抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY轉(zhuǎn)化和菌種篩選的研究*

翁閃凡，劉 娜，張曉林

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，廣東佛山 528000)

論著·基礎(chǔ)研究

抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY轉(zhuǎn)化和菌種篩選的研究*

翁閃凡，劉 娜，張曉林

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，廣東佛山 528000)

目的篩選攜帶抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY的穩(wěn)定高產(chǎn)菌株。方法以CaCl2法制備大腸桿菌JM109感受態(tài)，將抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，對瓊脂平板上獲得的菌落進(jìn)行篩選，選出符合標(biāo)準(zhǔn)的單菌落為菌種，進(jìn)行菌種穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。用質(zhì)粒提取試劑盒檢測質(zhì)粒含量。將抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY轉(zhuǎn)染到細(xì)胞CNE-2中，四氮唑藍(lán)(MTT)比色法觀察轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒載體對細(xì)胞生長增殖的影響。結(jié)果篩選得到菌株的培養(yǎng)液中質(zhì)粒DNA含量為30 mg/mL，超螺旋DNA比例為92%。經(jīng)電泳和酶切鑒定，該菌株的50子代所攜帶質(zhì)粒與原代一致。質(zhì)粒pFY對CNE-2細(xì)胞株生長有明顯的抑制作用。結(jié)論成功篩選出攜帶抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY的穩(wěn)定高產(chǎn)菌株，為大批量制備臨床應(yīng)用級質(zhì)粒奠定了基礎(chǔ)。

鼻咽腫瘤；感受態(tài)細(xì)胞；質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化；篩選

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，其發(fā)病率居于頭頸腫瘤發(fā)病率的首位。NPC具有罕見的地理和種族分布特征。在中國南方(廣東、廣西、湖南、福建和江西)，其發(fā)病率和病死率均居世界首位[1]。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的質(zhì)粒pFY是一種能在鼻咽癌細(xì)胞中高效特異表達(dá)靶基因的質(zhì)粒，具有潛在的治療鼻咽癌的應(yīng)用前景。

目前，質(zhì)粒DNA作為核酸疫苗和基因治療載體越來越受到研究者的重視,國內(nèi)外已有上千家研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)的研究[2-3]。質(zhì)粒DNA作為基因載體比較安全、使用方便，但其在靶細(xì)胞中基因表達(dá)效率低和持續(xù)時(shí)間較短，因此質(zhì)粒介導(dǎo)的基因治療要求反復(fù)給藥并需大量藥物級質(zhì)粒DNA[4]。而篩選出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的菌種是大批量制備質(zhì)粒的首要步驟。通過實(shí)驗(yàn)，本文得到一種篩選攜有pFY的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 酵母提取物(OXIOD)；胰蛋白胨(OXIOD)；氯化鈉、瓊脂粉和氯化鈣(均為廣州化學(xué)試劑廠AR級)；氨芐青霉素(魯抗)；質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen)；四氮唑藍(lán) (MTT)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。恒溫培養(yǎng)箱(上海精誠)；振蕩培養(yǎng)箱(太倉華美HZQ-200)；核酸蛋白檢測儀(eppendorf)；高速離心機(jī)(eppendorf);凝膠成像系統(tǒng)(法國VL公司)；無菌操作臺(上海精誠)；9 cm培養(yǎng)皿(蜀牛)；50 mL或250 mL三角瓶(蜀牛)。抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY、大腸桿菌JM109、人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2分別為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌JM109感受態(tài)的制備(CaCl2法) (1) 將保藏的大腸桿菌JM109菌種，接入裝有已冷卻凝固滅菌LB瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，涂布或畫線使菌種在培養(yǎng)基生長出單菌落，將培養(yǎng)皿在恒溫培養(yǎng)箱中倒置37 ℃ 培養(yǎng)16～20 h。(2)從生長有單菌落的培養(yǎng)平皿內(nèi)，無菌挑取一個(gè)直徑約為2～3 mm的單菌落。接入裝有10 mL LB肉湯的50 mL滅菌三角瓶中，在搖床培養(yǎng)箱中，250 rpm，37 ℃培養(yǎng)9～10 h(菌體密度OD600為2.0，此時(shí)細(xì)菌處于對數(shù)生長中期)。(3)在裝有 20 mL LB的50 mL滅菌三角瓶中，無菌接入OD為2.0的大腸桿菌JM109菌液0.2 mL。在搖床培養(yǎng)箱中，250 rpm，37 ℃培養(yǎng)2～2.5 h(菌體密度OD600為0.4)。(4)在室溫條件下，將OD600為0.4的培養(yǎng)液以4 000 rpm離心5 min，棄上清液，收集菌體細(xì)胞；再加入10 mL 冰冷的0.1 M CaCl2溶液(已除菌)，并輕微搖勻。4 ℃ 4 000 rpm離心10 min，棄上清液，收集菌體細(xì)胞。加入0.8 mL(每25 mL培養(yǎng)液加入1 mL)冰冷的0.1 M的CaCl2溶液，并輕微搖勻。冰浴放置3 h，用4支已滅菌的1.0 mL EP管中無菌分裝CaCl2菌體細(xì)胞液(0.2 mL/支)，備質(zhì)粒轉(zhuǎn)化使用。

1.2.2 抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY轉(zhuǎn)化 (1) 將40 μg抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY無菌加入裝有0.2 mL大腸桿菌JM109感受態(tài)的EP管中。輕柔混勻后，于冰浴靜置40 min；冰浴好后，把EP管放于恒溫水浴鍋中，42 ℃靜置水浴90 s；再及時(shí)把EP管迅速轉(zhuǎn)移至冰浴2～3 min；向EP管中加入0.5 mL已滅菌的LB肉湯，37 ℃放置60 min，以使細(xì)菌細(xì)胞復(fù)原。(2)無菌取樣0.1 mL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液，接入到裝有凝固LB瓊脂平板(含有50 ng/mL氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿中進(jìn)行涂布，另取0.1 mL無菌水涂布做空白對照組，將培養(yǎng)皿在恒溫培養(yǎng)箱中倒置37 ℃ 培養(yǎng)16～20 h，觀察平板菌落形態(tài)，要求每個(gè)平板含有菌落20～40 cfm，空白對照板菌落數(shù)為零。

1.2.3 菌種篩選 初篩：在培養(yǎng)好的平板中，無菌挑取單菌落20個(gè)，分別接入裝有50 mL LB(含有50 ng/mL 氨芐青霉素)的250 mL 滅菌三角瓶中,并編1～20號，放入搖床培養(yǎng)箱中，250 rpm，37 ℃培養(yǎng)12 h，分別無菌取1 mL 菌液，用1 mL 的30%甘油在1.5 mL 的EP管中混合，編寫與三角瓶對應(yīng)的號碼，標(biāo)上日期，放在-20 ℃冰箱保存。同時(shí)分別檢測菌液的OD600值和pH值，用試劑盒檢測質(zhì)粒含量。復(fù)篩：以質(zhì)粒含量(mg/mL)及質(zhì)粒含量比OD600值(mg/mL/OD)為指標(biāo)，選取上述指標(biāo)前10位的單菌落，分別從對應(yīng)的甘油管保藏菌液中，取0.05 mL 接入裝有50 mL LB(含有50 mg/mL 氨芐青霉素)的250 mL 滅菌三角瓶中(條件同上)培養(yǎng)10 h，如此搖床篩選反復(fù)幾次，篩選出每次搖床培養(yǎng)中上述指標(biāo)都最好的單菌落為菌種，并做穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 菌種穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將篩選出的菌種，以傳代培養(yǎng)進(jìn)行菌株產(chǎn)質(zhì)粒穩(wěn)定性的檢測。從平板生長的菌落接入LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)12 h的菌液為第0代，再將以0代為菌種經(jīng)過12 h搖床培養(yǎng)的菌液為第1代。如此依次接種傳代搖床培養(yǎng)，分別為第1、2、3…50代。第0、第5、第10、第15、第20、第25、第30、第35、第40、第45、第50代取樣檢測OD600、pH，質(zhì)粒含量和進(jìn)行凝膠電泳成像。搖床培養(yǎng)條件為250 rpm，37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.5 檢測方法 菌體密度OD600值：以無菌水為空白樣，在吸收波長600 nm處檢測菌液吸收值,樣品稀釋至OD值為0.2～0.8 范圍內(nèi)；質(zhì)粒含量(mg/mL)：取1 mL菌液，離心收集菌體細(xì)胞，用(QIAGEN Plasmid Mini Kit)公司質(zhì)粒提取試劑盒檢測質(zhì)粒含量。瓊脂糖凝膠電泳:1%的瓊脂糖凝膠，電壓75 V,時(shí)間40～60 min。通過凝膠成像系統(tǒng)分析質(zhì)粒超螺旋比例。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將CNE-2細(xì)胞株常規(guī)傳代于RPMI-1640培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，按照轉(zhuǎn)染試劑操作手冊進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY對細(xì)胞CNE-2的生長抑制率 將質(zhì)粒pFY轉(zhuǎn)染到細(xì)胞CNE-2中，MTT比色法觀察轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒載體對細(xì)胞生長增殖的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)未處理組、脂質(zhì)體組、PFY/脂質(zhì)體組，質(zhì)粒濃度為2 mg/L，轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入10 mg/L MTT 10 μL，培養(yǎng)4 h后，加二甲基亞砜100 μL，測定波長570 nm和630 nm處的吸光度A值。每組設(shè)4個(gè)平行孔，結(jié)果取平均值。細(xì)胞生長抑制率的計(jì)算公式為：(1-實(shí)驗(yàn)孔A值)/對照孔A值。

2 結(jié) 果

2.1 菌落篩選結(jié)果 在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、初篩過程中，通過電泳成像和質(zhì)粒含量檢測發(fā)現(xiàn)，挑選出的菌落產(chǎn)質(zhì)粒能力有3種類型，第1種類型如圖1中的樣品1，其產(chǎn)質(zhì)粒能力低，且質(zhì)粒超螺旋比例低；第2種類型如圖1中樣品2，其產(chǎn)質(zhì)粒能力好，且質(zhì)粒超螺旋比例高;第3種類型如圖2中樣品3，其產(chǎn)質(zhì)粒能力好，但質(zhì)粒超螺旋比例較低。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

圖1 轉(zhuǎn)化后菌種攜帶的質(zhì)粒

表1 3種不同類型菌落的產(chǎn)質(zhì)粒能力的比較

在初篩的試驗(yàn)結(jié)果中，為了得到具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)能力的菌種，以第2種類型菌落進(jìn)行復(fù)篩。經(jīng)過3輪以上的復(fù)篩，在以LB為培養(yǎng)基，37 ℃、250 rpm振搖培養(yǎng)12 h，最終篩選出產(chǎn)質(zhì)粒含量為30 mg/mL,近似拷貝數(shù)為6.5 mg/mL/OD，超螺旋比例為92%的菌株。

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以篩選出具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的菌株為母菌，擴(kuò)增培養(yǎng)，甘油保種，建立種子庫；并做菌種傳代的質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，電泳檢測結(jié)果如圖2，圖3。圖2為菌種傳代后產(chǎn)質(zhì)粒能力的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別在菌種搖床培養(yǎng)的第1、2、5、10、15、20、30、40、50代取樣，提取質(zhì)粒，進(jìn)行電泳檢測和分析，結(jié)果為：菌液質(zhì)粒含量為(30.0±0.1)mg/mL,近似拷貝數(shù)為(6.50±0.02)mg/L/OD，超螺旋比例為(92.0±0.1)%。同時(shí)取PCR擴(kuò)增的pFY質(zhì)粒和該菌株的第0、25、50代菌提取的pFY質(zhì)粒進(jìn)行Kpn I酶切，電泳檢測結(jié)果如圖3所示，PCR擴(kuò)增的pFY質(zhì)粒和該菌種產(chǎn)的質(zhì)粒酶切片段一致，提示了該菌種攜帶的pFY質(zhì)粒是正確的。以上結(jié)果說明篩選出的菌株從0代到50代產(chǎn)質(zhì)粒能力沒退化，質(zhì)粒pFY為該菌株穩(wěn)定攜帶。因此利用該菌株作為母菌，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，建立了種子庫，可用于發(fā)酵等其他實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)。

2.3 抗鼻咽癌質(zhì)粒pFY對細(xì)胞CNE-2的生長抑制率 處理組、脂質(zhì)體組、PFY/脂質(zhì)體組的MTT結(jié)果見表2。

圖2 質(zhì)粒穩(wěn)定性的電泳圖

圖3 pFy質(zhì)粒的Kpn I酶切

表2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒PFY對細(xì)胞CNE-2生長抑制作用

3 討 論

在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，目前國內(nèi)外已有不少相關(guān)方面研究。Zhu等[9]通過上調(diào)LMP1 DNA內(nèi)的miR-155顯示有助于增加鼻咽癌細(xì)胞的增殖，另外還有通過磁性納米復(fù)合耦合物吸附質(zhì)粒方法提高基因轉(zhuǎn)染效率，以獲得更高效的擴(kuò)增目標(biāo)[10]。而本研究通過將質(zhì)粒pFY轉(zhuǎn)染到細(xì)胞CNE-2方法來達(dá)到擴(kuò)增質(zhì)粒的目標(biāo)。

在本研究中，其中用CaCl2法制備大腸桿菌JM109感受態(tài)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)國外CaCl2試劑，其最佳有效濃度是0.07 M，或者采用磷酸鈣[11]進(jìn)行制備。而國產(chǎn)(如廣州化學(xué)試劑廠)的CaCl2試劑用量為0.1 M。但CaCl2濃度超過上述量時(shí)，會使菌體凝結(jié)，降低質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率，與文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道一致。根據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道和作者的經(jīng)驗(yàn)，每OD菌體感受態(tài)的制備，加入質(zhì)粒量至少為0.5 μg，才能保證每個(gè)菌體細(xì)胞進(jìn)入質(zhì)粒數(shù)是充足的，以便提高質(zhì)粒的產(chǎn)量。

而在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，37 ℃培養(yǎng)16 h生長在瓊脂平板上的菌落直徑多為2～3 mm。挑選菌落時(shí)，應(yīng)選擇分布均勻，大小一致，邊緣整齊的菌落進(jìn)行搖床培養(yǎng)篩選。但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒含量高的菌株其對應(yīng)菌落直徑反而相對較小，如直徑1～2 mm菌落質(zhì)粒的含量一般比直徑2.5～3 mm菌落的高5 mg/mL,其超螺旋比例也較高。這可能是因?yàn)榫w細(xì)胞內(nèi)要攜帶的外源質(zhì)粒越多,其質(zhì)粒合成代謝的負(fù)擔(dān)也就越大，導(dǎo)致菌體生長的速率就比較慢，在瓊脂平板上生長形成的菌落也就越小[8]。

本研究成功篩選出產(chǎn)質(zhì)粒含量高及超螺旋比例高的菌株，這種方法對其他的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和菌種篩選有較好的借鑒作用，能大幅度地提高菌種攜帶質(zhì)粒能力，為發(fā)酵、提取質(zhì)粒及其他相關(guān)研究工作奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Study on transformation of anti-nasopharyngeal carcinoma plasmid pFY and bacterial strains screening*

WengShanfan,LiuNa,ZhangXiaolin

(DepartmentofLaboratoryMedicine,MedicalCollege,FoshanUniversity,Foshan,Guangdong528000,China)

ObjectiveTo screen the stable high-producing strains carrying anti-nasopharyngeal carcinoma(NPC) plasmid pFY.MethodsCompetent E.coli JM109 was prepared by the CaCl2 method and transformed with anti-NPC plasmid pFY.The bacterial colonies obtained from the agar plate were screened for selecting the single colony conforming to the standards as the bacterial strain and conducting the stability test.The plasmid content was detected by the plasmid extraction reagent kit.Anti-NPC plasmid pFY was transfected into nasopharynegal carcinoma cell line CNE-2.The influence of transfection reagent and the plasmid vector on the cell proliferation was detected by MTT.ResultsThe DNA concentration of plasmids in the culture solution of bacterial strain obtained by screening was 30 mg/mL.The proportion of supercoiled DNA was 92%.The identification of electrophoresis and restriction enzymes showed that the plasmids harbored in the 50th progeny of this strain were same as those in the primary.Plasmid pFY had the evident inhibiting effect on the growth of CNE-3 cell line.ConclusionThe stable high-producing strains of E.coli carrying anti-NPC plasmid pFY is successfully screened out,which lays the foundation for large-scale preparation of plasmid pFY for clinical utility.

nasopharyngeal neoplasms；competent cells;plasmid;transformation;screening

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.26.004

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(A2013687)；廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(1184713046)

：翁閃凡(1975-)，本科，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事鼻咽癌的基礎(chǔ)研究。

R739.6

A

1671-8348(2015)26-3613-03

2015-04-08

2015-06-02)