白藜蘆醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化改變的影響

雷宇鵬，曾振國(guó)，胡德泉

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科 330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 330006;3.南昌大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科 330031)

·論 著·

白藜蘆醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化改變的影響

雷宇鵬1，曾振國(guó)2△，胡德泉3

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科 330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 330006;3.南昌大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科 330031)

目的 探討白藜蘆醇對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞極化表型改變的影響。方法體外培養(yǎng)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞在六孔板孵育12 h，分為磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照組、LPS(100 ng/mL)組、LPS(100 ng/mL)+白藜蘆醇(30 μmol/L)組，LPS+白藜蘆醇組在加入LPS前預(yù)先加入白藜蘆醇孵育12 h；上述細(xì)胞在LPS刺激12 h后分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液；實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)經(jīng)典的炎癥活化型巨噬細(xì)胞(M1)型相關(guān)基因iNOS、TNF-α mRNA表達(dá)，以及替代活化巨噬細(xì)胞(M2)型相關(guān)基因IL-10、PPARγ 和Arg-1 mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)細(xì)胞iNOS、Arg-1蛋白表達(dá)，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中炎性因子IL-12 p40、IL-10和TNF-α的水平。結(jié)果RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與LPS組相比，M1型相關(guān)基因iNOS、TNF-α mRNA較LPS+白藜蘆醇組顯著上升(P<0.05)，而M2型相關(guān)基因IL-10、PPARγ、Arg-1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LPS組iNOS蛋白水平顯著高于LPS+白藜蘆醇組(P<0.05)，而Arg-1蛋白水平顯著低于LPS+白藜蘆醇組(P<0.05)。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LPS組培養(yǎng)上清液中炎性因子IL-12 p40、TNF-α水平顯著高于LPS+白藜蘆醇組(P<0.05)，而IL-10和水平顯著低于LPS+白藜蘆醇組(P<0.05)。結(jié)論白藜蘆醇可能促進(jìn)了LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞向M2型極化改變。

巨噬細(xì)胞；白藜蘆醇；極化

膿毒癥是指因感染而導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，常并發(fā)于外科大手術(shù)后、大面積燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克等疾病，屬臨床常見(jiàn)危重疾病。該病病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，患者常出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，嚴(yán)重者最終發(fā)展為多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。美國(guó)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，該病每年導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過(guò)22.5萬(wàn)人[1]，并以每年1.5%～1.8%的速度增長(zhǎng)[2]。巨噬細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體各組織和器官中，是固有免疫反應(yīng)的重要組成部分，膿毒癥時(shí)巨噬細(xì)胞分泌釋放的大量炎癥因子，是機(jī)體免疫反應(yīng)的重要構(gòu)成環(huán)節(jié)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是一類具有極強(qiáng)功能可塑性的免疫細(xì)胞，根據(jù)所處微環(huán)境不同，可被誘導(dǎo)分化為經(jīng)典的炎癥活化型巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage，M1)和替代活化巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage，M2)[3]。巨噬細(xì)胞的不同極化方式，決定了其在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所發(fā)揮的不同作用[4]。調(diào)控膿毒癥時(shí)巨噬細(xì)胞的極化過(guò)程，進(jìn)而控制膿毒癥疾病過(guò)程，具有十分重要的科研和臨床價(jià)值。

作為一類多酚類化合物，白藜蘆醇廣泛存在于葡萄、花生等植物中，并具有良好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤活性等藥理作用[5]。有研究表明，白藜蘆醇能顯著降低脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)所致巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)，下調(diào)包括IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6等炎癥介質(zhì)的表達(dá)[6]，但白藜蘆醇在該過(guò)程中是否影響了巨噬細(xì)胞極化改變，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞，探討白藜蘆醇對(duì)其炎癥表達(dá)及極化表型的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7巨噬細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，胎牛血清(美國(guó)HyClone)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)，LPS(E.coli 0111:B4，美國(guó)Sigma-Aldrich)，白藜蘆醇(美國(guó)Sigma)，TRIzol?Reagent(美國(guó)Invitrogen)，實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara)，兔抗鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體、兔抗鼠精氨酸酶1(arginase 1，Arg-1)抗體(美國(guó)Abcam)，ELISA試劑盒：小鼠IL-12亞單位p40(IL-12 p40，上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司)、TNF-α和IL-10(北京達(dá)科為生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)及分組 體外培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞在六孔板孵育12 h，分為磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照組、LPS(100 ng/mL)組、LPS(100 ng/mL)+白藜蘆醇(30 μmol/L)組，LPS+白藜蘆醇組在加入LPS前預(yù)先加入白藜蘆醇孵育12 h；上述細(xì)胞在LPS刺激12 h后分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，用于各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.2 ELISA檢測(cè) 檢測(cè)培養(yǎng)上清液中炎癥因子IL-12 p40、TNF-α及IL-10表達(dá)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè) 檢測(cè)細(xì)胞M1型相關(guān)基因iNOS、TNF-α mRNA表達(dá)以及M2型相關(guān)基因IL-10、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和Arg-1 mRNA表達(dá)：采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，總RNA提取質(zhì)量通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證，總RNA水平采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定；Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，擴(kuò)增采用的所有基因引物購(gòu)買(mǎi)自生工生物工程(上海)有限公司。RT-qPCR引物序列，(1)M1型相關(guān)基因，iNOS上游：CCC TTC CGA AGT TTC TGG CAG CAG C，下游：GGC TGT CAG AGA GCC TCG TGG CTT TGG；TNF-α上游：CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT CT，下游：GCT ACG ACG TGG GCT ACA G；(2)M2型相關(guān)基因，IL-10上游：CCA AGC CTT ATC GGA AAT GA，下游：TTT TCA CAG GGG AGA AAT CG；PPARγ 上游：TCG CTG ATG CAC TGC CTA TG，下游：GAG AGG TCC ACA GAG CTG ATT；Arg-1上游：CTC CAA GCC AAA GTC CTT AGA，下游：AGG AGC TGT CAT TAG GGA CAT C。所有目的基因選取β-actin作為內(nèi)參，上游：ATG TGC AAA AAG CTG GCT TTG，下游：ATT TGT GGT GGA TGA TGG AGG；目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct計(jì)算。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 檢測(cè)細(xì)胞iNOS、Arg-1蛋白表達(dá)：各組細(xì)胞收集后加入RIPA 蛋白裂解液，冰浴20 min后12 000 g離心30 min(4 ℃)，總蛋白于-80 ℃冰箱保存，Bradford法進(jìn)行蛋白定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，恒定電流100 mA，恒溫4 ℃，轉(zhuǎn)膜2 h至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂牛奶TBST溶液封閉1 h后，分別加入一抗(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜，二抗(1∶4 000)室溫1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光，Quantity One軟件進(jìn)行圖像灰度分析，所有目的蛋白灰度值與β-actin灰度值之比為所需結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞炎癥因子IL-12 p40、TNF-α及IL-10表達(dá)的影響 ELISA檢測(cè)顯示，LPS組較LPS+白藜蘆醇組培養(yǎng)上清液中炎性因子IL-12 p40、TNF-α水平顯著升高，而IL-10水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞M1型和M2型基因表型的影響 RT-qPCR檢測(cè)表明LPS組較LPS+白藜蘆醇組M1型相關(guān)基因iNOS、TNF-α mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；M2型相關(guān)基因IL-10、PPARγ、Arg-1 mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞炎癥因子IL-12 p40、TNF-α及IL-10表達(dá)的影響

*：P<0.05，與PBS組比較；#：P<0.05，與LPS組比較。

表2 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞M1型和M2型基因mRNA表型的影響

*：P<0.05，與PBS組比較；#：P<0.05，與LPS組比較。

2.3 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞iNOS、Arg-1蛋白表達(dá)影響 Western blot檢測(cè)表明，LPS組較LPS+白藜蘆醇組iNOS蛋白表達(dá)升高，而Arg-1表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3，圖1、2。

圖1 Western blot檢測(cè)Arg-1蛋白表達(dá)

圖2 Western blot檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)

表3 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞iNOS、Arg-1蛋白表達(dá)影響

*：P<0.05，與PBS組比較；#：P<0.05，與LPS組比較。

3 討 論

膿毒癥是入侵病原微生物與機(jī)體免疫系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)之間交互作用的結(jié)果，膿毒癥發(fā)生時(shí)，病原微生物釋放的內(nèi)毒素等激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，釋放各種細(xì)胞因子、氧自由基、趨化因子等物質(zhì)，造成過(guò)度炎性反應(yīng)，最終形成MODS和機(jī)體彌散性血管內(nèi)凝血[7-8]。該病病情兇險(xiǎn)，是世界性難點(diǎn)危重疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)膿毒癥患者的死亡率高達(dá)48.7%[9]。巨噬細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體，在膿毒癥中的發(fā)病過(guò)程中扮演十分重要的地位，它可直接殺傷侵入的病原微生物，也可通過(guò)釋放各種炎性產(chǎn)物抵御細(xì)菌侵入，是膿毒癥發(fā)病的重要因素之一。調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫狀態(tài)，防止其在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中過(guò)度活化，是解決膿毒癥的可行方式。

有研究表明，巨噬細(xì)胞是一類具有功能可塑性的免疫細(xì)胞，在機(jī)體處于不同應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，可出現(xiàn)內(nèi)在功能和外在表型變化的現(xiàn)象[10]。在LPS刺激時(shí)，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞成M1型極化表型，細(xì)胞處于激活狀態(tài)，分泌大量的炎癥因子生IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-12 等，并高表達(dá)M1型相關(guān)基因iNOS、TNF-α、CXCL9、CXCL10 等。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到細(xì)胞因子IL-4和IL-13等刺激時(shí)，則會(huì)呈現(xiàn)出M2型極化表型，分泌大量IL-10、TGF-β等抗炎介質(zhì)，并高表達(dá)PPARγ、Arg-1、YM1和FIZZ1 等基因[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞高表達(dá)炎癥因子TNF-α、IL-12 p40，以及iNOS和TNF-α mRNA，呈典型的M1型激活，與Ohashi等[12]的研究一致。

白藜蘆醇是一種多酚類植物雌激素，在葡萄、虎杖及花生中含量較高。現(xiàn)有研究表明，白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑制血小板聚集、保護(hù)心腦血管等多種作用，是一類具有極強(qiáng)生物活性的植物抗毒素[13-15]。本實(shí)驗(yàn)表明，白藜蘆醇預(yù)處理后可顯著抑制LPS誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞分泌促炎癥因子TNF-α、IL-12 p40分泌，同時(shí)促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)筆者發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇預(yù)處理的巨噬細(xì)胞高表達(dá)M2型相關(guān)基因Arg-1、PPARγ和IL-10 mRNA，上調(diào)Arg-1蛋白的同時(shí)下調(diào)iNOS蛋白表達(dá)，顯示出白藜蘆醇預(yù)處理的巨噬細(xì)胞在LPS刺激時(shí)呈現(xiàn)M2型極化表型特點(diǎn)。

綜上所述，膿毒癥時(shí)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞呈經(jīng)典的M1型極化表型；白藜蘆醇可抑制LPS所致巨噬細(xì)胞促炎癥因子分泌，上調(diào)抗炎因子的表達(dá)，誘導(dǎo)噬細(xì)胞呈的M2型極化表型改變。白藜蘆醇可調(diào)劑巨噬細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，為臨床治療膿毒癥提供了新的理論依據(jù)和思路。

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統(tǒng)計(jì)資料類型

統(tǒng)計(jì)資料共有三種類型：計(jì)量資料、計(jì)數(shù)資料和等級(jí)資料。按變量值性質(zhì)可將統(tǒng)計(jì)資料分為定量資料和定性資料。

定量資料又稱計(jì)量資料，指通過(guò)度量衡的方法，測(cè)量每一個(gè)觀察單位的某項(xiàng)研究指標(biāo)的量的大小，得到的一系列數(shù)據(jù)資料，其特點(diǎn)為具有度量衡單位、多為連續(xù)性資料、可通過(guò)測(cè)量得到，如身高、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、某一物質(zhì)在人體內(nèi)的濃度等有一定單位的資料。

定性資料分為計(jì)數(shù)資料和等級(jí)資料。計(jì)數(shù)資料為將全體觀測(cè)單位(受試對(duì)象)按某種性質(zhì)或特征分組，然后分別清點(diǎn)各組觀察單位(受試對(duì)象)的個(gè)數(shù)，其特點(diǎn)是沒(méi)有度量衡單位，多為間斷性資料，如某研究根據(jù)患者性別將受試對(duì)象分為男性組和女性組，男性組有72例，女性組有70例，即為計(jì)數(shù)資料。等級(jí)資料是介于計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料之間的一種資料，可通過(guò)半定量的方法測(cè)量，其特點(diǎn)是每一個(gè)觀察單位(受試對(duì)象)沒(méi)有確切值，各組之間僅有性質(zhì)上的差別或程度上的不同，如根據(jù)某種藥物的治療效果，將患者分為治愈、好轉(zhuǎn)、無(wú)效或死亡。

Effect of resveratrol on macrophage polarizing phenotype induced by lipopolysaccharide*

LeiYupeng1,ZengZhenguo2△,HuDequan3

(1.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China;2.IntensiveCareUnit,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China;3.DepartmentofInternalMedicine,NanchangUniversityHospital,Nanchang,Jiangxi330031,China)

Objective To investigate the effect of resveratrol on murine macrophage cell line (RAW264.7 cells) polarizing phenotype induced by lipopolysaccharide.Methods RAW264.7 mouse macrophages seeded in a 6 well plate,then randomly divided into phosphate buffer saline(PBS) control group,LPS (100 ng/mL) group,and LPS (100 ng/mL)+ resveratrol (30 μmol/L) group.In the LPS+resveratrol group,LPS was added after incubation with resveratrol for 12 h.Cells were harvested and supernatant were collected after incubation with LPS for 12 h.Both the mRNA expression levels of M1 associated markers iNOS and TNF-α and M2 associated markers IL-10,PPARγ and Arg-1 were measured by real time quantitative PCR.Expression of iNOS,Arg-1 protein were detected by Western blot,inflammatory factor IL-12 p40,IL-10 and TNF-α protein in the supernatant of were assayed by ELISA.Results PCR detection showed that the mRNA expression levels of M1 associated markers iNOS and TNF-α in the LPS group were significantly higher than that of LPS+ resveratrol group(P<0.05),but the mRNA expression levels of M2 associated markers IL-10,PPARγ and Arg-1 were significantly lower than that of LPS+ resveratrol group(P<0.05).Compared with LPS+ resveratrol group,western blot assay showed that iNOS protein level in LPS group was significantly higher than it (P<0.05),but Arg-1 protein level was significantly lower than it(P<0.05).The levels of IL-12 p40 and TNF-α in LPS group were significantly higher than that in LPS+ resveratrol group(P<0.05),but the levels of IL-10 was significantly lower than it(P<0.05).Conclusion Resveratrol may promote LPS stimulated RAW264.7 macrophage polarization to M2 phenotype.

macrophages;resveratrol;polarization

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.19.001

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160233)。

雷宇鵬(1987-)，碩士，主要從事消化疾病研究。

△通訊作者，Tel：13576056501；E-mail：zzg6501@163.com。

R392.5

A

1671-8348(2015)19-2593-03

2014-11-10

2015-03-26)