3 種酵母發(fā)酵生產(chǎn)紅樹莓酒香氣成分的GC-MS分析

劉亞娜，楊 華，郭德軍,*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

3 種酵母發(fā)酵生產(chǎn)紅樹莓酒香氣成分的GC-MS分析

劉亞娜1，楊 華2，郭德軍1,*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

以D254、71B、D153種果酒酵母進(jìn)行發(fā)酵制備紅樹莓酒，并分析其香氣化學(xué)成分。采用頂空-固相微萃取法提取3種酵母釀造的紅樹莓酒香氣成分；利用氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行香氣成分的分離測(cè)定，結(jié)合計(jì)算機(jī)檢索技術(shù)對(duì)分離化合物進(jìn)行鑒定，利用峰面積歸一法測(cè)定各香氣化學(xué)成分的相對(duì)含量，共鑒定出105種香氣成分，其中D254、71B、D15酵母發(fā)酵的紅樹莓酒中分別檢測(cè)出35、48、57種香氣成分，共有8種成分相同。D254酵母發(fā)酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇（54.39%）；71B酵母發(fā)酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為丙烯酸異辛酯（12.41%）、脫羰秋水仙堿（12.06%）、癸酸乙酯（8.21%）；D15酵母發(fā)酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為三辛酸甘油酯（11.06%）和安非拉酮（8.81%）。綜合氣相色譜-質(zhì)譜分析與感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，71B酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒香氣較好，適宜大眾口味，從而得出71B酵母為生產(chǎn)紅樹莓酒的最優(yōu)菌株。

紅樹莓酒；不同酵母；香氣成分；氣相色譜-質(zhì)譜法

紅樹莓屬于薔薇科懸鉤子屬多年生落葉灌木，俗稱是“覆盆子”、“托盤”等[1]。紅樹莓富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、花青素、VE、氨基酸、鞣花酸等[2]，同時(shí)還含有黃酮、類黃酮[3-4]、白藜蘆醇等多種抗氧化物質(zhì)，其中VE、SOD等成分的含量高于其他漿果，且具有美容、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抗癌、抗心血管疾病等功效[5]。以紅樹莓為原料釀制的紅樹莓酒，具有低酒精體積分?jǐn)?shù)、高營養(yǎng)、益腦健身、促進(jìn)血液循環(huán)、加快機(jī)體的新陳代謝、平衡體內(nèi)膽固醇水平、改善心腦血管功能，同時(shí)具有利尿、激發(fā)肝功能等保健功效[6]。隨著人們對(duì)身體健康的重視程度逐漸加深，紅樹莓酒具有廣泛的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)選取3種不同酵母對(duì)相同的紅樹莓果汁采取相同工藝進(jìn)行發(fā)酵，采用頂空-固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）法提取酒樣中的香氣化學(xué)成分[7]，并利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對(duì)不同酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒香氣化學(xué)成分進(jìn)行鑒定[8]，通過對(duì)比分析研究不同酵母發(fā)酵釀造紅樹莓酒的主要香氣化學(xué)成分組成及相對(duì)含量的差異，選取出優(yōu)良的釀酒酵母[9]，從而為紅樹莓酒香氣化學(xué)成分的分析研究和感官風(fēng)味評(píng)價(jià)體系的建立提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

紅樹莓（主要成分含量：水分5 6%、總糖5.6 g/100 g、pH 3.22、蛋白質(zhì)0.2 g/100 g、灰分0.5 g/100 g、花青素42.1 mg/100 g） 大興安嶺超越公司；果酒干酵母D254煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；果酒干酵母71B法國拉氟德公司；果酒酵母D15黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；果膠酶（2 000 U/g） 生工生物工程股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

7890A/5975GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；固相微萃取裝置、聚二甲基硅氧烷/二乙基苯100 ?m萃取頭美國Supelco公司。

1.3方法

1.3.1紅樹莓酒的制備

圖1 紅樹莓酒制備工藝流程圖Fig.1 Flow diagram for the production of red raspberry wine

圖1為紅樹莓酒制備的工藝流程圖，制備過程中操作要點(diǎn)如下：

1）制備紅樹莓酒：紅樹莓過濾取果汁，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%果膠酶，50 ℃恒溫水浴2 h，添加蔗糖200 g/L，添加CaCO3調(diào)整pH值使紅樹莓果汁pH值為4.0。

2）酵母的活化：干酵母處于休眠期，活化可以使干酵母脫離休眠期從而恢復(fù)酵母細(xì)胞的正常功能，增強(qiáng)酵母活性。D254和71B干酵母活化處理：分別取D254干酵母和71B干酵母1 g，35～40 ℃條件下置于20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%蔗糖溶液中并攪拌15 min，30 ℃恒溫靜置1.5 h后即可使用[10]。D15酵母活化處理：取—80 ℃冷凍D15酵母于常溫解凍，接種在酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基后28℃恒溫?fù)u床搖菌1 d即可使用[11]。

3）接種：將活化后的3種酵母菌制得的酵母分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%接種量接種于200 mL澄清紅樹莓果汁中，26℃恒溫發(fā)酵8 d。

1.3.2紅樹莓酒香氣成分分析

取30 mL紅樹莓酒樣品置于50 mL頂空瓶中，加入0.1 g/mL NaCl溶液，并以聚四氟乙烯隔墊密封，置于70℃條件下萃取40 min后，將萃取針插入GC進(jìn)樣口，解吸1.5 min[12]，同時(shí)啟動(dòng)儀器，分析樣品并采集數(shù)據(jù)。

1.3.3 GC-MS分析條件

利用GC-MS測(cè)定其香氣化學(xué)成分的種類及各成分相對(duì)含量，對(duì)比分析3種酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒香氣化學(xué)成分共同點(diǎn)及差別，確定釀造紅樹莓酒的最優(yōu)酵母菌株。

1.3.3.1 GC條件[13]

DB-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25μm）；升溫程序：初始溫度80℃保持5 min，以5℃/min升至270℃，保持1 min；傳輸線溫度230℃；載氣為高純He（99.999%）；載氣流速1.0 mL/min。

1.3.3.2 MS條件

進(jìn)樣口溫度250℃；電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度250℃；四極桿溫度150℃；質(zhì)量掃描范圍50～550 u；對(duì)采集到的質(zhì)譜圖利用NIST 08.L譜庫進(jìn)行檢索，并用峰面積歸一化定量計(jì)算出各香氣成分在3種紅樹莓酒樣中的相對(duì)含量。

1.3.4紅樹莓酒感官評(píng)定

紅樹莓酒的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照中國葡萄酒品評(píng)標(biāo)準(zhǔn)，得分由項(xiàng)目組10名成員品評(píng)后打分，取平均值[14-15]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。感官要求：色澤：深紅色，有光澤，澄清透明；香氣：果香、酒香濃馥優(yōu)雅、悅?cè)?；口味：醇厚協(xié)調(diào)、舒服、爽口、回味延綿；風(fēng)格：風(fēng)格獨(dú)特，幽雅無缺[16]。

表1 紅樹莓酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of red raspberry wines

1.3.5 紅樹莓酒理化指標(biāo)測(cè)定

酒精體積分?jǐn)?shù)、總糖含量和總酸含量的測(cè)定：分別采用GB/T 15038—1994《葡萄酒、果酒通用試驗(yàn)方法》蒸餾比重法、斐林試劑滴定法和電位滴定法。

2 結(jié)果與分析

2.1不同酵母發(fā)酵的紅樹莓酒中香氣成分GC-MS分析

表2 3 種不同酵母發(fā)酵的紅樹莓酒及紅樹莓果汁主要香氣成分Table 2 Main aroma components of red raspberry wines fermented with three different yeast strains and raspberry juice

續(xù)表2

續(xù)表2

如表2所示，采用HS-SPME和GC-MS技術(shù)在3種酒樣中共鑒定出105種香氣成分，主要是醇類14種、酯類37種、酸類5種、烷烯烴類19種、醛酮類9種、苯酚類5種、其他類16種；而在紅樹莓果汁中共鑒定出32種香氣成分，主要為醇類4種、酯類8種、酸類1種、烷烯烴類6種、醛酮類2種、苯酚類4種、其他類7種。

圖2 2DD225544（A）、71B（BB）、DD1155（C）酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒香氣成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatograms of red raspberry wine fermented with D254(A), 71B(B), and D15(C) yeast strains and raspberry juice by GC-MS

由圖2和表2可知，在D254酵母釀造的樹莓果酒中，共檢測(cè)出35種香氣成分，占總峰面積的97.94%。其中，醇類58.79%、酯類21.74%、酸類0.86%、烷烯烴類12.67%、醛酮類1.09%、苯酚類0.79%、其他類2.00%。其主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇（54.39%）、正己酸乙酯（5.31%）、環(huán)三聚二甲基硅氧烷（4.74%）、苯乙醇（2.86%）、丁酸-1-乙烯基-1,5-二甲基-4-己烯基酯（2.78%）。在71B酵母釀造的樹莓酒中，共檢測(cè)出48種香氣成分，占總峰面積的83.03%。其中，醇類4.83%、酯類50.16%、酸類0.39%、烷烯烴類7.62%、醛酮類1.24%、苯酚類5.01%、其他類14.42%。其主要香氣成分為丙烯酸異辛酯（12.41%）、脫羰秋水仙堿（12.06%）、癸酸乙酯（8.21%）、9-十六碳烯酸乙酯（7.21%）、辛酸乙酯（5.23%）、六甲基環(huán)三硅氧烷（3.13%）、1,3-二（三甲基甲硅烷基）苯（2.90%）、正己酸乙酯（2.84%）。在D15酵母釀造的樹莓酒中，共檢測(cè)出57種香氣成分，占總峰面積的86.11%。其中，醇類9.41%、酯類29.89%、酸類7.42%、烷烯烴類17.27%、醛酮類9.08%、苯酚類4.37%、其他類8.67%。其主要香氣成分為三辛酸甘油酯（11.06%）、安非拉酮（8.81%）、3-甲基-1-丁醇（7.15%）、八甲基三硅氧烷（6.80%）、2-（三氟甲基）苯甲酸（6.05%）、六甲基環(huán)三硅氧烷（4.52%）、正二十烷（3.67%）、4-十八基嗎啉（3.32%）、3,5-二叔丁基-1,2-苯二酚（3.03%）、十二酸乙酯（2.90%）、癸酸乙酯（2.60%）、酯二十四烷酸乙酯（2.57%）。

2.2不同酵母發(fā)酵的紅樹莓酒的主要香氣成分比較分析

國內(nèi)外較多報(bào)道葡萄酒的釀造工藝與香氣成分分析[17-20]，對(duì)紅樹莓酒釀造工藝報(bào)道較多，而對(duì)香氣成分測(cè)定分析較少，因此本實(shí)驗(yàn)采用HS-SPME法提取對(duì)紅樹莓酒中的香氣成分進(jìn)行分析。酒的香氣成分中醇類和酯類占的相對(duì)含量較高，其中醇類物質(zhì)在呈香上起主要作用[21]，同時(shí)又是形成酯類物質(zhì)的前體，3種酵母發(fā)酵生產(chǎn)的果酒及紅樹莓果汁中醇類物質(zhì)相對(duì)含量分別為58.79%、4.83%、9.41%、5.11%。含量差距較大，其中71B酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒中醇類物質(zhì)相對(duì)含量較紅樹莓果汁低0.28%，說明此種酵母對(duì)醇類物質(zhì)有降低的作用，而D254酵母與D15酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒中醇類物質(zhì)相對(duì)含量分別較紅樹莓果汁高出53.68%與4.30%，其中相對(duì)含量最高的物質(zhì)都是3-甲基-1-丁醇分別為54.39%與7.15%；但71B酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒中并不含3-甲基-1-丁醇，說明并非所有酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒中都會(huì)產(chǎn)生3-甲基-1-丁醇。3-甲基-1-丁醇具有青草、植物香氣，這種香氣具有持久保持的作用，因此在食品工業(yè)中用于調(diào)香[22]。D254酵母發(fā)酵產(chǎn)生醇類物質(zhì)含量較高，因此適宜于快速發(fā)酵生產(chǎn)酒精體積分?jǐn)?shù)稍高的紅樹莓酒。通常醇類物質(zhì)具有刺鼻的氣味，對(duì)于果酒的酒香有負(fù)效應(yīng)影響，但D254酵母與71B酵母發(fā)酵的果酒中共有的醇類物質(zhì)苯乙醇不同于其他醇類物質(zhì)，不僅具有殺菌作用，而且還會(huì)產(chǎn)生玫瑰和茉莉花香，給人柔和愉悅的感覺[23]。

紅樹莓果實(shí)以酯類為香氣的主要來源，而通過3種酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒中，其相同的香氣成分并不多，且含量區(qū)別較大，說明紅樹莓果汁發(fā)酵后其香氣成分有較大的改變。本研究中，在3種紅樹莓酒中共檢測(cè)出酯類物質(zhì)37種，其中共有酯類物質(zhì)6種。71B酵母中酯類物質(zhì)的相對(duì)含量更高達(dá)50.16%，較紅樹莓果汁高1.36%，且其主要的酯類物質(zhì)分別為丙烯酸異辛酯、癸酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、辛酸乙酯；而D254酵母與D15酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒中酯類物質(zhì)相對(duì)含量分別為21.74%、29.89%，較紅樹莓果汁分別低27.06%、18.91%，而其主要的酯類物質(zhì)分別為正己酸乙酯、三辛酸甘油酯。大多數(shù)酯類具有花、果香氣，如：辛酸乙酯略帶有玫瑰、橙子的花果香氣，此香味為白蘭地酒特有的香氣；癸酸乙酯具有葡萄的水果香氣[13]；正己酸乙酯具有似蘋果、香蕉味、梨的酸甜味的水果香氣。由此，發(fā)酵過程所選擇的發(fā)酵酵母菌株不同對(duì)其發(fā)酵所產(chǎn)生的酯類化合物的種類與相對(duì)含量有很大的影響，且酯的種類與相對(duì)含量的不同會(huì)決定酒的香味和風(fēng)格。

以D254酵母和71B酵母發(fā)酵產(chǎn)生的紅樹莓酒中的酮類物質(zhì)較少，其含量均低于紅樹莓果汁；而釀酒酵母D15發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒中的酮類物質(zhì)相對(duì)含量較紅樹莓果汁高6.12%，其中酮類物質(zhì)主要為安非拉酮，其相對(duì)含量高達(dá)8.81%。安非拉酮是非苯丙胺類，有抑制食欲的作用，可使人產(chǎn)生飽腹感，從而起到控制食欲、降低食量的作用[24]，并且安非拉酮對(duì)心血管系統(tǒng)的影響較小，因此可用于具有輕度心血管疾病的肥胖病人的輔助治療[25]。

3種不同酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒中共檢測(cè)出酸類物質(zhì)5種，且其中沒有共有酸類物質(zhì)，在D15酵母發(fā)酵的紅樹莓酒中產(chǎn)生酸性物質(zhì)相對(duì)含量較高的是2-（三氟甲氧基）苯甲酸，其相對(duì)含量為6.05%；其他2種酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒中酸類物質(zhì)相對(duì)含量都很少。2-（三氟甲氧基）苯甲酸對(duì)呼吸系統(tǒng)具有刺激性，并且使酒具有酸澀感，且酸類化合物的呈香性相對(duì)比較小，對(duì)紅樹莓酒的香味影響較小。

3種紅樹莓酒中醇類和酯類所占的相對(duì)含量較高，因此其在果酒的香氣中起到主要的作用，而烷烴類、醛酮類、酚類、苯環(huán)類和其他16種成分所占的相對(duì)含量較少，對(duì)紅樹莓酒香氣影響較小。

2.3感官評(píng)定與理化指標(biāo)測(cè)定分析

表 3 紅樹莓酒理化指標(biāo)測(cè)定Table 3 Physical and chemical parameters of red raspberry wines fermented with D254,71B and D15 yeast strains

對(duì)紅樹莓酒進(jìn)行感官評(píng)定和理化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見表3。71B酵母產(chǎn)酒能力強(qiáng)，殘?zhí)巧?，酸度較低，感官評(píng)定總分較高，且風(fēng)格與口味較佳；D254酵母產(chǎn)酒能力強(qiáng)，酸度較低，但感官評(píng)定總分低，風(fēng)味、口感皆不佳；D15酵母產(chǎn)酒香氣較佳，但酒口感酸澀，缺乏紅樹莓酒應(yīng)有的風(fēng)格與口味。

3 結(jié) 論

采用HS-SPME提取待研究不同酵母發(fā)酵生產(chǎn)的紅樹莓酒樣中的香氣化學(xué)成分，并通過GC-MS進(jìn)行分析檢測(cè)。3種酒樣中共檢測(cè)出香氣化學(xué)成分105種，其中8種為共有香氣成分，在D254、71B酵母和D15酵母發(fā)酵的紅樹莓酒中檢出香氣成分分別為35、48、57種，并用峰面積歸一化法來定量分別計(jì)算出各香氣成分在3種酒樣中的相對(duì)含量，經(jīng)檢測(cè)可知3種酒之間的香氣組分及相對(duì)含量差別均較大。D254酵母發(fā)酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇，相對(duì)含量為54.39%；71B酵母發(fā)酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為丙烯酸異辛酯，相對(duì)含量為12.41%；D15酵母發(fā)酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為三辛酸甘油酯，相對(duì)含量為11.06%。研究結(jié)果表明，以不同酵母發(fā)酵的紅樹莓酒香氣成分差異顯著，因此酵母菌種選取對(duì)紅樹莓酒香氣成分組成及相對(duì)含量具有重要的影響。由于紅樹莓酒中香氣成分種類繁雜，因此各成分之間協(xié)同，抑制作用強(qiáng)烈，從而使其香氣成分出現(xiàn)增加或減少的現(xiàn)象，會(huì)影響紅樹莓酒的感官風(fēng)味。此外，鑒定紅樹莓酒除評(píng)價(jià)其特征香氣，還結(jié)合人體嗅覺感官分析，實(shí)驗(yàn)表明以71B酵母為發(fā)酵菌種的紅樹莓酒香氣清新，有玫瑰花香，且色澤澄清，呈櫻桃紅色，口感柔和，無酸澀感，無過重的酒味。綜合GC-MS分析及感官評(píng)定結(jié)果，選取71B酵母為釀造紅樹莓酒的最優(yōu)菌種。

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GC-MS Analysis of Arom Chemical Composition of Red Raspberry Wines Fermented with Three Different Yeast Strains

LIU Yana1, YANG Hua2, GUO Dejun1,*

(College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

The aroma components of red raspberry wines fermented with three different wine yeast strains, D254, 71B and D15, were extracted with headspace-solid phase micro extraction (HS-SPME) and then separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) through mass spectral library search. Total ion current (TIC) peak area normalization method was used to determine the relative contents of aroma components. A total of 105 flavor components were detected, among which 35, 48 and 57 compounds were detected in red raspberry wines fermented with D254, 71B and D15, respectively, with 8 being common to these three samples. The main aromatic compound in red raspberry wine fermented with D254was 1-buten-ol-3-methyl (54.39%) while those in the wine fermented with 71B were 2-propenoic acid octyl ester (12.41%), demecolcine (12.06%) and ethyl caprate (8.21%), and were glycerol tricaprylate (11.06%) and amfepramone (8.81%) in the wine fermented with D15. Overall, GC-MS analysis and sensory evaluation suggested that red raspberry wine fermented by 71B contains more aroma substances and is suitable for the pubic taste. Thus, 71B could be the best yeast strain for the production of red raspberry wine.

red raspberry wine; yeast strain; aroma components; gas chromatography-mass spectrometry

TS207.3；TS261.1

A

1002-6630（2015）12-0160-06

10.7506/spkx1002-6630-201512030

2014-11-07

農(nóng)墾總局技術(shù)開發(fā)課題（HNK13KF-15-01）

劉亞娜（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：985974520@qq.com

*通信作者：郭德軍（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：187013609@qq.com