北冰洋海單胞菌β-D-半乳糖苷酶的異源表達(dá)及酶學(xué)特性研究

孫茜，廖麗，丁海濤，劉雙，陳波*

(1. 華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，上海 200237；2.中國(guó)極地研究中心 國(guó)家海洋局極地科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200136)

北冰洋海單胞菌β-D-半乳糖苷酶的異源表達(dá)及酶學(xué)特性研究

孫茜1，2，廖麗2，丁海濤2，劉雙1，陳波1，2*

(1. 華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，上海 200237；2.中國(guó)極地研究中心 國(guó)家海洋局極地科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200136)

初篩表明，一株分離自北極加拿大海盆海冰心芯樣品的海單胞菌(Marinomonassp. BSi20584)具有較高的β-D-半乳糖苷酶活性，為了研究清楚其酶學(xué)性質(zhì)，將經(jīng)hiTAIL-PCR擴(kuò)增得到的β-D-半乳糖苷酶基因(galt)與pET-28a(+)原核表達(dá)載體結(jié)合，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后對(duì)重組β-D-半乳糖苷酶(GALT)的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用金屬螯合親和層析技術(shù)制備純酶，并對(duì)重組GALT的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，重組酶的最適誘導(dǎo)溫度為20℃，在IPTG濃度為0.07 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)22 h后，酶活和產(chǎn)酶量達(dá)到最大值。GALT單體分子量約為6.6×104g/mol，天然酶為同源三聚體。GALT最適作用溫度為35℃，其熱穩(wěn)定性較好，在60℃處理5 h后，仍可保持50%以上的相對(duì)活性。GALT的最適作用pH為9.0，在pH為6.0～11.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。GALT的最適NaCl濃度為0.5 mol/L，對(duì)鹽度具有較高的耐受性。Mg2+、K+、DTT和EDTA對(duì)酶活不具有顯著影響，而Mn2+、Fe2+對(duì)酶活有促進(jìn)作用，Zn2+和L-谷胱甘肽對(duì)酶活有抑制作用。GALT對(duì)Gal β1-4 GlcNAc具有水解作用，而對(duì)Gal β1-3 GalNAc和Gal β1-3 GlcNAc糖苷鍵型沒(méi)有水解能力。本研究實(shí)現(xiàn)了海單胞菌屬菌株的β-D-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌系統(tǒng)中的高效表達(dá)，并系統(tǒng)研究了重組酶的酶學(xué)特性，為后續(xù)開展該酶的代謝適應(yīng)性和潛在應(yīng)用研究提供詳細(xì)的酶學(xué)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

北冰洋；海單胞菌；β-D-半乳糖苷酶；異源表達(dá)；酶學(xué)特性

1 引言

β-D-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)能夠催化水解半乳糖苷類物質(zhì)，釋放其末端的非還原性半乳糖分子，它存在于自然界很多微生物、動(dòng)物和植物中，來(lái)源不同的β-D-半乳糖苷酶其酶學(xué)性質(zhì)也不盡相同[1]。迄今，已有100多種β-D-半乳糖苷酶提交到各類數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)其功能的相似性可將其分為4個(gè)家族：GH1，GH2，GH35和GH42[2]。

多數(shù)β-D-半乳糖苷酶是由微生物產(chǎn)生的，包括中溫菌、嗜熱菌和嗜冷菌等[3]。隨著β-D-半乳糖苷酶研究的不斷深入，該酶的應(yīng)用不再局限于乳糖水解，而是廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、免疫、環(huán)境檢測(cè)、基因診斷和基因治療等多個(gè)領(lǐng)域，已取得了可觀的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，具有廣闊的市場(chǎng)前景[4]。

海單胞菌是一種海洋性細(xì)菌，目前已知有7個(gè)海單胞菌來(lái)源的β-D-半乳糖苷酶基因，均是通過(guò)基因組測(cè)序得到，其中Marinomonassp. MWYL1的基因組中含有兩個(gè)β-D-半乳糖苷酶基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Marinomonas+sp.+MWYL1)，分別屬于GH42家族和GH2家族；Marinomonassp. MED121和Marinomonassp. D104[5]中各含有一個(gè)屬于GH42家族的酶基因；MarinomonasposidonicaIVIA-Po-181[6]中含有兩個(gè)β-D-半乳糖苷酶基因，分別屬于GH42家族和GH1家族；MarinomonasmediterraneaMMB-1[7]中含有一個(gè)屬于GH1家族的酶基因。

本研究以北極加拿大海盆海冰冰心中分離的Marinomonassp. BSi20584為研究菌株，通過(guò)hiTAIL-PCR技術(shù)獲得該菌株產(chǎn)生的β-D-半乳糖苷酶基因galt，并將該基因克隆至大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)重組酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為該酶的代謝適應(yīng)性和潛在應(yīng)用研究提供詳細(xì)酶學(xué)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

海單胞菌Marinomonassp. BSi20584分離自北極加拿大海盆海冰上層冰心，現(xiàn)保存于中國(guó)極地研究中心極地微生物菌種保藏管理中心(BSi20584)和中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC 1C00250)。原核表達(dá)載體pET-28a(+)由中國(guó)極地研究中心極地微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Biomed公司；蛋白Marker購(gòu)自Thermo公司；Bradford蛋白定量試劑盒、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA marker、IPTG和卡那霉素購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；Ni-NTA為Bio-rad公司產(chǎn)品；Taq酶購(gòu)自上海生工生物公司；氨基色譜柱購(gòu)自CNW；色譜純?cè)噭┵?gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；PA-Sugar Chain 026(10 pmol/μL)、PA-Sugar Chain 028(10 pmol/μL)、PA-Sugar Chain 042(10 pmol/μL)、PA-Glc(1 pmol/μL)、Fastpfu高保真酶、BamHI、XhoI限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；引物由上海生工生物公司合成。

2.2 方法

2.2.1 基因的擴(kuò)增與原核表達(dá)載體的構(gòu)建

基于hiTAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的β-D-半乳糖苷酶基因序列[8]，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，同時(shí)引入BamHI、XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，F(xiàn)584∶5′-CGCGGATCCATGAAATTAGGT GTGTGTTATT-3′，R584∶5′-CCGCTCGAGTTATTGTTTTTTCCAAATGG-3′。以野生型BSi20584全基因組DNA為模板，用Fastpfu高保真酶擴(kuò)增β-D-半乳糖苷酶基因。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后割膠回收。使用BamHI、XhoI分別對(duì)pET-28a(+)質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切處理，酶切產(chǎn)物割膠回收后于16℃過(guò)夜連接。將構(gòu)建的原核表達(dá)載體命名為pET-28/galt。

2.2.2 β-D-半乳糖苷酶基因序列分析

將擴(kuò)增得到的基因序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)同源性比對(duì)，選取同源性大于70%的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而觀察其進(jìn)化上的相關(guān)關(guān)系。用Protean 5.01進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析[9]，同時(shí)用Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，用Swiss-pdbviewer 4.10對(duì)催化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.2.3 galt酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)與純化

將pET-28/galt重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用50 μg/μL的卡那霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性單克隆送測(cè)。將驗(yàn)證成功的重組菌于含50 μg/μl卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，然后加入不同濃度IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)不同誘導(dǎo)條件下的樣品取樣，8 000 rpm離心10 min收集菌體，用PBS重懸，在400 W功率下超聲破碎(超聲2 s，停3 s)30 min后，于12 000 rpm下離心20 min，收集上清得到粗酶液，沉淀用PBS重懸，用以分析酶的可溶性表達(dá)情況。由于重組菌含有6×His-tag標(biāo)簽，因此對(duì)重組酶采用鎳柱親和層析純化[10]，用不同濃度的咪唑洗脫，將洗脫液中有酶活的部分收集，SDS-PAGE分析重組酶純度。

2.2.4 酶活力測(cè)定

采用ONPG(鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)法測(cè)定酶活：將10倍稀釋過(guò)的酶液10 μL與90 μL ONPG混合，于37℃下反應(yīng)10 min后加入100 μL 1 mol/L Na￣2CO3終止反應(yīng)5 min，測(cè)定OD420，與ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照得到酶活。酶活力定義：在37℃條件下，每催化產(chǎn)生1 μmol ONP所需要的酶量為1 U[10]。

2.2.5 蛋白質(zhì)定量分析

用蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白量的測(cè)定，具體操作為：取20 μL酶液與200 μL Bradford試劑混合，室溫下放置5 min后測(cè)定OD595，然后與BSA(牛血清白蛋白)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照得到蛋白量。

2.2.6 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

(1)溫度對(duì)酶的影響：將酶液與反應(yīng)液混合后分別放置在0℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃下進(jìn)行，ONPG法測(cè)定酶活以檢測(cè)酶的最適作用溫度；先將等量酶液分別放置在40℃、50℃、60℃中處理相應(yīng)的時(shí)間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)后再與底物ONPG反應(yīng)，檢測(cè)酶的熱穩(wěn)定性。

(2)pH對(duì)酶的影響：用Britton-Robinson緩沖液(磷酸、乙酸、硼酸、氫氧化鈉混合液)將酶反應(yīng)體系分別調(diào)成3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，然后與ONPG反應(yīng)，測(cè)定酶反應(yīng)的最適pH；將等量酶液分別放在pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的Britton-Robinson緩沖液中處理1 h后ONPG法測(cè)定酶活，測(cè)定不同條件下酶的pH穩(wěn)定性。

(3)NaCl對(duì)酶的影響：分別配制含0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 mol/L NaCl的酶反應(yīng)體系，將酶反應(yīng)放置在上述鹽濃度梯度中進(jìn)行，以檢測(cè)酶的最適NaCl濃度；將等量酶液?jiǎn)为?dú)放置在上述鹽濃度梯度中處理1 h后再與底物反應(yīng)，檢測(cè)酶的耐鹽性。

(4)金屬離子和化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活的影響：在酶與底物ONPG的反應(yīng)體系中分別加入濃度為0.1 mmol/L到5 mmol/L的Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+，分析不同濃度金屬離子對(duì)酶活的影響；在酶與底物ONPG的反應(yīng)體系中分別加入10、20、30、40、50 mmol/L的DTT、EDTA和L-谷胱甘肽，分析上述化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活的影響。

(5)動(dòng)力學(xué)參數(shù)：用PBS配制不同濃度的ONPG溶液，取等量酶液與不同濃度的ONPG底物反應(yīng)，測(cè)定酶活，用OriginPro 8非線性擬合分析法作圖，求出Km和Vmax。

2.2.7 SDS-PAGE和Native-PAGE

SDS-PAGE條件：12%的分離膠和5%的濃縮膠，Marker范圍為14.4×103～116×103g/mol(Thermo)；Native-PAGE∶8%的分離膠和5%的濃縮膠，Marker范圍為5×103～250×103g/mol(Thermo)，預(yù)電泳30 min，電泳在冷庫(kù)中(4℃)進(jìn)行，以防止蛋白質(zhì)變性。用考馬斯亮藍(lán)G250進(jìn)行凝膠染色。

2.2.8 水解底物鍵型分析

用具有PA(吡啶氨基)熒光修飾的多糖(Sugar Chain，Takara)對(duì)重組酶的水解底物鍵型進(jìn)行分析。反應(yīng)體系為：50 pmol底物，5×10-3U酶，10 mol/L DTT，10 mmol/L MgCl2，緩沖液為0.01 mol/L的PBS(pH=7.4)。反應(yīng)20 h后將反應(yīng)液短暫離心后煮沸5 min，14 000 r/min離心10 min去除酶蛋白，取上清作為檢測(cè)樣品。色譜條件：檢測(cè)器：Waters 2475熒光檢測(cè)器；流動(dòng)相：200 mmol/L醋酸三乙胺(pH=7.3)：乙腈=35∶65；流速：1 mL/min；上樣量：30 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：Ex=310，Em=380[11]。

表1 糖標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)Tab.1 Structure of sugar standards

3 結(jié)果

3.1 galt基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以野生型海單胞菌BSi20584的全基因組為模板，F(xiàn)584和R584為引物，擴(kuò)增得到約2 000 bp的條帶。將目的片段割膠回收后用BamHI、XhoI雙酶切，同時(shí)對(duì)pET-28a(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，然后將酶切后的目的片段與pET-28a(+)載體用T4 DNA連接酶于16℃過(guò)夜連接。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，以檢測(cè)是否正確插入目的基因片段。將陽(yáng)性克隆送測(cè)結(jié)果顯示，galt基因全長(zhǎng)1 971 bp，共編碼656個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量大小約66×103g/mol。

3.2 galt基因序列分析

3.2.1 galt基因序列同源性分析

將galt基因序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，galt屬于GH42家族，與海單胞菌Marinomonassp. MWYL1中GH42家族的β-D-半乳糖苷酶基因相似性最高，兩者的基因序列一致性為93%，氨基酸序列一致性為95%。選取GenBank中與galt相似性高于70%的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。進(jìn)化樹主要分為3個(gè)大的分支A、B、C，分屬于嗜熱菌、亞棲熱菌和海單胞菌屬，galt與Marinomonassp. MWYL1中GH42家族的β-D-半乳糖苷酶親緣關(guān)系最接近，與另外4個(gè)同是海單胞菌來(lái)源的β-D-半乳糖苷酶也具有極高的親緣性，可推知海單胞菌GH42家族的β-D-半乳糖苷酶在進(jìn)化上非常保守。

圖1 galt產(chǎn)生菌Marinomonas sp. BSi20584系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig. 1 Phylogenetic tree of galt from Marinomonas sp. BSi20584

3.2.2 GALT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

分別用Garnier-Robson法和Chou-Fasman法對(duì)GALT酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成和分布進(jìn)行預(yù)測(cè)分析(圖2)。用Garnier-Robson法得出特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性結(jié)果為：有32個(gè)α螺旋區(qū)域，其中370～420之間有一個(gè)明顯的α螺旋聚集區(qū)；有17個(gè)β折疊區(qū)域，與α螺旋相比，排列稀疏且數(shù)量較少；44個(gè)轉(zhuǎn)角區(qū)域，45個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲；用Chou-Fasman法預(yù)測(cè)酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果為：α螺旋區(qū)域有26個(gè)，β折疊區(qū)域有24個(gè)，比用Garnier-Robson法預(yù)測(cè)的數(shù)量要多，分布相對(duì)廣泛，轉(zhuǎn)角區(qū)域有42個(gè)。豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了空間結(jié)構(gòu)的豐富性。

圖2 Marinomonas sp. BSi20584 GALT酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 Marinomonas sp. BSi20584 GALT secondary structure prediction

用Kyte-Doolittle法對(duì)GALT蛋白的親水性進(jìn)行分析，如圖3所示，GALT蛋白親水性氨基酸分布于整個(gè)序列中，與不親水的區(qū)域穿插分布，N端的親水性氨基酸含量比較高，疏水性片段很少，而C端的疏水性區(qū)域相對(duì)較多，在375～425處有一個(gè)明顯的疏水區(qū)，在蛋白質(zhì)中，肽鍵上的酰胺氫和羰基氧既能形成內(nèi)部α螺旋內(nèi)的氫鍵，也能與水分子形成氫鍵，但疏水環(huán)境不利于氫鍵的形成，反而會(huì)促進(jìn)形成α螺旋，所以在375～425處由于疏水區(qū)的存在，會(huì)極大提高α螺旋形成的概率，與用Garnier-Robson法和Chou-Fasman法對(duì)BGAL584-2酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成和分布進(jìn)行預(yù)測(cè)分析結(jié)果一致。

圖3 Marinomonas sp. BSi20584 GALT蛋白親水性分析Fig. 3 Hyrophilicity plot prediction of GALT from Marinomonas sp. BSi20584

用Emini法對(duì)GALT蛋白的表面可能性進(jìn)行分析，如圖4所示，發(fā)現(xiàn)該蛋白有相當(dāng)一部分氨基酸位點(diǎn)位于蛋白表面的可能性非常高，例如106位的Tyr、140位的Asp、282位的Glu、503位的Thr等氨基酸位點(diǎn)。

3.2.3 GALT蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

用Swiss-model預(yù)測(cè)GALT酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)，序列比對(duì)顯示該酶與同是GH42家族的ThermusthermophilusA4[12]的β-D-半乳糖苷酶氨基酸一致性最高(55.63%)，因此選擇ThermusthermophilusA4的β-D-半乳糖苷酶作為模板進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模，建模結(jié)果顯示GALT天然蛋白為同源三聚體結(jié)構(gòu)。根據(jù)ThermusthermophilusA4的β-D-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)域分布特征，對(duì)GALT蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的劃分，結(jié)果顯示在GALT單體中存在3個(gè)結(jié)構(gòu)域，如圖5所示，其中，domain A是由(β/α)8形成的TIM桶裝結(jié)構(gòu)，為催化結(jié)構(gòu)域；domain B為α/β折疊結(jié)構(gòu)域；domain C為β折疊構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域。ThermusthermophilusA4的β-D-半乳糖苷酶催化位點(diǎn)為Glu141和Glu312，利用Swiss-pdbviwer[13]進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在GALT蛋白結(jié)構(gòu)中與其對(duì)應(yīng)的是Glu142和Glu314。此外，ThermusthermophilusA4 β-D-半乳糖苷酶的第182位Trp是酶維持活性所必須的，它可以與其他亞基一起構(gòu)成活性區(qū)域的一部分，而在GALT中與之對(duì)應(yīng)的是Trp183，所以推測(cè)GALT的催化位點(diǎn)為Trp183、Glu142和Glu314(圖6)。

圖4 Marinomonas sp. BSi20584 GALT蛋白表面可及性分析Fig.4 Surface probability prediction of GALT from Marinomonas sp. BSi20584

圖5 Marinomonas sp. BSi20584 GALT三維結(jié)構(gòu)的同源建模Fig.5 Homology modeling of GALT from Marinomonas sp. BSi20584

圖6 Marinomonas sp. BSi20584 GALT催化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.6 Catalytic residues prediction of GALT from Marinomonas sp. BSi20584

3.3 重組蛋白的表達(dá)

將構(gòu)建成功的重組載體pET-28/galt轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LB培養(yǎng)基后，用含50 μg/μL卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)到OD600為0.6～0.8，然后加入不同濃度IPTG誘導(dǎo)一定的時(shí)間。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)重組菌在20℃，IPTG為0.07 mmol/L下誘導(dǎo)22 h時(shí)表達(dá)效果最好。如圖7所示，重組菌可以正確表達(dá)重組蛋白，蛋白分子量約為66×103g/mol。

3.4 重組蛋白純化

在最適誘導(dǎo)條件下(20℃，IPTG為0.07 mmol/L下誘導(dǎo)22 h)培養(yǎng)200 mL菌液，離心收集菌體，用150 mL PBS重置，超聲破碎40 min得到粗酶，經(jīng)鎳柱一步純化即可達(dá)到電泳純，用Millipore的超濾濃縮管(15 mL，10×103g/mol)濃縮除鹽，純化前后酶活力結(jié)果如表2所示。

表2 重組酶GALT鎳柱純化前后酶活力比較Tab.2 Enzyme activity contrast of recombinant GALT after the Ni column purification

3.5 GALT蛋白酶學(xué)性質(zhì)研究

3.5.1 最適作用溫度與熱穩(wěn)定性

如圖8A1所示，GALT最適作用溫度為35℃，在30～40℃范圍內(nèi)相對(duì)酶活可保持在80%以上，高于40℃酶活水平急劇下降，為中溫酶；如圖8A2所示，在60℃以下呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，低于50℃時(shí)處理5 h后，能保持95%以上的相對(duì)酶活，60℃處理5 h后仍可保持近60%的相對(duì)酶活；70℃處理15 min后，酶完全失活。

圖7 Marinomonas sp. BSi20584 GALT 重組蛋白SDS-PAGE分析(M為蛋白Marker，1為重組菌未誘導(dǎo)樣品，2為重組菌誘導(dǎo)后粗酶液，3為GALT純酶)Fig.7 SDS-PAGE analysis of recombinant GALT from Marinomonas sp. BSi20584 (Lane M: Protein Molecular Weight Marker，Lane 1: non-induced recombinant sample，Lane 2: re-combinant enzyme after induction; Lane 3: purified GALT)

3.5.2 最適pH與pH穩(wěn)定性

在25℃條件下，測(cè)定不同pH環(huán)境中酶活的變化，結(jié)果如圖8B1所示，在pH為9.0時(shí)，GALT具有最高酶活，pH在6.0～9.0的范圍內(nèi)可保持60%以上的酶活。GALT的pH穩(wěn)定性較好，如圖8B2所示，pH在6.0～11.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，pH>11.0時(shí)酶活急劇下降。

3.5.3 NaCl耐受性

如圖8C所示，GALT的最適NaCl濃度為0.5 mol/L，重組酶對(duì)鹽度具有較高的耐受性，當(dāng)NaCl濃度為3 mol/L時(shí)，仍有60%酶活。

3.5.4 化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活的影響與金屬離子對(duì)酶活的影響

如圖8D所示，DTT和EDTA對(duì)酶活影響不大，而L-谷胱甘肽對(duì)酶活有明顯的抑制作用，GALT在10 mmol/L的L-谷胱甘肽作用下僅能保持67%的相對(duì)酶活，而隨著L-谷胱甘肽濃度升高，酶活水平急劇下降；金屬離子對(duì)酶活的影響如圖8E所示，一定濃度的Fe2+、Mn2+對(duì)重組酶的酶活有促進(jìn)作用，其中Fe2+的促進(jìn)效果最明顯，最高可使相對(duì)酶活達(dá)到223%，而Mg2+離子對(duì)酶活的影響不大，Zn2+對(duì)酶活有抑制作用，相對(duì)酶活水平始終抑制在80%以下。

圖8 GALT酶學(xué)性質(zhì)研究Fig.8 GALT characterization analysis A1和A2分別表示GALT最適作用溫度和熱穩(wěn)定性；B1和B2分別表示GALT最適pH值和pH穩(wěn)定性；C表示NaCl濃度對(duì)酶活影響；D表示化學(xué)物質(zhì)GALT對(duì)酶活影響；E代表金屬離子對(duì)酶活的影響；F表示GALT對(duì)ONPG的動(dòng)力學(xué)參數(shù)A1: the optimal temperature of GALT，A2: thermal stability of GALT; B1: the optimum pH of GALT，B2: pH stability of GALT; C: effects of different NaCl concentration on enzyme activity; D: effects of different chemicals on enzyme activity; E: effects of different metal irons on en-zyme activity; F: kinetics parameters of GALT towards ONPG

3.5.5 穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

配置不同濃度ONPG，按酶活測(cè)定程序測(cè)定酶液在50℃時(shí)的OD值，然后用非線性擬合法求出GALT的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如圖8F所示，GALT對(duì)ONPG的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為Vmax=0.172 27 mmol/(L·min)，Km=4.586 4 mmol/L。

3.6 重組酶非變性電泳(Native-PAGE)分析

非變性電泳結(jié)果顯示，該天然酶的分子量約為200×103g/mol(圖9)，而SDS-PAGE結(jié)果顯示該酶分子量在66×103g/mol，推測(cè)其天然酶為三聚體結(jié)構(gòu)，即該酶在三聚化的狀態(tài)下起作用，這一結(jié)果與Swiss-model的預(yù)測(cè)結(jié)果相符合。

圖9 Marinomonas sp. BSi20584重組酶GALT Native-PAGE電泳Fig.9 Native-PAGE result of GALT from Marinomonas sp. BSi20584

3.7 水解底物鍵型分析

將純酶與不同鍵型的底物反應(yīng)得到的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果顯示，PA Sugar Chain 026樣品反應(yīng)后在4 min出現(xiàn)了Glc-PA的峰，說(shuō)明026樣品被降解生成了Glc分子，表明該重組酶對(duì)β-1，4半乳糖苷鍵具有水解作用，而PA Sugar Chain 028 和PA Sugar Chain 042樣品反應(yīng)后均沒(méi)有新物質(zhì)峰的產(chǎn)生，說(shuō)明GALT對(duì)Gal β1-3 GalNAc和Gal β1-3 GalNAc糖苷鍵型則沒(méi)有水解能力(圖10)。

4 結(jié)論

galt基因全長(zhǎng)1 971 bp，共編碼656個(gè)氨基酸，將galt基因與pET-28a(+)載體連接后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)該酶的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，推測(cè)GALT含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，domain A是由(β/α)8形成的TIM桶裝結(jié)構(gòu)，為催化結(jié)構(gòu)域；domain B為α/β折疊結(jié)構(gòu)域；domain C為β折疊構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)GALT的催化位點(diǎn)為Trp183、Glu142和Glu314。

酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶單體分子量約為66×103g/mol，天然酶分子量約為200×103g/mol，其天然酶為同源三聚體。GALT最適作用溫度為35℃，在30～40℃范圍內(nèi)相對(duì)酶活可保持在80%以上，高于40℃酶活水平急劇下降，屬于中溫酶，該β-D-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性較好，在60℃環(huán)境中處理5 h后，仍可保持近60%的相對(duì)酶活。GALT的最適作用pH為9.0，pH在6.0～9.0的范圍內(nèi)可保持60%以上的酶活，pH在6.0～11.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在pH>11.0時(shí)酶活急劇下降。GALT的最適NaCl濃度為0.5 mol/L，對(duì)鹽度具有較高的耐受性，當(dāng)NaCl濃度為3 mol/L時(shí)，仍有60%酶活。DTT和EDTA對(duì)GALT活性影響不大，而L-谷胱甘肽對(duì)酶活有明顯的抑制作用。一定濃度的Fe2+、Mn2+對(duì)GALT的活性有促進(jìn)作用，其中Fe2+的促進(jìn)效果最明顯，最高可使相對(duì)酶活達(dá)到223%，而Mg2+離子對(duì)酶活的影響不大，Zn2+對(duì)酶活有抑制作用，相對(duì)酶活水平始終抑制在80%以下。GALT對(duì)ONPG的Vmax和Km分別為0.172 27 nmol/min和4.586 4 mmol/L。GALT對(duì)β-1，4半乳糖苷鍵具有水解作用(PA Sugar Chain 026)，對(duì)Gal β1-3 GalNAc(PA Sugar Chain 028)和Gal β1-3 GlcNAc(PA Sugar Chain 042)糖苷鍵型沒(méi)有水解能力。

5 討論

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能具有密不可分的關(guān)系，因此，分析GALT的三維結(jié)構(gòu)有利于進(jìn)一步揭示其功能。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Glu142和Glu314為重組酶的催化位點(diǎn)，與ThermusthermophilusA4的β-D-半乳糖苷酶的催化位點(diǎn)Glu141和Glu312相對(duì)應(yīng)[12]。Glu的催化位點(diǎn)在β-D-半乳糖苷酶中極為常見，例如，大腸桿菌β-D-半乳糖苷酶的Glu461和Glu537位點(diǎn)[13]、BacilluscircμlansATCC 31382中Glu447和Glu532[14]位點(diǎn)均為催化位點(diǎn)。對(duì)ThermusthermophilusA4 β-D-半乳糖苷酶的研究表明[12]，Trp182是維持其天然活性所必須的，它可以與其他亞基一起構(gòu)成活性區(qū)域的一部分，這也說(shuō)明β-D-半乳糖苷酶并不是以單體狀態(tài)起作用，必須與其他亞基一起才能形成有活性的酶蛋白，在本研究中通過(guò)建模預(yù)測(cè)和活性電泳確定了天然GALT全酶是以三聚體的形式發(fā)揮催化作用的，Trp作為重要的催化位點(diǎn)這種現(xiàn)象在其他β-D-半乳糖苷酶中同樣存在，如大腸桿菌β-D-半乳糖苷酶中的Trp999[13]。

圖10 Marinomonas sp. BSi20584 GALT重組酶的鍵型水解特異性Fig.10 The hydrolysis specificity of the recombinant enzyme GALT from Marinomonas sp. BSi20584

BSi20584產(chǎn)生的β-D-半乳糖苷酶的最適溫度為35℃，屬于中溫酶的范疇，與一般中溫微生物來(lái)源的酶相比具有較高的熱穩(wěn)定性，卻低于一些嗜熱菌來(lái)源的β-D-半乳糖苷酶，例如，Pyrococcusfuriosus[15]的最適溫度能夠達(dá)到90℃，Sulfolobussolfataricus[16]的最適溫度為85℃。但是，南極地區(qū)也發(fā)現(xiàn)過(guò)不屬于嗜熱菌卻有較高最適溫度的酶，如發(fā)現(xiàn)于南極的嗜鹽菌Halorubrumlacusprofundi[17]的β-D-半乳糖苷酶，其最適溫度為50℃。

此外，我們?cè)谘芯拷饘匐x子對(duì)酶活影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+對(duì)酶活有促進(jìn)作用，推測(cè)原因可能為Fe2+對(duì)酶的催化作用位點(diǎn)起作用，而Zn2+對(duì)酶活有一定的抑制作用，并且隨著濃度的增加，抑制作用增大，在其他β-D-半乳糖苷酶中也發(fā)現(xiàn)了類似的情況，在Lactobacillusdelbrueckii[18]和Arthrobactersp. ON14[19]中同樣發(fā)現(xiàn)Zn2+會(huì)抑制酶活，推測(cè)原因可能是Zn2+的存在改變了半乳糖苷酶的構(gòu)象，從而使酶活受到抑制。DTT和EDTA對(duì)GALT活性影響不大，而L-谷胱甘肽對(duì)酶活有明顯的抑制作用，推測(cè)原因?yàn)長(zhǎng)-谷胱甘肽破壞了酶蛋白的二硫鍵，從而影響其酶活。重組酶基因來(lái)源于北極海單胞菌，對(duì)NaCl具有一定的耐受性，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于嗜鹽菌的耐受性，例如分離自南極的Halorubrumlacusprofundi[17]，在NaCl濃度為4.0 mmol/L時(shí)具有最高酶活。表3為不同來(lái)源的β-D-半乳糖苷酶性質(zhì)比較。

生存于海洋低溫環(huán)境中的微生物，往往是通過(guò)調(diào)節(jié)代謝來(lái)適應(yīng)環(huán)境，適應(yīng)性機(jī)制包括：能量傳導(dǎo)和胞內(nèi)環(huán)境新陳代謝調(diào)節(jié)的特殊機(jī)制；細(xì)胞膜、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分和功能成分的穩(wěn)定性；反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和蛋白質(zhì)構(gòu)象及酶系的功能[31]。Marinomonassp. BSi20584來(lái)源于北冰洋海冰冰心，生長(zhǎng)在低溫環(huán)境，其產(chǎn)生的β-D-半乳糖苷酶為中溫酶，這種現(xiàn)象可能與其進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)，相關(guān)的機(jī)制尚不清楚。本研究中的Marinomonassp. BSi20584和嗜鹽菌Halorubrumlacusprofundi[17]都是從極地寒冷環(huán)境中所分離，它們體內(nèi)的酶若要在低溫下發(fā)揮作用，需要具有足夠的構(gòu)象穩(wěn)定性，因而進(jìn)化出較高的構(gòu)象穩(wěn)定性，一般而言，構(gòu)象穩(wěn)定性高的酶也具有較高的熱穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度。同理，酶若要在冰心內(nèi)的低溫環(huán)境下維持較高活性，就難以進(jìn)化出高的構(gòu)象穩(wěn)定性，因?yàn)榈蜏叵逻^(guò)高的構(gòu)象穩(wěn)定性會(huì)導(dǎo)致酶活性中心柔性的降低，不利于實(shí)現(xiàn)活性中心與低溫環(huán)境下底物結(jié)合和產(chǎn)物釋放這兩種構(gòu)象的快速切換。因此，本研究中海單胞菌β-D-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度符合中溫酶的特性，是細(xì)菌自身適應(yīng)其生存環(huán)境的結(jié)果。

表3 不同來(lái)源β-D-半乳糖苷酶性質(zhì)對(duì)比[14—29]Tab.3 Characterization contrast among different β-galactosidase

本文通過(guò)Marinomonassp.BSi20584重組表達(dá)所產(chǎn)生的β-D-半乳糖苷酶在基因序列、蛋白結(jié)構(gòu)及酶學(xué)性質(zhì)等方面進(jìn)行了深入的研究，為進(jìn)一步揭示基因序列與蛋白功能的關(guān)系，及酶蛋白結(jié)晶及結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)。

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Heterologous expression and its enzymatic properties of β-galactosidase from a Marinomonas strain isolated from the Arctic Ocean

Sun Xi1，2，Liao Li2，Ding Haitao2，Liu Shuang1,Chen Bo1，2

(1.CollegeofBioengineering，EastChinaUniversityofScienceandTechnology，Shanghai200237，China; 2.KeyLaboratoryforPolarScience，StateOceanicAdministration，PolarResearchInstituteofChina，Shanghai200136，China)

AMarinomonasstrain isolated from an ice core sample collected from Canada Basin，Arctic Ocean，displayed high β-galactosidase activity in the preliminary screening process. To get its overall understanding towards its enzymatic properties，thegaltgene obtained by hiTAIL-PCR amplification was inserted into plasmid pET-28a(+)，then transformed intoE.coliBL21 (DE3). The recombinant enzyme was purified to electrophoretic homogeneity by one step Ni2+affinity chromatography. The highest yield was achieved with 0.07mM IPTG when cultivated in 20℃ for 22 h. The molecular weight of the monomeric GALT was estimated as about 6.6×104g/mol and the native GALT was confirmed as homologous trimer through native-PAGE. The optimum temperature of GALT was 35℃ and showed good thermal stability at the temperature of 60℃ below. The optimum pH of GALT was 9.0 and was stable between pH 6.0 and 11.0. GALT showed high tolerance to salinity and the optimum NaCl concentration was 0.5 mol/L. Mineral ions Fe2+and Mn2+were identified as enzyme activators，Mg2+，K+，DTT and EDTA showed no significant influence towards the enzyme activity，while Zn2+and L-glutathione inhibited the activity strongly. GALT was able to hydrolyse Gal β1-4 GlcNAc but unable to hydrolyze Gal β1-3 GalNAc and Gal β1-3 GlcNAc. In this study，the β-galactosidase gene fromMarinomonassp. BSi20584 was successfully expressed inE.colisystem，and a systematic understanding of the enzymatic properties of the recombinant GALT was acquired，which will provide the detailed enzymatic data for further studies on its metabolic adaptation and potential applications．

the Arctic Ocean; β-galactosidase;Marinomonas; heterologous expression; enzymatic properties

2015-04-10；

2015-06-15。

國(guó)家“863”計(jì)劃(2012AA092105)；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201005032-4)；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(13ZR1462700)；南北極環(huán)境綜合考察與評(píng)估專項(xiàng)(CHINARE04-03/04-05/01-06)。

孫茜(1989—)，女，山東省淄博市人，主要從事極地微生物功能基因及其克隆表達(dá)研究。E-mail：545379435@qq.com

*通信作者：陳波，研究員，主要從事極地微生物學(xué)研究。E-mail:chenbo@pric.org.cn

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.11.016

TQ925

A

0253-4193(2015)11-0165-13

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