大鼠血漿PA-824的HPLC-MS/MS測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)研究*

刁春妍，馬江微，彌樂(lè)，趙乃千，王力彬，劉雪英

(第四軍醫(yī)大學(xué)藥物化學(xué)教研室，西安 710032)

大鼠血漿PA-824的HPLC-MS/MS測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)研究*

刁春妍，馬江微，彌樂(lè)，趙乃千，王力彬，劉雪英

(第四軍醫(yī)大學(xué)藥物化學(xué)教研室，西安 710032)

目的 建立高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)法測(cè)定PA-824在大鼠血漿中濃度，并進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。方法 以甲硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白，富集生物樣品中的PA-824，然后進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)。色譜柱為Inertsil?ODS3 C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm)；C18保護(hù)柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.03%三乙胺溶液(90：10)，流速0.5 mL·min-1，采用電噴霧電離源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描分析，PA-824和內(nèi)標(biāo)的離子選擇通道分別為荷質(zhì)比(m/z)360.1→m/z175.0(CE=30，DP=66)，m/z172.1→m/z128.0(CE=21，DP=53)，柱溫30 ℃；大鼠灌服給藥后，于不同時(shí)間點(diǎn)取血測(cè)定血漿中藥物的含量，利用DAS2.0版軟件計(jì)算其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果 PA-824在0.1～10.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，平均回收率均>92.13%，RSD均<6.6%。大鼠灌服PA-824后濃度-時(shí)間曲線下面積[AUC(0-t) ]為(3 297.503±320.958) mg·L-1·min-1，AUC(0-∞)為(3 558.315± 338.860) mg·L-1·min-1，達(dá)峰時(shí)間(tmax)為(360.000±64.143) min，峰濃度(Cmax)為(3.5±0.3) mg·L-1。結(jié)論 該方法快速、精確、簡(jiǎn)便，可用于大鼠血漿中PA-824的測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)研究。

PA-824；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；藥動(dòng)學(xué)；大鼠

硝基咪唑吡喃類化合物最初作為治療癌癥的放射增敏劑，后來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有抗結(jié)核活性，目前對(duì)這類化合物的研究主要集中在PA-824和OPC-67683這兩個(gè)化合物[1-2]。PA-824對(duì)敏感和耐藥結(jié)核桿菌有效，可以殺死處在潛伏期的結(jié)核桿菌，并且與一線抗結(jié)核藥物無(wú)交叉耐藥現(xiàn)象[3-6]。2002年，全球抗結(jié)核聯(lián)盟和美國(guó)國(guó)立過(guò)敏和傳染病研究所達(dá)成協(xié)議，將PA-824作為新型抗結(jié)核藥物研究，現(xiàn)已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)[2，7-8]，同時(shí)其作為活性組分與莫西沙星、吡嗪酰胺組成新的復(fù)方制劑——PaMZ[2]，目前也處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)。

PA-824是一種前體藥，通過(guò)菌體內(nèi)Rv3547、FGD1、F420等因子的共同作用被還原激活，被激活后的4c端硝基咪唑基團(tuán)能夠形成一個(gè)活化的中間體，從而抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁脂質(zhì)的合成，殺滅結(jié)核桿菌[2，9]。PA-824的體外活性不是最高，但是在動(dòng)物感染模型實(shí)驗(yàn)中，口服療效最好，并且具備最佳藥動(dòng)學(xué)特性[9]，因此PA-824被認(rèn)為是最有開(kāi)發(fā)前景的候選化合物[9-11]。

1 動(dòng)物、試藥與儀器

1.1 動(dòng)物 斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第08-005號(hào)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：ACXK(軍)2007-007。大鼠分籠喂養(yǎng)，室溫(23±2) ℃，濕度40%～60%，光照、黑暗12 h交替，自由獲取標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水。

1.2 試藥 PA-824(第四軍醫(yī)大學(xué)藥物化學(xué)教研室制備)；甲硝唑[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號(hào)： F1308034]；肝素鈉(上海第一生化公司，批號(hào)：H31022152)。

1.3 儀器 LC-30AD型高效液相色譜儀(日本島津公司)；API4000質(zhì)譜儀；AL204電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，十萬(wàn)分之一天平)；分析天平(德國(guó)Sartorius公司，萬(wàn)分之一天平)；USorvall ST 40R臺(tái)式高速離心機(jī)(Thermo Fisher公司)；渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil?ODS3 C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；預(yù)柱：C18保護(hù)柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.03%三乙胺水溶液(90：10)；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子化源；電離模式：正離子模式；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(high performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometer，HPLC-MS/MS)：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)用于定量分析的離子反應(yīng)；PA-824和內(nèi)標(biāo)的離子選擇通道分別為荷質(zhì)比(m/z)360.1→m/z175.0(碰撞能量=30 eV，去簇電壓=66 V)，m/z172.1→m/z128.0(碰撞能量=21 eV，去簇電壓=53 V)。

2.3 血漿樣品預(yù)處理 量取大鼠血漿200 μL，置于1.5 mL離心管中，加內(nèi)標(biāo)甲硝唑(1 μg·mL-1)10 μL渦旋振蕩30 s，加入甲醇900 μL，渦旋混勻后12 000 r·min-1(r=6.5 cm)離心15 min，移取上清液800 μL至1.5 mL離心管，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)眉状?0 μL復(fù)溶，12 000 r·min-1(r=6.5 cm)離心15 min，取上清液5 μL進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

2.4 專屬性 量取大鼠空白血漿200 μL，除用100 μL甲醇代替內(nèi)標(biāo)溶液外其余按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，獲得空白樣品的色譜圖；將一定濃度的PA-824對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，依法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖；取SD大鼠灌服給予PA-824后的血漿樣品200 μL，同法操作，獲得色譜圖(圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾PA-824和內(nèi)標(biāo)化合物甲硝唑的測(cè)定。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取PA-824對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，甲醇稀釋成濃度為1.0，5.5，10.0，32.5，55.0，100.0 μg·mL-1對(duì)照品溶液。分別吸取上述對(duì)照品系列溶液20 μL加入到200 μL血漿中，并加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，按“2.2”項(xiàng)處理，取上清液5 μL進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定。以PA-824色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)甲硝唑色譜峰面積之比為縱坐標(biāo)，PA-824對(duì)照品濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線?；貧w方程為：Y=0.799X+0.035，r=0.998 6，線性范圍：0.10～10.00 μg·mL-1。定量下限為0.1 μg·mL-1，其準(zhǔn)確度與精密度均符合要求。

A.空白血漿；B 空白血漿加PA-824；C.空白血漿加甲硝唑；D.大鼠給予PA-824后血漿樣品；1.PA-824；2.甲硝唑

A.blank plasma；B.blank plasma plus PA-824；C.blank plasma spiked with metronidazole；D.plasma sample from a rat after an oral administration of PA-824；1.PA-824；2.metronidazole

Fig.1 HPLC - MS/MS chromatogram of three kinds of solution

2.6 回收率與精密度 取SD大鼠空白血漿200 μL，配制低、中、高濃度質(zhì)量控制(quality control，QC)樣品(0.1，1.0，10.0 μg·mL-1PA-824)。每一種濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，結(jié)果進(jìn)行方差分析，求得本法的精密度和準(zhǔn)確度。平均回收率分別為92.13%，94.29%，98.21%。本分析方法的日內(nèi)RSD≤3.1%，日間RSD≤6.6%，RE為-5.7%～3.6%，該法可用于測(cè)定大鼠血漿中PA-824的濃度。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取大鼠空白血漿200 μL，配制PA-824低、中、高3個(gè)血漿濃度(0.1，1.0，10.0 μg·mL-1)的QC樣品，分別考察-20 ℃冰箱凍藏45 d，3次凍融循環(huán)，血漿樣品室溫(約20 ℃)放置12 h和樣品處理后放置冰箱中(4 ℃)24 h的穩(wěn)定性，每一濃度3個(gè)樣本，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.8 基質(zhì)效應(yīng) 取大鼠空白血漿200 μL，不加對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液，按”2.2”項(xiàng)處理，然后向獲得的殘?jiān)屑尤胂鄳?yīng)濃度的對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋振蕩，氮?dú)獯蹈桑约状?0 μL溶解后得到低、中、高3種濃度的含有基質(zhì)的樣品進(jìn)行分析，每一種濃度取5個(gè)樣本分析，以獲得的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，可以忽略基質(zhì)效應(yīng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定的影響。

2.9 給藥方案與樣品采集 健康SD大鼠8只，雄性，體質(zhì)量(220±20) g，禁食12 h，自由飲水。分別灌胃給予PA-824(20 mg·kg-1)，給藥后5，15，30，60，120，180，240，360，480，720，1 080，1 440，2 160 min 眼眶取血。每次取血0.7 mL，肝素抗凝，3 000 r·min-1(r=6.5 cm)離心10 min，移取血漿，-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.10 大鼠灌服PA-824后的藥動(dòng)學(xué) 大鼠灌服PA-824后各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用安徽省藥物臨床評(píng)價(jià)中心開(kāi)發(fā)的DAS(Drug And Statistics)2.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行自動(dòng)運(yùn)算，首先對(duì)每只大鼠的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行智能化處理擬合房室模型，然后對(duì)8只SD大鼠的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行成批處理，最后得到藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：血藥濃度-時(shí)間曲線下面積[AUC(0-t) ](3 297.503±320.958)mg·L-1·min-1，AUC(0-∞)(3 558.315± 338.860)mg·L-1·min-1，達(dá)峰時(shí)間(tmax)(360.000±64.143)min，半衰期(t1/2)(500.213±154.932)min，清除率(CLz/F)(0.006±0.001)L·min-1·kg-1，血藥峰濃度(Cmax)(3.5± 0.3) mg·L-1。

3 討論

HPLC-MS/MS方法測(cè)定PA-824在大鼠血漿中的濃度，快速，精確，簡(jiǎn)便。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測(cè)定。本方法可以滿足生物樣品測(cè)定的需要。

選擇一個(gè)合適的內(nèi)標(biāo)物，最好是選擇待測(cè)物質(zhì)的同系物，內(nèi)標(biāo)物要求性質(zhì)穩(wěn)定，不易分解、反應(yīng)，能夠很好檢測(cè)，不干擾待測(cè)組分的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)最初選取了3個(gè)化合物作為待選內(nèi)標(biāo)物：甲硝唑、環(huán)丙沙星、異煙堿。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲硝唑的提取條件、色譜保留行為與待測(cè)化合物接近，而且保留時(shí)間與待測(cè)物接近，回收率較高，質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)，所以本實(shí)驗(yàn)最后選擇了甲硝唑作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量分析。

大鼠灌服PA-824后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)提示PA-

表1 PA-824的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

Tab.1 Stability test of PA-824 %

表2 PA-824和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)

Tab.2 Matrix effect for PA-824 and internal standard %

圖2 PA-824平均血藥濃度-時(shí)間曲線(n=8)

Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of PA-824(n=8)

824口服吸收良好，在大鼠體內(nèi)吸收分布迅速，但是消除較緩慢，36 h后仍能在大鼠內(nèi)體測(cè)到原藥。PA-824的小分子結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致其在體內(nèi)迅速吸收分布的重要因素。

[1] MANJUNATHA U H，BOSHOFF H，DOWD C S，et al.Identification of a nitroimidazo-oxazine-specific protein involved in PA-824 resistance in mycobacterium tuberculosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(2)：431-436.

[2] STOVER C K，WARRENER P，VANDEVANTER D R，et al.A small-molecule nitroimidazopyran drug candidate for the treatment of tuberculosis[J].Nature，2000，405(6789)：962-966.

[3] CONNOLLY L E，EDELSTEIN P H，RAMAKRISHNAN L.Why is long-term therapy required to cure tuberculosis?[J].PLoS Med，2007，4(3)：e120.

[4] 汪靜，張惠斌，周金培，等.抗結(jié)核新靶點(diǎn)及相關(guān)藥物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43(1)：1-8.

[5] ONYEBUJOH P，ZUMLA A，RIBEIRO I，et al.Treatment of tuberculosis：present status and future prospects[J].Bull World Health Organ，2005，83(11)：857-865.

[6] DUNCAN K.Progress in TB drug development and what is still needed[J].Tuberculosis(Edinb)，2003，83(1-3)：201-207.

[7] LENAERTS A J，GRUPPO V，MARIETTA K S，et al.Prec-linical testing of the nitroimidazopyran PA-824 for activity against mycobacterium tuberculosis in a series ofinvitroandinvivomodels[J].Antimicrob Agents Chemother，2005，49(6)：2294-2301.

[8] TYAGI S，NUERMBERGER E，YOSHIMATSU T，et al.Ba-ctericidal activity of the nitroimidazopyran PA-824 in a murine model of tuberculosis[J].Antimicrob Agents Chemother，2005，49(6)：2289-2293.

[9] DAWSON R，DIACON A.PA-824，moxifloxacin and pyraz-inamide combination therapy for tuberculosis[J].Exp Opin Investig Drugs，2013，22(7)：927-932.

[10] DIACON A H，DAWSON R，VON GROOTE-BIDLINGM-AIER F，et al.14-day bactericidal activity of PA-824，bedaquiline，pyrazinamide，and moxifloxacin combinations：a randomised trial[J].Lancet，2012，380(9846)：986-993.

[11] BARRY C R，BOSHOFF H I，DOWD C S.Prospects for clinical introduction of nitroimidazole antibiotics for the treatment of tuberculosis[J].Curr Pharm Des，2004，10(26)：3239-3262.

湖北省食品藥品監(jiān)督管理局開(kāi)展生化藥品專項(xiàng)檢查

2015年7月，按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局統(tǒng)一部署，在企業(yè)自查自糾的基礎(chǔ)上，湖北省食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)湖北省小牛血類注射劑生產(chǎn)企業(yè)及其他生化藥品生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行了全覆蓋專項(xiàng)檢查。重點(diǎn)檢查原料供貨渠道、生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)，看是否存在外購(gòu)提取物情況，是否存在非法添加，是否按批準(zhǔn)的工藝和標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)等。

經(jīng)查，湖北省生化藥品生產(chǎn)企業(yè)均能夠按照批準(zhǔn)的工藝處方和生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)，生產(chǎn)過(guò)程符合藥品GMP要求，未發(fā)現(xiàn)重大違法違規(guī)行為。在對(duì)武漢人福藥業(yè)有限責(zé)任公司的檢查中，檢查組核對(duì)了該企業(yè)小牛血制劑的《藥品再注冊(cè)品種工藝表》、工藝規(guī)程，抽查了批生產(chǎn)記錄，未發(fā)現(xiàn)存在違反批準(zhǔn)工藝和標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的行為。

(信息來(lái)源：湖北省食品藥品監(jiān)督管理局藥品化妝品生產(chǎn)監(jiān)管處)

Determination of PA-824 in Rat Plasma by HPLC-MS/MS and Application in Pharmaco-kinetic Study

DIAO Chunyan，MA Jiangwei，MI Le，ZHAO Naiqian，WANG Libin，LIU Xueying

(SchoolofPharmacy，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China)

Objective To develop an HPLC-MS/MS method for quantitative determination of PA-824 in rat plasma and to study the pharmacokinetics of PA-824 in rat after oral administration. Methods An HPLC-MS/MS method was developed and validated for determination of PA-824 in rat plasma using metronidazole as internal standard.The proteins in plasma samples were precipitated with methanol，and PA-824 was enriched for analysis by HPLC-MS/MS.An Inertsil?ODS3 C18column (150 mm×4.6 mm，5 μm) was applied with mobile phase composed of methanol- 0.03% triethylamine (TEA) in water (90：10) ，at a flow rate of 0.5 mL·min-1and column temperature of 30 ℃.Quantitation was performed on a triple quadrupole mass spectrometer applying electrospray ionization technique and operating in multiple reaction monitoring (MRM) and positive ion mode with transitions at 360.1/175.0 for PA-824 and 172.0/128.0 for metronidazole.The concentration of PA-824 in plasma was tested after oral administration at various time points and the data were processed with software DAS.2.0. Results The standard calibration curve for spiked rat plasma containing PA-824 was linear over the range of 0.1-10.0 μg·mL-1.The recoveries obtained for PA-824 were greater than 92.13%.Intra-day and inter-day coefficient of variation were less than 6.6%.After oral administration，the main pharmacokinetic parameters were AUC(0-t)：(3 297.503±320.958)mg·L-1·min-1，AUC(0-∞)：(3 558.315±338.860) mg·L-1·min-1，tmax：(360.000±64.143) min，Cmax：(3.5±0.3)mg·L-1. Conclusion The method is rapid，accurate，simple，and successfully applied in a pharmacokinetic study of fixed dose oral administration of PA-824 in rats.

PA-824；High performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometer；Pharmacokinetics ；Rats

2014-05-26

2014-08-28

*陜西省協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目(2014XT-26)

刁春妍(1993-)，女，遼寧營(yíng)口人，在讀本科。電話：(0)15191577381，E-mail：wtpierce@163.com。

劉雪英(1972-)，女，山東濰坊人，副教授，博士，研究方向：新藥設(shè)計(jì)合成及藥理學(xué)。電話：029-84774473-809，E-mail：wqwlxy@163.com。

R978.3；R969.1

A

1004-0781(2015)09-1146-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.006