氫化物原子熒光法分析不同地區(qū)刺參總硒和無(wú)機(jī)硒含量及分布規(guī)律

李秀梅，孫國(guó)華，楊建敏,*，任利華，馬元慶，谷偉麗，張 健，劉兆存

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264006；3.山東華春漁業(yè)有限公司，山東 東營(yíng) 257236）

氫化物原子熒光法分析不同地區(qū)刺參總硒和無(wú)機(jī)硒含量及分布規(guī)律

李秀梅1,2，孫國(guó)華2，楊建敏2,*，任利華2，馬元慶2，谷偉麗2，張 健2，劉兆存3

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264006；3.山東華春漁業(yè)有限公司，山東 東營(yíng) 257236）

為測(cè)定我國(guó)黃渤海海域刺參群體硒含量并探索其分布規(guī)律，采用氫化物原子熒光光譜法進(jìn)行含量分析。結(jié)果顯示，呼吸樹為總硒和無(wú)機(jī)硒含量最高的組織，平均值分別為（14.171±3.412）mg/kg和（6.194±3.829）mg/kg，不同組織內(nèi)的總硒、無(wú)機(jī)硒含量變化呈現(xiàn)一致的規(guī)律，硒含量由高到低為：呼吸樹＞消化道＞肌肉＞內(nèi)壁＞外壁，同時(shí)刺參體壁和肌肉（食用部分）中有機(jī)硒比例在75.6%～89.4%之間（除東營(yíng)地區(qū)刺參群體肌肉組織的有機(jī)硒比例最低為53.6%）；5個(gè)地區(qū)刺參群體同一組織內(nèi)的總硒及無(wú)機(jī)硒含量有顯著性差異，東營(yíng)地區(qū)呼吸樹、消化道和肌肉中無(wú)機(jī)硒含量較高。

氫化物原子熒光光譜法；刺參；總硒；無(wú)機(jī)硒；有機(jī)硒

刺參（Apostichopus japonicus）屬棘皮動(dòng)物門、海參綱、刺參科、仿刺參屬，主要分布在北緯35°～44°的西北太平洋沿岸，在全世界約40余種可供食用的大型海參中，以產(chǎn)于我國(guó)黃渤海的刺參的質(zhì)量最佳[1-2]。刺參具有高蛋白、低脂肪、低糖及無(wú)膽固醇等優(yōu)點(diǎn)，深受人們的喜愛，是我國(guó)海水養(yǎng)殖中重要經(jīng)濟(jì)品種之一。硒是人體所必需的微量元素之一，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用，具有抗病、防老抗衰、解毒等功能[3]，與人類健康密切相關(guān)。生物體中的硒（特別是有機(jī)硒）是人類營(yíng)養(yǎng)硒來(lái)源的基本渠道，而刺參體內(nèi)硒含量相當(dāng)豐富，根據(jù)2002年中國(guó)食物成分表中的數(shù)據(jù)，在21類1 506種食物中干海參的硒含量排位第5[4]。近年來(lái)富硒功能性食品的開發(fā)已成為關(guān)注的熱點(diǎn)[5]，已有研究者對(duì)作為主要水產(chǎn)品的刺參體內(nèi)總硒含量進(jìn)行了測(cè)定[6]，但刺參體內(nèi)硒的研究還比較薄弱，有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒的比例、不同組織間和不同地區(qū)間有何差異，這些方面還缺乏相關(guān)研究。

近年來(lái)硒的分析方法得到了很大的發(fā)展，目前硒元素檢測(cè)在GB 5009.93—2010《食品中硒的測(cè)定》中有原子熒光光譜法和熒光法，還有光學(xué)分析法、電化學(xué)分析法和色譜法等方法[7]，但是很多方法都存在一定的缺點(diǎn)，比如分光光度法靈敏度低，試劑不穩(wěn)定；電化學(xué)法干擾嚴(yán)重；色譜法操作繁瑣，而其中氫化物原子熒光光譜法具有靈敏度高、檢出限低、共存離子干擾小、線性范圍寬、方法快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。其主要體現(xiàn)在Se元素在常溫條件下與還原劑反應(yīng)形成氣態(tài)氫化物，可與大量基體分離，大大降低了基體干擾，且因?yàn)槭菤怏w進(jìn)樣方式，極大地提高了進(jìn)樣效率和靈敏度。氫化物發(fā)生反應(yīng)要求的酸度范圍也很寬，硼氫化鈉的消耗量也小。在儀器最佳工作條件下，回收率及精密度高，因此是一種行之有效的檢測(cè)手段。目前，氫化物原子熒光光譜法已被廣泛應(yīng)用于測(cè)定水產(chǎn)品等食品中的硒含量[8-9]。

硒特殊的生理、生化功能不僅取決于其總濃度水平，而且同硒存在的化學(xué)形態(tài)以及不同化學(xué)形態(tài)下硒化物的濃度水平密切相關(guān)，無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒生物學(xué)特性大不相同[10]，因此建立準(zhǔn)確有效的總硒和無(wú)機(jī)硒含量測(cè)定方法十分必要。本研究以黃渤海海域5個(gè)典型地區(qū)刺參群體為研究對(duì)象，進(jìn)行刺參體內(nèi)不同組織的總硒及無(wú)機(jī)硒含量的測(cè)定，一方面通過比較不同地區(qū)刺參群體硒含量的差異，為研究環(huán)境對(duì)刺參體內(nèi)硒含量的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；另一方面獲得刺參體內(nèi)不同組織的硒含量分布信息，為進(jìn)一步探明不同形態(tài)存在的硒的代謝及硒蛋白分子生物學(xué)方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

2014年4月，取黃渤海海域大連、東營(yíng)、煙臺(tái)、青島、日照5個(gè)典型刺參群體樣品，刺參生長(zhǎng)期約22個(gè)月。取刺參的外壁、內(nèi)壁、呼吸樹、消化道、肌肉，用剪刀剪碎，分別裝入樣品袋-80℃冷凍，低溫冷凍干燥48 h，粉碎，過80目篩，干燥保存，備用。

硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 mg/L） 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；質(zhì)控樣：黃魚（Pseudosciaena polyactis）成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW 08573） 國(guó)家海洋局第二海洋研究所；環(huán)己烷（優(yōu)級(jí)純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；硼氫化鉀（優(yōu)級(jí)純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鉀、鹽酸、硝酸（均為優(yōu)級(jí)純）、鐵氰化鉀（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

AFS-930型半/全自動(dòng)順序注射原子熒光光度計(jì) 北京吉天儀器有限公司；MARS微波消解儀 美國(guó)CEM公司；EH45B型電子控溫加熱板 北京萊伯泰科儀器有限公司；EH35A-Plus位控?cái)?shù)顯電熱板 上海川翔生物科技有限公司；JY 92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Elix-5+MILLI-Q純水超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；DK-8D型電熱恒溫水槽上海一橫科技有限公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；YB-FD-J冷凍干燥機(jī) 上海億倍實(shí)業(yè)有限公司；CHB-100水浴鍋 杭州博日科技有限公司；CR21G高速冷凍離心機(jī) 天美科技有限公司；超凈工作臺(tái) 日本Air Tech公司。

1.3方法

1.3.1 檢出限的計(jì)算

按照本實(shí)驗(yàn)方法連續(xù)12次測(cè)定空白溶液，按公式（1）計(jì)算檢出限（L），計(jì)算得出最低檢出限為0.000 506 ng/mL。

式中：S為空白多次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)方差；k為方法的靈敏度。

1.3.2儀器條件

MARS微波消解儀：功率800 W；升溫程序：6 min升至120℃，保持2 min，之后以6 min升至150℃，保持2 min，最后4 min升至180℃，保持15 min。降溫程序：15 min降至120℃。

EH35A-Plus位控?cái)?shù)顯電熱板：功率800 W；升溫程序：30 min升至140℃，保持120 min。降溫程序：15 min降至100℃。

AFS-9130雙道原子熒光光度計(jì)：波長(zhǎng)196. 0 nm；燈電流80 mA；光電倍增管負(fù)高壓270 V；原子化器溫度：200℃；爐高8 mm；載氣流量400 mL/min；屏蔽氣流量800 mL/min；采用峰面積讀數(shù)，讀數(shù)時(shí)間7 s；延時(shí)1.5 s；進(jìn)樣量0.5 mL。

1.3.3消解方法

樣品處理總硒消解：準(zhǔn)確稱取樣品0.20 g（精確到0.000 1 g）于聚四氟乙烯消解罐中，加硝酸10.00 mL（硝酸即可使樣品消解完全，所以無(wú)需再加入過氧化氫），于微波消解儀中消解，消解完畢，用電子控溫電熱板加熱趕酸，再繼續(xù)加熱至剩余體積1.00 mL左右，不可蒸干，再加5.00 mL體積分?jǐn)?shù)50%鹽酸（以濃鹽酸為基準(zhǔn)）溶液將正6價(jià)硒還原為正4價(jià)，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙出現(xiàn)。冷卻，冷卻后轉(zhuǎn)移到50 mL比色管中，用超純水定容、混勻。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

無(wú)機(jī)硒消解：準(zhǔn)確稱取樣品0.20 g（精確到0.000 1 g）于50 mL離心管中，加入20.00 mL超純水，超聲破碎20 min，然后90℃水浴加熱10 min，冷卻后，9 000 r/min離心10 min，移取上清液至分液漏斗，用環(huán)己烷萃取，分出水相即為無(wú)機(jī)硒提取液。

無(wú)機(jī)硒提取液采用電熱板加熱消解。移取無(wú)機(jī)硒提取液6.00 mL，置于消化瓶中，加10.00 mL混合酸（高氯酸-硝酸，1∶9，V/V）及幾粒玻璃珠，蓋上表面皿冷消化過夜。次日于電熱板上加熱，并及時(shí)補(bǔ)加硝酸。當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙時(shí)，再繼續(xù)加熱至剩余體積2.00 mL左右，切不可蒸干。同總硒消解，冷卻后再加5.00 mL體積分?jǐn)?shù)50%鹽酸溶液，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙出現(xiàn)。冷卻后轉(zhuǎn)移至50 mL比色管，用超純水定容、混勻。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.4測(cè)定方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

用體積分?jǐn)?shù)10%鹽酸溶液逐級(jí)稀釋100 mg/L硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至30μg/L，并含1%K3[Fe(CN)6]，作為硒標(biāo)準(zhǔn)工作液。儀器在線自動(dòng)配制標(biāo)準(zhǔn)系列，依次為：0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、30.00μg/L。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)得的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；取2頭刺參冷凍干燥，粉碎過篩后，稱取16份各0.20 g（精確到0.000 1 g）的樣品，分別添加100 ng/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液400.00、1 000.00和2 000.00μL，每個(gè)質(zhì)量濃度做5個(gè)重復(fù)，然后按1.3.3節(jié)中總硒的測(cè)定步驟進(jìn)行處理及分析。同樣測(cè)定無(wú)機(jī)硒的回收率和精密度；準(zhǔn)確稱取0.20 g國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)黃魚，按1.3.3節(jié)步驟進(jìn)行前處理，用已經(jīng)優(yōu)化好的最佳儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，考察檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3.5樣品分析與計(jì)算

樣品經(jīng)1.3.3節(jié)處理后，吸取10.00 mL試樣消化液于25 mL容量瓶中，加濃鹽酸2.50 mL，鐵氰化鉀溶液1.00 mL，稀釋至刻度混勻。分別取標(biāo)準(zhǔn)系列及樣品于自動(dòng)進(jìn)樣器專用管中，用體積分?jǐn)?shù)10%鹽酸溶液為載體，10 g/L硼氫化鉀為還原劑依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列、樣品空白、樣品，按1.3.2節(jié)設(shè)定的儀器條件進(jìn)行分析，儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)自動(dòng)記錄熒光強(qiáng)度和進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。并根據(jù)線性方程，自動(dòng)計(jì)算結(jié)果。按公式（2）計(jì)算樣品中硒含量：

式中：CSe為樣品中硒含量/（mg/kg）；ρ樣品為樣品消解液中硒質(zhì)量濃度/（μg/L）；ρ空白為空白溶液（試劑空白）中的硒質(zhì)量濃度/（μg/L）；V定容體積為消解液定容的體積50 mL；N稀釋倍數(shù)為定容后的消解液稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

總硒測(cè)定值與無(wú)機(jī)硒測(cè)定值差減得到有機(jī)硒。

1.4數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行常規(guī)計(jì)算后，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVAAnalysis），結(jié)果用P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1測(cè)定方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果表明，硒元素質(zhì)量濃度為0～30μg/L，與熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系，線性方程為I=133.065C+21.761，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，回歸方程的斜率倒數(shù)為0.007 515。由表1可知，當(dāng)在各樣品中分別加入質(zhì)量濃度為0.32、0.80、1.60 ?g/L硒標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，樣品總硒的回收率達(dá)到96.375%～99.738%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.926%～5.257%，無(wú)機(jī)硒的回收率達(dá)到92.875%～95.363%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.725%～6.096%，以上結(jié)果表明，測(cè)定總硒及無(wú)機(jī)硒的方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，通過差減法得到樣品的有機(jī)硒含量是真實(shí)可信的，同時(shí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)值允許誤差范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、可靠，能夠滿足水產(chǎn)品中總硒的檢測(cè)要求。

2.2刺參不同組織間硒含量分布規(guī)律及差異性

由表2可知，黃渤海海域大連、東營(yíng)、煙臺(tái)、青島、日照5個(gè)典型刺參群體的不同組織總硒及無(wú)機(jī)硒含量存在較大的組織間差異性，刺參呼吸樹組織中總硒含量在9.877～18.719 mg/kg之間，外壁、內(nèi)壁、消化道和肌肉組織內(nèi)總硒含量分別為1.541～4.795、1.632～5.925、8.801～15.585 mg/kg和4.547～9.568 mg/kg。對(duì)比不同組織硒含量，呼吸樹為含量最高的組織，平均值達(dá)（14.171±3.412）mg/kg。由圖1可知，不同刺參群體呼吸樹組織間總硒含量有極顯著差異（P＜0.01）；消化道為含量次高組織，平均值為（11.503±2.978）mg/kg；外壁與內(nèi)壁組織中總硒含量值較接近，且遠(yuǎn)低于其他3個(gè)組織（P＜0.01）（圖1A），可食用部分體壁和肌肉組織低于呼吸樹和消化道。刺參呼吸樹組織無(wú)機(jī)硒含量在2.553～12.212 mg/kg之間，均值為（6.194±3.829）mg/kg，方差分析表明，僅日照刺參呼吸樹中的無(wú)機(jī)硒含量低于消化道中的無(wú)機(jī)硒含量（P＜0.01），其余4個(gè)地區(qū)刺參呼吸樹無(wú)機(jī)硒含量仍遠(yuǎn)高于其他各組織（P＜0.01）（圖1B）；外壁與內(nèi)壁組織無(wú)機(jī)硒含量非常接近且最低，僅青島刺參內(nèi)壁與外壁無(wú)機(jī)硒含量有差異（P＜0.05），其余4個(gè)地區(qū)刺參內(nèi)壁與外壁無(wú)機(jī)硒含量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）?？傊鞯貐^(qū)不同組織中的總硒及無(wú)機(jī)硒含量平均值整體變化規(guī)律為：呼吸樹＞消化道＞肌肉＞內(nèi)壁＞外壁（圖1B）。

表2 不同地區(qū)刺參不同組織的不同形態(tài)硒含量（ =3）Table 2 Selenium levels in different tissues of Apostichopus japonicus ( = 3) mg/kg

圖1 刺參總硒含量（A）及無(wú)機(jī)硒含量（B）在不同組織間的差異比較Fig.1 Comparison of total selenium and inorganic selenium contents in different tissues ofApostichopus japonicus

2.3 不同地區(qū)間刺參群體組織硒含量分布規(guī)律及差異性

圖2 刺參總硒含量（A）及無(wú)機(jī)硒含量（B）在不同地區(qū)間的差異比較Fig.2 Comparison of total selenium and inorganic selenium contents inApostichopus japonicusfrom different regions

由圖2可知，不同地區(qū)間刺參體內(nèi)硒的含量亦存在差異。在東營(yíng)刺參中呼吸樹組織總硒含量最高為18.719 mg/kg，在日照刺參中最低為9.877 mg/kg，在大連、煙臺(tái)、青島刺參中分別為12.599、16.263、13.397 mg/kg。方差分析表明，各地區(qū)間呼吸樹總硒含量有極顯著差異（P＜0.01）；刺參消化道中總硒含量煙臺(tái)群體最高為（15.585±0.310）mg/kg，東營(yíng)群體次之為（13.731±0.377）mg/kg，日照群體最低為（8.801±0.202）mg/kg，大連（9.569 mg/kg）和青島（9.830 mg/kg）刺參消化道中總硒含量接近（P＞0.05），分別與其他3個(gè)地區(qū)的差異極顯著（P＜0.01）；各地區(qū)刺參外壁、內(nèi)壁組織總硒含量呈現(xiàn)一致的變化規(guī)律：青島＞大連＞煙臺(tái)＞東營(yíng)＞日照（圖2A）。不同地區(qū)刺參無(wú)機(jī)硒含量對(duì)比發(fā)現(xiàn)，東營(yíng)地區(qū)刺參呼吸樹、消化道和肌肉中無(wú)機(jī)硒含量均高于其他地區(qū)，且各地區(qū)間無(wú)機(jī)硒含量在刺參呼吸樹、消化道和肌肉3個(gè)組織中均有顯著差異（P＜0.05），此外，青島、日照刺參群體內(nèi)壁無(wú)機(jī)硒含量分別和其他3個(gè)地區(qū)間有極顯著差異（P＜0.01），5個(gè)地區(qū)刺參的內(nèi)壁、外壁組織無(wú)機(jī)硒含量變化規(guī)律與總硒變化規(guī)律略有不同（圖2B）。

2.4 5個(gè)地區(qū)刺參群體各組織中有機(jī)硒及無(wú)機(jī)硒比例

圖3 不同地區(qū)刺參不同組織有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒比例Fig.3 Percentages of organic selenium and inorganic selenium in different tissues

通過差減法計(jì)算樣品中有機(jī)硒的含量，并計(jì)算出無(wú)機(jī)硒及有機(jī)硒占總硒的比例，見圖3。在刺參體壁和肌肉（食用部分）中有機(jī)硒比例為75.6%～89.4%（除東營(yíng)地區(qū)刺參群體肌肉組織的有機(jī)硒比例最低為53.6%）；呼吸樹和消化道（非食用部分）為無(wú)機(jī)硒比例較高的組織，呼吸樹無(wú)機(jī)硒含量比例為25.8%～65.2%，消化道無(wú)機(jī)硒含量為24.9%～51.4%。東營(yíng)地區(qū)刺參樣品各組織中無(wú)機(jī)硒的含量百分比均高于其他4個(gè)地區(qū)，其中呼吸樹無(wú)機(jī)硒比例高達(dá)65.2%。

3 討論與結(jié)論

3.1刺參不同組織間的硒含量差異分析

硒在刺參各組織中分布廣泛，且呈現(xiàn)不同程度的積累，與丁君等[11]研究的幼參不同組織對(duì)Zn2+、Cu2+的蓄積結(jié)果一致，另有研究結(jié)果表明，硒在其他水產(chǎn)動(dòng)物各器官的分配也各不相同[12-13]。刺參不同組織間硒含量有顯著性差異，主要原因是各組織對(duì)硒的富集能力及代謝過程不同。刺參呼吸樹組織中硒含量均高于其他組織。毛文君等[14]研究發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)硒以被動(dòng)吸收的形式滲透進(jìn)入細(xì)胞以及一些貝類（紫貽貝和海灣扇貝）的外套膜中硒含量也明顯高于其他組織中的，而刺參的呼吸樹起到貝類中鰓的作用，所以硒的蓄積量相對(duì)較高，因此呼吸樹中的硒含量可以在一定程度上反映出環(huán)境中的硒含量。此外，呼吸樹中無(wú)機(jī)硒含量也偏高，推測(cè)一方面是因?yàn)榄h(huán)境中無(wú)機(jī)硒含量偏高，另一方面是因?yàn)楦患臒o(wú)機(jī)硒不能通過呼吸樹被吸收。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5個(gè)刺參群體呼吸樹總硒與無(wú)機(jī)硒含量變化幾乎呈現(xiàn)一致的規(guī)律，且呼吸樹中的無(wú)機(jī)硒比例最高，進(jìn)一步說(shuō)明呼吸樹由于濾水作用而引起的硒富集是不可忽略的；刺參消化道中硒含量普遍偏高。有研究者對(duì)畜禽動(dòng)物進(jìn)行的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，以硒（Ⅳ）和硒（Ⅵ）存在形式的無(wú)機(jī)硒主要通過小腸被動(dòng)吸收，而以氨基酸形式為主的有機(jī)硒也是通過小腸被吸收，但運(yùn)輸機(jī)制是主動(dòng)吸收[15]。此外，刺參的消化道結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，沒有消化腺，也沒有特化出與解毒作用和排泄作用相關(guān)的組織和器官[11]，吸收進(jìn)入體內(nèi)的硒主要在腸中積累，因此刺參消化道中總硒的含量普遍偏高。此外，消化道中的無(wú)機(jī)硒的含量較高，推測(cè)原因?yàn)榄h(huán)境中以無(wú)機(jī)價(jià)態(tài)硒含量較高，消化道吸收的大量無(wú)機(jī)硒未完全轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒而進(jìn)入其他組織；刺參肌肉組織中硒值僅低于呼吸樹和腸組織中硒值。有相關(guān)研究表明，肌肉是動(dòng)物體內(nèi)硒庫(kù)之一[16]，以硒蛋氨酸的形式存在于肌蛋白中，并在蛋氨酸充足的情況下，轉(zhuǎn)變?yōu)槲腚装彼?，同理推測(cè)硒在刺參體內(nèi)最終以硒代氨基酸的形式穩(wěn)定貯存在肌肉中；刺參內(nèi)壁、外壁組織中硒含量相差不大，且明顯低于其他3個(gè)組織。主要因?yàn)榇虆Ⅲw壁的膠原蛋白中蛋氨酸和半胱氨酸的比例較低[17]，所以硒蓄積量低于肌肉組織中的。

3.2不同地區(qū)間的刺參硒含量差異分析

有研究表明，海洋動(dòng)物對(duì)重金屬的累積量與其環(huán)境海水中重金屬含量具有指數(shù)相關(guān)[18]。侯淑敏等[19]報(bào)道富硒地區(qū)水產(chǎn)品硒含量明顯高出普通地區(qū)，與養(yǎng)殖環(huán)境中的硒有很大的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)中東營(yíng)刺參群體呼吸樹中總硒含量最高，但在腸中并不是最高的，且肌肉、外壁及內(nèi)壁組織中的總硒含量也比大連、煙臺(tái)、青島刺參群體的低，同時(shí)東營(yíng)刺參群體各組織中無(wú)機(jī)硒含量普遍偏高，此外，東營(yíng)刺參群體腸中有機(jī)硒比例很低（48.6%），且外壁、內(nèi)壁和肌肉中的有機(jī)硒比例也低于以上3個(gè)地區(qū)群體組織，推測(cè)是因?yàn)辄S河徑流排入海洋中大量的含硒廢水[20]，黃河口淺海區(qū)海水與外界海水對(duì)流混合緩慢，硒大量沉積于淤泥中后通過復(fù)雜的食物鏈被刺參富集；或者推測(cè)另外的因素為刺參對(duì)不同形態(tài)的硒具有選擇吸收性，東營(yíng)水環(huán)境中刺參可利用硒含量較低，其詳細(xì)機(jī)理有待進(jìn)一步探討。相反，日照刺參群體呼吸樹組織中總硒含量最低，推測(cè)日照地區(qū)取樣海區(qū)含硒量較低或可被刺參利用的硒含量低。同時(shí)腸中總硒含量相對(duì)偏高，而肌肉、外壁及內(nèi)壁組織中總硒含量也并不高，推測(cè)原因?yàn)榈臀h(huán)境有利于刺參對(duì)硒的吸收代謝，但不利于硒的積累。總之，外環(huán)境中硒含量偏高或偏低以及可利用的硒形態(tài)較少均不利于吸收代謝和積累。

刺參不同地區(qū)間的硒含量差異，不僅與養(yǎng)殖水環(huán)境相關(guān)，還與刺參的攝食結(jié)構(gòu)、發(fā)育階段、生長(zhǎng)周期等生物學(xué)因素密切相關(guān)。在自然界中，刺參主要附著在礁石等附著基上，以海藻和海浮泥等沉積物為主要餌料的刺參攝食復(fù)雜[21]。實(shí)驗(yàn)中刺參均選自圍堰養(yǎng)殖的成參，5個(gè)地區(qū)圍堰海區(qū)的生態(tài)環(huán)境均不同，底棲動(dòng)物的種類組成及群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多樣性[22]，若需探索其更深層次的規(guī)律，則需要進(jìn)一步研究養(yǎng)殖刺參水體中的微觀生態(tài)環(huán)境及海水環(huán)境中的硒元素指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。另外不同刺參苗種來(lái)源其攝取硒的能力及刺參的生長(zhǎng)期不同亦可能影響地區(qū)間刺參硒值差異。

3.3測(cè)定無(wú)機(jī)硒的意義

不同形態(tài)的硒具有不同的生物學(xué)活性，所以僅由總硒含量并不足以了解其對(duì)人體健康的影響。Caroli[23]認(rèn)為形態(tài)分析是鑒定和測(cè)量對(duì)人體健康和環(huán)境有危害的各種形式的無(wú)機(jī)物，研究結(jié)果表明無(wú)機(jī)硒的毒性遠(yuǎn)高于有機(jī)硒，且有機(jī)硒毒性小、生物活性高[24]。但是中國(guó)水產(chǎn)品中硒的限量要求（GB 2762—2005《食品中污染物限量》）及我國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦硒的安全攝入量（50～200μg/d）都是根據(jù)總硒含量而定的，忽略了毒性較大的無(wú)機(jī)硒含量。而路文彬[25]利用富硒乳酸桿菌做的相關(guān)研究表明微量硒元素在人體內(nèi)之所以能參與許多生理功能，主要取決于有機(jī)硒的作用，無(wú)機(jī)硒作用很差。因此在測(cè)定水產(chǎn)品中的硒時(shí)，進(jìn)行測(cè)定不同形態(tài)的硒含量非常重要。實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的無(wú)機(jī)硒、有機(jī)硒含量及比例，可以保證基本的硒安全攝入量。呼吸樹及腸中有毒的無(wú)機(jī)硒比例偏高，不建議食用，而可食用部分體壁及肌肉中無(wú)機(jī)硒含量極其低，有機(jī)硒含量高，同時(shí)作為刺參的主要可食用部分是可以安全食用的。此外，測(cè)定無(wú)機(jī)硒及有機(jī)硒含量還可以為確定刺參體內(nèi)無(wú)機(jī)態(tài)硒離子及有機(jī)態(tài)的小分子硒化物含量及化學(xué)結(jié)構(gòu)奠定研究基礎(chǔ)，進(jìn)一步準(zhǔn)確分析硒在刺參體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)利用性。

刺參體內(nèi)硒含量非常豐富，測(cè)定刺參不同部位硒含量及形態(tài)分布對(duì)于了解硒在刺參體內(nèi)的分布規(guī)律具有重要意義。此外，舍棄無(wú)機(jī)硒含量高的呼吸樹及消化道，合理膳食刺參體壁和肌肉，可以充分利用活性高的有機(jī)硒，以避免無(wú)機(jī)硒中毒，為指導(dǎo)人們合理膳食提供了重要依據(jù)。同時(shí)需要說(shuō)明的是，各種硒化合物代謝是復(fù)雜的，并不能將簡(jiǎn)單的吸收測(cè)定與生物利用等同，還需要進(jìn)一步完善氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法與反相高效液相色譜、氣相色譜、毛細(xì)管電泳、凝膠色譜等的聯(lián)用技術(shù)，研制高純度的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)，測(cè)定生物體內(nèi)的不同硒代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步深入探究硒的作用機(jī)理，以促進(jìn)刺參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

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Analysis of Total Selenium and Inorganic Selenium in Apostichopus japonicus from Different Regions by Hydride Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry

LI Xiumei1,2, SUN Guohua2, YANG Jianmin2,*, REN Lihua2, MA Yuanqing2, GU Weili2, ZHANG Jian2, LIU Zhaocun3
(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 3. Shandong Huachun Fisheries Co. Ltd., Dongying 257236, China)

This study aimedto explore the selenium status ofApostichopus japonicusfrom the Yellow Sea and the Bohai Sea. Total selenium and inorganic selenium were detected by hydride generation-atomic fluorescence spectrometry (HGAFS). This method had a wide linear dynamic range and good precision and accuracy, so it was suitable for the determination of different forms of selenium in aquatic products. Selenium levels in four populations ofApostichopus japonicusfrom Dalian, Dongying, Yantai, Qingdao, and Rizhao respectively were examined. Among five tissues investigated, respiratory tree contained the highest levels of organic selenium and inorganic selenium which were averaged at (14.171±3.412) and (6.194±3.829) mg/kg, respectively, and both of which followed the same decreased order of respiratory tree＞digestive tract＞muscle＞inner body wall＞outer body wall. The proportions of organic selenium in body wall and muscle (the edible part) were between 75.6%and 89.4%, except forApostichopus japonicasmuscle from Dongying containing the lowest level (53.6%) of organic selenium. There were significant differences in the contents of total selenium and inorganic selenium in the same tissues from different regions, and the contents of inorganic selenium in respiratory tree, digestive tract and muscle were higher in Dongying population than in those from other regions.

hydride generation-atomic fluorescence spectrometry (HG-AFS);Apostichopus japonicus; total selenium; inorganic selenium; organic selenium

O657.31；TS207.3

A

1002-6630（2015）12-0113-06

10.7506/spkx1002-6630-201512021

2014-11-03

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013CM029）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系刺參創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-08）；

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家基金項(xiàng)目（Y231041011）；煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012133）；

海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目（20130125）；國(guó)家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201205027；201105029）

李秀梅（1989—），女，碩士研究生，主要從事海洋生物遺傳育種研究。E-mail：saishangxunmei@163.com

*通信作者：楊建敏（1967—），男，研究員，博士，主要從事海洋生物遺傳育種研究。E-mail：ladderup@126.com