2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉酮類化合物對海洋浮游生物的生長抑制活性研究

劉冬東，施佳樂，胡 玥，王愛明，王向輝，林 強(qiáng)，楊建新*

(1. 海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院，海南 ?？?570228；2.熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南 ?？?570228；3.海南省精細(xì)化工工程技術(shù)研究中心，海南 海口 570228；4.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院, 海南 海口571158)

2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉酮類化合物對海洋浮游生物的生長抑制活性研究

劉冬東1,2,3，施佳樂1,2,3，胡 玥1,2,3，王愛明1,2,3，王向輝4，林 強(qiáng)4，楊建新*1,2,3

(1. 海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院，海南 海口 570228；2.熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南 ?？?570228；3.海南省精細(xì)化工工程技術(shù)研究中心，海南 ?？?570228；4.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院, 海南 ?？?71158)

本文研究了13個2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉-3-酮類化合物對球等鞭金藻Isochrysisgalbana、亞心形扁藻Platymonassubcordiformis及舟形藻Navicula的生長抑制性能，并測試了其對藤壺二期無節(jié)幼蟲的生物活性。結(jié)果表明：2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉-3-酮類化合物對球等鞭金藻、亞心形扁藻和舟形藻都有良好的生長抑制活性，其中對球等鞭金藻和亞心形扁藻的抑制作用較強(qiáng)；對藤壺幼蟲的生物活性測試表明，化合物最低質(zhì)量濃度為2.0 mg/L時，除化合物g和l，都具有良好的生長抑制活性?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)與浮游生物的生長抑制活性關(guān)系表現(xiàn)為間位取代優(yōu)于對位取代。

苯并異噻唑啉酮；藻類；藤壺；生物活性

0 引言

海洋污損生物是生長在海中船底和其他人工設(shè)施表面的動物、植物和微生物的總稱，海中設(shè)施因長生物而造成的危害稱生物污損[1]。污損生物吸附在船底，會增加船底表面的粗糙度、增加船舶航行的阻力、降低航速，增加燃油消耗，腐蝕船底，破壞船體；附著在金屬表面，可導(dǎo)致涂層破損，使金屬裸露，加快腐蝕；附著在海底管道的內(nèi)表，可使管徑縮小，甚至堵塞管道，因此,海洋污損是迫切需要解決的重要研究方向之一[2-4]。目前，全世界每年由生物污損造成的損失已經(jīng)嚴(yán)重影響了人們對海洋資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用[5]。

涂覆防污涂料是目前常用的理想和方便的防除海洋生物污損的方法之一。早期傳統(tǒng)型的防污涂料主要以有機(jī)錫和氧化亞銅為主要成分，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)這類防污劑在防除污損生物的同時，也引起了環(huán)境污染問題[6-7]。本文所研究的異噻唑啉酮類化合物是一類高效、低毒的新型廣譜殺菌劑，它具有對環(huán)境安全等優(yōu)點，被用于新型海洋防污劑的開發(fā)，目前也已經(jīng)有商品化的該類防污劑[8-10]。

本文以實驗室合成的13種2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉-3-酮類化合物[11]為活性物質(zhì)，測試其對球等鞭金藻Isochrysisgalbana、亞心形扁藻Platymonassubcordiformis、舟形藻Navicula的生長抑制狀況，并研究其對藤壺二期無節(jié)幼蟲的抑制活性，探索化合物結(jié)構(gòu)與生物性能關(guān)系，以期篩選出高效、低毒的新型防污劑。

1 實驗材料

1.1 儀器與試劑

主要儀器：智能氣候培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，紫外分光光度計，血球計數(shù)板，LED光源。實驗采用的浮游生物種類：球等鞭金藻，亞心形扁藻，舟形藻(取自海南大學(xué)海洋學(xué)院)；藤壺幼蟲。所用藥品均為市售分析純，使用前未作處理。

13種受試化合物2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉-3-酮(純度為95%以上)由1,2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT)為原料合成得到[11](圖1)。

圖1 目標(biāo)化合物Fig.1 Target compounds

1.2 藻類生長抑制試驗

藻類的培養(yǎng)條件為：鹽度為8%，溫度為25±1 ℃，pH為8.0±0.5。培養(yǎng)基的主要成分：FeCl3·6H2O，NaH2PO4·H2O，Na2EDTA·2H2O，CuSO4·5H2O，Na2MoO4·2H2O，ZnSO4·7H2O，CoCl2·6H2O，MnCl2·4H2O，VB12和VB1。

通過紫外分光光度計全波長掃描獲取藻液的最大吸收波長。球等鞭金藻、亞心形扁藻、舟形藻最大吸收波長分別為428, 680和342 nm。實驗采用血球計數(shù)板，計數(shù)測得各稀釋液的藻液濃度,并在最大吸收波長處測量各稀釋液的吸光值，作出以吸光值為橫坐標(biāo)，藻液濃度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

將培養(yǎng)的藻液用營養(yǎng)液稀釋成一定濃度，使其吸光值在0.05～0.1之間，取200 mL配制好的待測藻液置于錐形瓶中。配制質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的待測化合物，取1 mL加入到各錐形瓶，其中一個錐形瓶留作空白，每組均設(shè)3個平行實驗。每隔12 h測定各錐形瓶吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制時間-藻液濃度曲線[12]。

1.3 藤壺的生物活性實驗

海水取自海口市白沙門，經(jīng)過濾、煮沸消毒后備用。藤壺采取后先清除表面的淤泥，放在黑暗處，陰干處理2 h后，放入1 000 mL大燒杯中并裝入新鮮海水，陽光刺激1 h 后可獲得大量藤壺二期無節(jié)幼蟲。用LED燈照射，小心吸取燒杯上層的藤壺幼蟲，置于另一燒杯中，加入過濾滅菌后的新鮮海水，嚴(yán)格控制藤壺幼蟲的密度，培養(yǎng)溫度約為25 ℃，供實驗用。

通過預(yù)實驗將目標(biāo)化合物分別配制成質(zhì)量濃度為2、4、6、8和10 mg/L的受試溶液，并設(shè)BIT和海水作為對照組。用滴管小心吸取藤壺幼蟲，先用與各組實驗質(zhì)量濃度相同的毒液潤洗后再放入培養(yǎng)皿中。每個培養(yǎng)皿中藤壺幼蟲數(shù)為30只。分別在投入藤壺12和24 h后用體視顯微鏡觀察幼蟲存活情況[13-14]。當(dāng)藤壺停止游動靜止不動時作為藤壺死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻類生長抑制實驗結(jié)果分析

實驗以加受試化合物藻液為實驗組,以加BIT的藻液為對照組。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出不同作用周期藻液濃度的變化。

圖2 化合物對球等鞭金藻的影響Fig.2 The impact of compounds on Isochrysis galbana

由圖2可知，目標(biāo)化合物對球等鞭金藻的生長具有一定抑制作用，當(dāng)R不同時，對球等鞭金藻表現(xiàn)出不同的抑制活性。化合物b、c、d、h、i、j、l和m均具有良好的對球等鞭金藻的抑制活性，且抑制活性優(yōu)于BIT，其中對甲基取代的化合物b和間甲基取代的化合物d的抑制活性最強(qiáng)，完全抑制球等鞭金藻的生長。無取代基的化合物a和間溴取代的化合物k對球等鞭金藻的抑制活性弱于BIT。對甲氧基取代的化合物e、對乙氧基取代的化合物f和對氯取代的化合物g對球等鞭金藻的抑制活性與BIT相當(dāng)。同時可以看出，當(dāng)R取代位置相同時，表現(xiàn)為供電子基團(tuán)優(yōu)于吸電子基團(tuán)；當(dāng)R取代位置不同時，通常表現(xiàn)為間位優(yōu)于對位優(yōu)于鄰位。

目標(biāo)化合物對亞心形扁藻的生長具有一定抑制作用(圖3)。當(dāng)R不同時，對亞心形扁藻表現(xiàn)出不同的抑制活性。由圖3可見，化合物c、g、h、i、l和m表現(xiàn)出對亞心形扁藻很強(qiáng)的抑制活性，且抑制活性優(yōu)于BIT，其中間氯取代的化合物i、對硝基取代的化合物l和間硝基取代的化合物m的抑制活性最強(qiáng)，完全抑制亞心形扁藻的生長。而對甲氧基取代的化合物e、對溴取代的化合物j和間溴取代的化合物k對亞心形扁藻的抑制活性弱于BIT。無取代基的化合物a、對甲基取代的化合物b、間甲基取代的化合物d及對乙氧基取代的化合物f對亞心形扁藻的抑制活性與BIT相當(dāng)。同時可以看出，當(dāng)R取代位置相同時，表現(xiàn)為吸電子基團(tuán)優(yōu)于供電子基團(tuán)，且吸電子基團(tuán)的電負(fù)性越大，抑制活性越好；當(dāng)R取代位置不同時，通常表現(xiàn)為間位優(yōu)于對位。

圖3 化合物對亞心形扁藻的影響Fig.3 The impact of compounds on Platymonas subcordiformis

由圖2～圖4可以看出，13種化合物對球等鞭金藻、亞心形扁藻和舟形藻的生長都有一定的抑制作用，通常表現(xiàn)為間位取代優(yōu)于對位取代。鄰甲基取代的化合物c、間氯取代的化合物i、對硝基取代的化合物l和間硝基取代的化合物m對3種藻的生長抑制作用都優(yōu)于BIT。其中，對甲基取代的b和間甲基取代的d對球等鞭金藻的生長抑制最強(qiáng)；而間氯取代的i、對硝基取代的l和間硝基取代的m對亞心形扁藻的生長抑制最強(qiáng)。間溴取代的化合物k對3種藻的生長抑制作用都弱于BIT，對乙氧基取代的化合物f對3種藻的生長抑制作用都與BIT相當(dāng)。

比較實驗中3種藻對化合物的耐受性，其中，舟形藻耐受性最高，球等鞭金藻和亞心形扁藻的耐受性較低。

圖4 化合物對舟形藻的影響Fig.4 The impact of compounds on Navicula

2.2 藤壺的生物活性實驗結(jié)果分析

根據(jù)實驗所得不同質(zhì)量濃度的受試液中死亡率的數(shù)據(jù)，分析各化合物對藤壺二期幼蟲的急性毒性效應(yīng)，以受試化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間12和24 h藤壺幼蟲的死亡率為縱坐標(biāo)，分別作圖5和圖6。

圖5 化合物對藤壺幼蟲的毒性效應(yīng)(12 h)Fig.5 Chemical toxicity effect on barnacle larvae(12 h)

在培養(yǎng)周期為12 h實驗中，受試液質(zhì)量濃度為10 mg/L時，除化合物a、d、f和BIT外其他化合物對藤壺幼蟲的致死率可達(dá)100%(圖5)。其中在受試液質(zhì)量濃度為8 mg/L時，化合物g和l對藤壺幼蟲的致死率可達(dá)100%。同時，可以看出，隨受試液質(zhì)量濃度的不斷增加，藤壺幼蟲的死亡率在不斷增加，且各化合物的增加趨勢均優(yōu)于BIT，也即藤壺幼蟲對目標(biāo)化合物的敏感性優(yōu)于BIT，其中，當(dāng)受試液質(zhì)量濃度為2 mg/L時，化合物g和l對藤壺幼蟲的致死率都不高，當(dāng)受試質(zhì)量濃度增加到8 mg/L時，藤壺幼蟲均完全死亡，說明在2～8 mg/L之間，藤壺幼蟲對2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉-3-酮化合物極為敏感，微量化合物就會有明顯的毒殺效果。

從圖6可以看出，在培養(yǎng)周期為24 h實驗中，受試液質(zhì)量濃度為10 mg/L時除BIT外其他化合物對藤壺幼蟲的致死率均達(dá)到100%，由此可見，各化合物對藤壺幼蟲均有一定的毒殺作用，且毒殺效果優(yōu)于BIT。同時，可以看出，隨受試液質(zhì)量濃度的不斷增加，藤壺幼蟲的死亡率在不斷增加，在2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉-3-酮化合物質(zhì)量濃度為2～8 mg/L范圍內(nèi)，藤壺幼蟲的死亡趨勢最大。

圖6 化合物對藤壺幼蟲的毒性效應(yīng)(24 h)Fig.6 Chemical toxicity effect on barnacle larvae (24 h)

由圖5和圖6都可以得出，隨2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉-3-酮化合物質(zhì)量濃度的增加，藤壺幼蟲的死亡率升高，各化合物對藤壺幼蟲的毒性效應(yīng)增強(qiáng)。分析圖5和圖6實驗結(jié)果表明，在相同實驗質(zhì)量濃度下，24 h的致死率均大于12 h的致死率，這說明隨時間的延長，各化合物對藤壺的毒性效應(yīng)不斷增強(qiáng)。同時，可以看出，12和24 h時，各化合物對藤壺幼蟲的致死率變化趨勢均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于BIT。

半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)指使全部實驗對象中的半數(shù)死亡所需的質(zhì)量濃度，它是衡量毒性大小的重要參數(shù)[16-17]，采用概率單位法計算藤壺二期無節(jié)幼蟲的半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)如表1所示。

表1 13種有機(jī)化合物對網(wǎng)紋藤壺Ⅱ期無節(jié)幼蟲的LC50Tab.1 The LC50 of thirteen benzoisothiazoles on barnacle larvae

從表1可看出，13種目標(biāo)化合物對藤壺幼蟲均有一定的毒性效應(yīng)，各化合物實驗周期為12和24 h的LC50均低于對照組BIT，證明受試化合物對藤壺幼蟲的毒殺效果優(yōu)于原料BIT。由實驗周期為12和24 h的LC50可知，隨作用時間的延長，化合物對藤壺幼蟲的毒性作用不斷增加。根據(jù)表1中各化合物的 LC50數(shù)值，表明LC50還與各化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)，取代基R為吸電子基團(tuán)的化合物其LC50值較供電子基團(tuán)的化合物低，這說明R為吸電子基團(tuán)時對藤壺幼蟲的毒殺作用相對較好；當(dāng)R為相同基團(tuán)時，R的位置對該化合物的毒性作用也有差異，毒性效果通常表現(xiàn)為鄰位取代優(yōu)于間位取代優(yōu)于對位取代。

3 結(jié)論

(1)2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉-3-酮化合物對球等鞭金藻、亞心形扁藻和舟形藻的生長都有一定的抑制作用，通常表現(xiàn)為間位取代優(yōu)于對位取代，其中化合物c、i、l和m對3種藻的生長抑制作用較強(qiáng)。分析各藻的耐受性表明，舟形藻耐受性最高，球等鞭金藻和亞心形扁藻的耐受性較低。

(2)2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉-3-酮化合物對藤壺幼蟲均具有一定的毒性作用，同時表現(xiàn)出在不同質(zhì)量濃度區(qū)間敏感性存在差異。實驗12和24 h的毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)表明，毒性作用隨化合物質(zhì)量濃度的增加以及作用時間的延長而提高。LC50數(shù)據(jù)表明當(dāng)取代基R連接吸電子基團(tuán)時對藤壺幼蟲的毒性效果較連接供電子基團(tuán)好。當(dāng)連接相同R時，R的位置對化合物毒性作用也有一定影響，通常表現(xiàn)的是鄰位優(yōu)于間位優(yōu)于對位。

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The inhibitory activities of marine plankton by 2-(N-arylaminomethyl)-3-oxo-benzo[d]isothiazoles

LIU Dong-dong1,2,3, SHI Jia-le1,2,3, HU Yue1,2,3, WANG Ai-ming1,2,3, WANG Xiang-hui4, LIN Qiang4, YANG Jian-xin*1,2,3

(1.CollegeofMaterialandChemicalEngineering,HainanUniversity,Haikou570228,China;2.KeyLaboratoryofTropicalBiologicalResourcesofMinistryofEducation,Haikou570228,China; 3.HainanProvincialFineChemicalEngineeringResearchCenter,Haikou570228,China;4.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HainanNormalUniversity,Haikou571158,China)

The growing inhibitory properties onIsochrysisgalbana,PlatymonassubcordiformisandNaviculaof thirteen 2-(N-arylaminomethyl)-3-oxo-benzo[d]isothiazoles were investigated, and the effects on biological activity of barnacle nauplii were also studied. The results indicate that the tested compounds have favourable growing inhibitory activities to the marine algas, and the better inhibitory activities are onIsochrysisgalbanaandPlatymonassubcordiformis. The results also indicate when the lowest concentration is 2.0 mg/L, the tested compounds show a favourable growing inhibitory activity on barnacle larvae except the compound g and l. The relationship between compounds’ structure and plankton growth inhibitory activity reveals that meta-substituent is better than para-substituent.

benzoisothiazoles; algae; barnacle; biological activity

10.3969/j.issn.1001-909X.2015.03.007.

2015-02-03

2015-05-06

國家自然科學(xué)基金項目資助(20962007)

劉冬東(1989-)，男，安徽六安市人，主要從事精細(xì)化學(xué)品的合成與分析研究。E-mail: gilliankelly@163.com

*通迅作者:楊建新(1971-)，男，教授，主要從事精細(xì)化學(xué)品的合成與分析以及熒光增白劑的合成方面的研究。E-mail:yangjxmail@sohu.com

TQ637.3

A

1001-909X(2015)03-0048-06

10.3969/j.issn.1001-909X.2015.03.007

劉冬東，施佳樂，胡玥，等. 2-(N-芳基氨甲基)苯并異噻唑啉酮類化合物對海洋浮游生物的生長抑制活性研究[J]. 海洋學(xué)研究,2015,33(3):48-53,

LIU Dong-dong, SHI Jia-le, HU Yue, et al. The inhibitory activities of marine plankton by 2-(N-arylaminomethyl)-3-oxo-benzo[d]isothiazoles[J]. Journal of Marine Sciences, 2015,33(3):48-53, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.03.007.