標本，以便發(fā)現(xiàn)移植后的轉變和發(fā)展。

最后，STR位點選擇是PCR-STR技術在干細胞移植中能否應用成功的關鍵。STR位點等位基因數(shù)目眾多，分布情況存在人群、地區(qū)差異性[7],如何選擇位點錯配少,個體識別能力高、易于分型而且等位基因頻率在人群中分布較好的STR位點，真正建立適用于本地區(qū)的異基因干細胞移植植入后的PCR-STR監(jiān)測方法，是本研究主要探討的問題。本實驗中筆者與重慶市司法鑒定所合作，根據其既往的STR群體遺傳資料研究表明，15個STR基因座(CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA)在重慶地區(qū)漢族人群中有很高的遺傳多態(tài)性，累積DP>0.999 999 999，累積PE值為0.999 999 042，適用于作為重慶地區(qū)漢族人群個體識別、親子鑒定的科學依據及建立該地區(qū)漢族人群的STR基因數(shù)據庫的基礎數(shù)據[8]。因此，筆者選擇這15個位點進行復合擴增用于HSCT移植后分析的位點。結果顯示，選擇的15個STR位點具有高度多態(tài)性和區(qū)別能力,其中區(qū)分度最高者達93.78%,最低的區(qū)分度亦有50.00%?？紤]到進行統(tǒng)計分析的這16例患者大多數(shù)為直系親屬間移植，STR位點的同源性降低了檢測的區(qū)分度，倘若是在非親緣關系移植間的監(jiān)測中，則15個STR位點的檢測區(qū)分度應尚能大幅提升，因此15個STR基因位點對患者移植前后的移植狀態(tài)能很好地監(jiān)測,可聯(lián)合應用于移植后植入狀態(tài)的監(jiān)測。

綜上所述，在干細胞移植后正確留取供、受者標本，掌握好恰當?shù)臋z測時機，采用適宜的STR位點進行STR-PCR監(jiān)測，建立起真正適用于本地區(qū)的STR-PCR方法，可以早期識別移植物植入、檢測殘留微小病變、預測移植效果等，這樣才能真正發(fā)揮STR-PCR方法的最大優(yōu)勢。

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Application of STR-PCR in monitoring the effect of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation*

ZhangTao,WangFang,ZhuSumin,MaoWei,HuangXia△

(TheTransfusionInstitute,ChongqingBloodCenter,Chongqing400015,China)

Objective To establish multiple short tandem repeat (STR) amplification by fluorescence labeling polymerase chain reaction (PCR) for monitoring the effect of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.Methods Sixty-five patients were analyzed.DNA from peripheral blood of donors and recipients in pre transplantation and post transplantation were extracted,15 STR loci and sexual loci were amplified by PCR.Results After allo-HSCT,54 patients obtained type of donors,but 3 patients did not;eight patients showed mixed chimerism.Two cases of type of donor converted into mixed chimerism and two cases of mixed chimerism converted into type of donors after some time.The time of earliest detection,duration and transformation of each state was different.The earliest detection showed on the 16th day after surgery,and the last one showed five months later.As to the duration,the shortest and longest were two months and seven months,respectively.Conclusion The key factors that significantly influence the application of STR-PCR in monitoring the effect of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation were samples,STR loci and proper monitoring time.So to establish the suitable method for this region could truly take maximum advantage of the PCR-STR method.While a appropriate detecting time and STR loci should be chose.

hematopoietic stem cell transplantation;STR-PCR;effect examination

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.19.014

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學科研項目資助(2008-2-265)。

張濤(1982-)，主治醫(yī)師，在讀碩士，主要從事輸血醫(yī)學相關研究。

△通訊作者,Tel：13018355909；E-mail：xiahuangyy@163.com。

R551.3

A

1671-8348(2015)19-2632-03

2014-12-18

2015-02-26)