佛甲草對(duì)S180荷瘤小鼠氧化應(yīng)激和腫瘤免疫的影響

吳麗珍，曹性玲，李 歡，麻海娟，黃志華，周 青

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州 341000)

論著·基礎(chǔ)研究

佛甲草對(duì)S180荷瘤小鼠氧化應(yīng)激和腫瘤免疫的影響

吳麗珍，曹性玲，李 歡，麻海娟，黃志華，周 青△

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州 341000)

目的 探討佛甲草(SLT)提取物對(duì)S180荷瘤小鼠的抗腫瘤生長(zhǎng)、外周血白細(xì)胞分類、血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平的影響。方法采用小鼠右前肢腋部皮下接種S180細(xì)胞建立移植瘤模型，觀察SLT提取物4、8 g/kg體質(zhì)量連續(xù)給藥14 d。觀察小鼠體質(zhì)量變化，計(jì)算腫瘤、胸腺及脾臟指數(shù)，檢測(cè)小鼠外周血中白細(xì)胞分類，測(cè)定小鼠血清SOD、GSH-Px的活性及MDA、NO的水平。結(jié)果經(jīng)SLT治療后，S180荷瘤小鼠體質(zhì)量明顯高于環(huán)磷酰胺(CTX)組，腫瘤指數(shù)明顯低于模型組和CTX組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且能有效的調(diào)節(jié)荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)；外周血中性粒細(xì)胞數(shù)/白細(xì)胞總數(shù)(GR%)和單核細(xì)胞/白細(xì)胞總數(shù)(MO%)明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而淋巴細(xì)胞/白細(xì)胞總數(shù)(LY%)明顯高于模型組(P<0.05)，血清SOD、GSH-Px活性明顯高于模型組(P<0.05)，血清MDA水平明顯低于模型組和CTX組(P<0.05)，血清中NO水平明顯高于模型組和CTX組(P<0.05)。結(jié)論SLT對(duì)S180荷瘤小鼠有抗腫瘤作用，其抗腫瘤機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)腫瘤免疫有關(guān)。

佛甲草；氧化性應(yīng)激；腫瘤免疫；抗腫瘤作用

佛甲草(sedum lineare thunb,SLT)又名鼠牙半支蓮、禾雀劂等，為景天科佛甲草屬多年生草本植物，SLT全草藥用，性味甘寒，具有清熱、解毒、消腫等功效，民間用于治療黃疸、遷延性肝炎、咽喉腫痛、痢疾等癥?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，許多清熱解毒中藥具有抗腫瘤的作用[1]，結(jié)合SLT具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化[2]及抗急、慢性炎性反應(yīng)并具有免疫調(diào)節(jié)功能[3]的前期研究結(jié)果，SLT很可能具有抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)以小鼠S180移植性腫瘤為模型，從腫瘤免疫和氧化應(yīng)激的角度分析SLT提取物的抗腫瘤作用機(jī)制，為SLT治療惡性腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取SPF級(jí)昆明小鼠60只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003;合格證號(hào)：4304702309]。S180瘤株，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥研究所購(gòu)進(jìn)，贛南醫(yī)學(xué)院科研中心傳代培養(yǎng)。SLT提取物由贛南醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心制備，臨用前用雙蒸水配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)白色粉狀針劑，0.2 g/支，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：12041125；小鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、一氧化氮(nitric oxide,NO)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

表1 SLT對(duì)S180荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響

*:P<0.05，#:P<0.05,與模型組比較；△:P<0.01，▲:P<0.01與CTX組比較;-：表示此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

1.2.1 造模與給藥方法 SPF級(jí)雄性昆明種小鼠60只，分成5組，分別為健康對(duì)照組、S180荷瘤模型組、環(huán)磷酰胺組，4 g/kg SLT治療組、8 g/kg SLT治療組。參照文獻(xiàn)[4]方法，無(wú)菌條件下抽取傳第3代后接種7 d的S180瘤源小鼠的腹腔積液，離心,棄上清液,無(wú)菌生理鹽水調(diào)至細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，每只小鼠右腋部皮下接種0.2 mL，建立小鼠實(shí)體瘤模型。健康對(duì)照組小鼠每只接種0.2 mL生理鹽水。健康對(duì)照組和模型組小鼠分別灌胃生理鹽水10 mL/kg；環(huán)磷酰胺組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg；SLT治療組分別給予40 g/mL或80 g/mL的SLT，按10 mL/kg灌胃，每天1次，連續(xù)14 d。

1.2.2 小鼠體質(zhì)量和腫瘤指數(shù)、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)測(cè)定 末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，稱體質(zhì)量，取出腫瘤，用電子天平稱質(zhì)量，計(jì)算指數(shù)=腫瘤/脾臟/胸腺質(zhì)量(mg)÷體質(zhì)量(g)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 白細(xì)胞分類末次給藥24 h后，小鼠摘眼球采血。取肝素抗凝血20 μL，加入180 μL紅細(xì)胞裂解液，混勻后，靜置10 min，加入2 mL磷酸鹽緩沖液 (PBS)，600 r/min離心5 min，棄上清液，100 μL PBS 重懸白細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。采用前向角和側(cè)向角將白細(xì)胞分成淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞3群，分別計(jì)算3種細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.2.4 血清SOD、GSH-Px活性及MDA、NO含量檢測(cè) 末次給藥24 h后，小鼠摘眼球采血，4 ℃，800 r/min，離心10 min，分離血清，于-80 ℃保存。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)各組小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA、NO水平的變化。

2 結(jié) 果

2.1 SLT對(duì)小鼠體質(zhì)量、腫瘤指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)比較 與健康對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量及胸腺指數(shù)下降，脾指數(shù)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，SLT治療組小鼠腫瘤指數(shù)及脾臟指數(shù)降低，胸腺指數(shù)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CTX組小鼠腫瘤指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CTX組比較，SLT治療組小鼠體質(zhì)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 SLT對(duì)小鼠血液中白細(xì)胞分類的影響 與健康對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例升高(P<0.01,P<0.05)，淋巴細(xì)胞比例降低(P<0.01)。與模型組比較，兩種劑量SLT治療組中性粒細(xì)胞比例降低(P<0.01)，淋巴細(xì)胞比例升高(P<0.01)，8 g/kg SLT治療組單核細(xì)胞比例降低(P<0.05)。與CTX組比較，SLT治療組中性粒細(xì)胞比例降低(P<0.01)，淋巴細(xì)胞比例升高(P<0.01)，見表2。

表2 SLT對(duì)S180荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞分類的影響

*:P<0.05，#：P<0.01，與模型組比較；△:P<0.01，與CTX組比較;-：表示此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

2.3 SLT對(duì)小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響 與健康對(duì)照組比較，模型組小鼠血清SOD和GSH-Px活性降低，MDA及NO水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，CTX組小鼠血清SOD和GSH-Px活性升高(P<0.01)，MDA和NO水平變化不明顯；SLT治療組血清SOD和GSH-Px活性及NO水平升高，MDA水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與CTX組比較，SLT治療組GSH-Px活性及MDA水平降低，NO水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 SLT對(duì)S180荷瘤小鼠血清SOD和GSH-Px活性及MDA和NO水平的影響

續(xù)表3 SLT對(duì)S180荷瘤小鼠血清SOD和GSH-Px活性及MDA和NO水平的影響

*:P<0.05，#:P<0.01，△:P<0.01，與模型組比較；▲:P<0.05，●:P<0.01，○:P<0.01，與CTX組比較;-：表示此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

3 討 論

惡性腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一?！吨袊?guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒》2011年的統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國(guó)城市居民的惡性腫瘤病死率約為172.33/10萬(wàn)，占城市居民疾病死因的27.79%；在農(nóng)村地區(qū)，惡性腫瘤病死率約為150.83/10萬(wàn)，占農(nóng)村居民疾病死因的23.62%，均居第1位。如何有效的預(yù)防和治療惡性腫瘤，成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重要課題之一。目前，臨床治療腫瘤藥物幾乎都存在細(xì)胞毒作用，因此尋找低毒高效的天然抗腫瘤藥物一直是近年研究的熱點(diǎn)。陳雨潔[5]研究發(fā)現(xiàn)SLT不同提取部位及總黃酮提取物具有體外抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SLT可降低腫瘤指數(shù)，體質(zhì)量較陽(yáng)性藥物CTX組高，提示其具有抗腫瘤作用的同時(shí)不良反應(yīng)較化療藥CTX小。

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的基本指標(biāo)。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)密切相關(guān)，淋巴細(xì)胞在機(jī)體抵抗、防御腫瘤的免疫功能中起著重要作用。這是因?yàn)樵谀[瘤抗原促發(fā)下機(jī)體中產(chǎn)生的效應(yīng)淋巴細(xì)胞(M淋巴細(xì)胞)對(duì)該腫瘤細(xì)胞有著特異的溶細(xì)胞作用。另一方面，腫瘤細(xì)胞與其相應(yīng)抗體結(jié)合后，可被非效應(yīng)淋巴細(xì)胞(未經(jīng)腫瘤抗原致敏的正常淋巴細(xì)胞)所殺傷。腫瘤微環(huán)境中存在腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞，可通過(guò)分泌彈性蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶-9促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[6-9]；通過(guò)合成和分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子而改變腫瘤局部微環(huán)境中細(xì)胞的組成[10-11]等多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SLT治療明顯改善了荷瘤小鼠脾指數(shù)的異常升高及胸腺指數(shù)的下降，外周血中性粒細(xì)胞顯著降低而淋巴細(xì)胞明顯升高，提示SLT提取物可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫發(fā)揮抗腫瘤作用。

氧化應(yīng)激參與了致癌基因的突變、原癌基因活化、腫瘤抑制基因失活，具有致癌潛力。機(jī)體微環(huán)境處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶和生物大分子活性及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、壞死等生理過(guò)程異常，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。SOD是一種過(guò)氧化物分解酶，它是體內(nèi)重要的抗氧化防御物質(zhì)，體內(nèi)SOD活性愈高，自由基清除速度愈快。GSH-Px是體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化氧化酶，它的主要功能是還原過(guò)氧化物，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，部分脂肪酸會(huì)氧化分解為一系列復(fù)雜的化合物，其中就包括MDA，此時(shí)可通過(guò)檢測(cè)MDA水平來(lái)反應(yīng)脂質(zhì)過(guò)氧化水平。NO是殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)分子，研究發(fā)現(xiàn)高水平NO可通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子結(jié)合生成氮/氧自由基，損傷DNA，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性的途徑來(lái)抗腫瘤作用[12]。在本研究中，SLT治療后，荷瘤小鼠血清SOD、GSH-Px和NO水平增高，MDA含量降低，說(shuō)明SLT能提高機(jī)體的抗氧化酶活性，抑制自由基的產(chǎn)生及其引起的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并清除氧自由基，使S180荷瘤小鼠機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激受到抑制，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。提示SLT提取物可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮其抗腫瘤作用。

綜上所述，SLT提取物具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性，其抗腫瘤機(jī)理與抑制氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)腫瘤免疫有關(guān)。

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Antitumor activity of sedum lineare thunb by suppressing oxidative stressand modulating tumor immune*

WuLizhen,CaoXingling,Lihuan,MaHaijuan,HuangZhihua,ZhouQing△

(BasicMedicineCollege,GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000,China)

Objective To observe the antitumor activity of sedum lineare thunb(SLT) and it′s affection on antioxidation and tumor immunology in S180-bearing mice.Methods S180-bearing mice model were established by subcutaneously inoculating S180 ascitic tumor into the right armpit.From the second day,the mice were treated with normal saline,cyclophosphamide (50 g/kg) or two doses of SLT(4,8 g/kg) through intragastric administration,and the process extent 14 d.After the last administration,the mice body weight and the index of tumor,spleen and thymus were calculated,classification of white blood cells in peripheral blood was tested,and the activity of SOD and GSH-Px as well as the content of MDA and NO in serum were measured.Results The body weight of mice treatmented with SLT was dramaticlly higher than those of the CTX (P<0.05).Compare with the model group,SLT groups showed decreases in tumors index (P<0.05),spleen index (P<0.05),percentage of peripheral blood neutrophil (P<0.05) and monocyte (P<0.05),and increases in thymus index (P<0.05) and percentage of lymphocyte (P<0.05).The activity of SOD and GSH-Px and NO level in the SLT groups mice′s serum were significantly higher than those of the model group (P<0.05),while the content of MDA in the SLT groups mice′s serum was markedly lower than those of the model and CTX groups(P<0.05).Conclusion SLT has antitumor activity in S180-bearing mice bysuppressing oxidative stress and modulating tumor immune.

sedum lineare;oxidative stress;tumor immune;antitumor activity

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.19.007

江西省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)目(20141117)。

吳麗珍(1981-)，實(shí)驗(yàn)師，本科，主要從事中藥藥理研究。

△通訊作者，Tel:18970786170；E-mail:18970786170@163.com。

R285

A

1671-8348(2015)19-2613-03

2015-01-16

2015-03-18)