鱷魚腸中一株乳酸菌分離鑒定及活性物質(zhì)的初步分析

◎ 張小玉，鄧素娥

（東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，廣東 東莞 523000）

乳酸菌是一群能利用可發(fā)酵碳水化合物主要產(chǎn)乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的通稱[1]，主要包括乳桿菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）等屬。乳酸菌一般被視作是安全的，甚至可以改善人體和動(dòng)物的健康，歷來(lái)被用作食品的天然生物防腐劑。本文從鱷魚腸道中分離得到1株潛在乳酸菌，對(duì)其活性物質(zhì)進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步篩選微生物的天然抑菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 分離樣品

鱷魚腸。

1.2 指示菌

用于抗菌活性的指示菌：大腸桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和黑曲霉，均購(gòu)買于廣東微生物所。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫-80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂18.0 g和天然海水1 000 mL，pH6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min，用于乳酸菌的培養(yǎng)純化。

改良MRS培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加0.3%CaCO3[2]，用于乳酸菌的分離篩選。

MRS液體培養(yǎng)基：用于乳酸菌的發(fā)酵。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、牛肉浸出粉5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min，用于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)。

加3% NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、牛肉浸出粉5 g、氯化鈉35 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min，用于副溶血性弧菌的培養(yǎng)。

胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基：胰酪胨15.5 g、植物蛋白胨5.0 g、氯化鈉5 g、酵母粉6.5 g、瓊脂15.0 g和蒸餾水1 000 mL，pH 7.1～7.5，121 ℃滅菌20 min，用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的培養(yǎng)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯粉6.0 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g和蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，用于黑曲霉的培養(yǎng)。

1.4 乳酸菌的分離篩選

無(wú)菌操作，用滅菌海水沖鱷魚腸表面2～3次，晾干水分，在無(wú)菌工作臺(tái)稱25 g樣品，用滅菌剪剪碎后加入到裝有225 mL無(wú)菌水的錐形瓶中（瓶中預(yù)先放一定數(shù)量的小波珠），振動(dòng)搖晃30 min，即為稀釋度10-1的樣品液，吸取10-1稀釋液1 mL加到盛有9 mL滅菌海水的試管內(nèi)，搖勻，制成10-2稀釋液，同樣方法，稀釋到10-3、10-4。用移液槍分別吸取各稀釋樣液100 μL到改良MRS培養(yǎng)基平板上，再用涂布棒快速地將其均勻涂布，于30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑選周圍溶鈣圈較明顯的單菌落，在MRS固體培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)，反復(fù)劃線，直至獲得純的單菌落。用接種環(huán)挑取純化單菌落于1.5 mL滅菌離心管里，加入1 mL 20%甘油，然后在渦旋器上渦旋30 s，待菌充分分散，于-20 ℃冰箱中保存，備用，共分離4株。

1.5 菌株E02分類學(xué)地位鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選出的菌株接種于MRS培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形狀、顏色等特征。挑取菌體進(jìn)行革蘭氏染色，用普通光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.5.2 生理生化反應(yīng)測(cè)定

按照東秀珠[3]的方法，對(duì)菌珠E02進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

1.6 抑菌活性物質(zhì)初步分析

1.6.1 菌株E02發(fā)酵液制備

用接種環(huán)挑取1環(huán)單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置發(fā)酵培養(yǎng)48 h，然后在10 000 r/min離心20 min[4]，得到發(fā)酵上清液，用酸度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的酸度，并記錄。

1.6.2 乳酸對(duì)照液制備

將MRS液體培養(yǎng)基用1 mol/L的乳酸調(diào)至與原發(fā)酵上清液相同pH值，即為對(duì)照液。

1.6.3 指示菌菌懸液制備

指示菌菌懸液制備采用光電比濁計(jì)數(shù)法，在含有指示菌的斜面上加入適量無(wú)菌生理鹽水，在渦旋器上充分渦旋，制成高濃度的菌懸液，再移入50 mL的大試管中，加入適量的無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)為600 nm）測(cè)OD值，使菌懸液的OD值為0.5，然后按每100 mL冷卻至50 ℃左右的指示菌培養(yǎng)基接種1 mL OD值為0.5的指示菌懸液。

1.6.4 牛津杯雙層平板法[5]測(cè)抑菌活性

2.0 %的素瓊脂冷至50 ℃左右，按每平皿7 mL傾倒在無(wú)菌平皿中，待凝固后，用無(wú)菌鑷子取2個(gè)已滅過(guò)菌的牛津杯擺放在倒有素瓊脂的平皿中，再傾倒含有指示菌的培養(yǎng)基，待凝固后，用鑷子拔去牛津杯。在其中一個(gè)牛津杯的孔中加入約200 μL無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，另外一個(gè)牛津杯的孔中加入對(duì)照液，在4 ℃冰箱中擴(kuò)散4 h，置于適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察是否有抑菌圈，并測(cè)量其大小，抑菌圈越大，代表該菌株抑菌能力越強(qiáng)。

大腸桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌37 ℃培養(yǎng)12 h，黑曲霉28 ℃培養(yǎng)48 h。

1.6.5 原發(fā)酵上清液與相同pH對(duì)照液抑菌活性的比較

對(duì)比原發(fā)酵上清液與相同pH對(duì)照液的抑菌圈大小，對(duì)抑菌活性進(jìn)行初步分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株E02分類學(xué)地位鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株E02菌落呈圓形上凸?fàn)?、光滑、白色、濕?rùn)，邊緣較整齊。菌株E02為短桿、無(wú)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌，其顯微形態(tài)如圖1所示。

圖1 菌株E02的顯微形態(tài)圖

2.1.2 生理生化鑒定

菌株E02最適合生長(zhǎng)溫度為30 ℃，其生理生化特征見表1。菌株E02經(jīng)過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)均呈陰性。通過(guò)東秀珠編著的《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》比對(duì)，菌株E02初步鑒定為乳桿菌。

表1 菌株E02生化鑒定特征表

2.2 抑菌活性物質(zhì)初步分析

由表2可知，菌株E02既可抑制革蘭氏陰性菌（大腸桿菌和副溶血性弧菌）又可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌），但對(duì)真菌（黑曲霉）并沒有抑菌作用。

由表2和表3對(duì)比可知，說(shuō)明抑菌作用是酸和非酸性物質(zhì)共同作用結(jié)果，其主導(dǎo)抑菌作用主要來(lái)源于其產(chǎn)生的酸，只有少部分是其他活性物質(zhì)。

表2 菌株E02原發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑表（單位：mm）

表3 乳酸對(duì)照液抑菌圈直徑表（單位：mm）

3 討論

改良MRS培養(yǎng)基，在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加0.3%CaCO3，此條件下分離到菌落出現(xiàn)溶鈣圈的現(xiàn)象，有利于乳酸菌的分離篩選，CaCO3是一種很好的指示劑。

該實(shí)驗(yàn)成功地從鱷魚腸道中分離到1株對(duì)常見食品腐敗菌具有抑菌活性的菌株，菌株E02既可抑制革蘭氏陰性菌（大腸桿菌和副溶血性弧菌）又可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌），但對(duì)真菌（黑曲霉）并沒有抑菌作用。

通過(guò)用乳酸調(diào)節(jié)與原發(fā)酵液相同pH的MRS液體培養(yǎng)基，并與原發(fā)酵液作抑菌活性對(duì)比，排除乳酸作用，菌株E02發(fā)酵液仍然具有抑菌效果。在以后實(shí)驗(yàn)中，希望能進(jìn)一步的研究，確定它們是何種物質(zhì)。