蒺藜皂苷對局灶性腦缺血大鼠炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的影響*

翟鳳國，周福波，李厚忠，郭素芬，林峰，關(guān)利新

(牡丹江醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，牡丹江 157011)

·藥物研究·

蒺藜皂苷對局灶性腦缺血大鼠炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的影響*

翟鳳國，周福波，李厚忠，郭素芬，林峰，關(guān)利新

(牡丹江醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，牡丹江 157011)

目的 探討蒺藜皂苷對大鼠腦缺血-再灌注損傷炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的作用及其機制。方法 斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠60只，隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、蒺藜皂苷小劑量組(10 mg·kg-1)、蒺藜皂苷大劑量組(30 mg·kg-1)，每組15只，采用線栓法制備腦缺血-再灌注損傷模型。缺血2 h再灌注24 h后分別檢測大鼠神經(jīng)功能損傷評分、缺血腦組織髓過氧化物酶(MPO)的活性和伊文思藍(EB)的含量；采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測腦組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，免疫印記法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達變化。結(jié)果 與模型對照組比較，蒺藜皂苷小、大劑量組大鼠神經(jīng)功能損傷減輕(P<0.05)，缺血腦組織MPO活性和EB含量均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，TNF-α含量明顯降低[分別為(0.760±0.110)，(0.670±0.073)mg·g-1，模型對照組為(0.920±0.128)mg·g-1，P<0.05或P<0.01)]，MMP-9 的表達水平均明顯降低[分別為(1.770±0.181)%，(1.480±0.146)%，模型對照組為(2.200±0.186)%，P<0.01]。結(jié)論 蒺藜皂苷對大鼠腦缺血-再灌注損傷的腦組織具有神經(jīng)保護作用，其機制可能與降低TNF-α含量和下調(diào)MMP-9表達，從而降低炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性有關(guān)。

蒺藜皂苷；缺血-再灌注，腦；炎癥；血腦屏障；基質(zhì)金屬蛋白酶

缺血性腦血管病是危害人類生命和健康的常見病，其所涉及的病理生理機制十分復(fù)雜，腦缺血-再灌注是多數(shù)缺血性腦血管病的主要病理生理過程。腦缺血-再灌注損傷發(fā)生后，血-腦屏障破壞，腦組織水腫，同時炎癥細胞也更易于通過破壞的血腦屏障，浸潤到腦組織中，加重腦組織損傷[1-2]。蒺藜皂苷是從蒺藜地上全草中提取的有效組分之一，是以甾體皂苷為主的十多種皂苷的混合物，臨床主要用于心腦血管疾病的治療。研究表明，蒺藜皂苷對腦缺血損傷具有腦保護作用[3-4]，但蒺藜皂苷對炎癥反應(yīng)和血腦屏障作用的相關(guān)研究較少，筆者進一步探討蒺藜皂苷在腦缺血-再灌注損傷時腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠60只，體質(zhì)量270～320 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-0001；合格證號：114007-00059799]。所有大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水和攝食，室內(nèi)安靜，每日光照12 h，室溫控制在 20～25 ℃，相對濕度(60±40)%。

1.2 藥品及試劑 蒺藜皂苷由吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司提供，含量>90%。伊文思藍(Evans blue，EB)染料購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司(批號：20110616)。髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒(批號：20110906)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(批號：20110813)購自南京建成生物技術(shù)公司。兔抗大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 動物分組及給藥 將大鼠隨機分為4組，即假手術(shù)組、模型對照組、蒺藜皂苷小劑量(10 mg·kg-1)組和蒺藜皂苷大劑量(30 mg·kg-1)組，每組15只。給藥組均于術(shù)前灌胃給藥7 d，每天灌胃1次。模型對照組和假手術(shù)組給予相同體積0.9%氯化鈉注射液。

1.4 腦缺血模型的制備 根據(jù)LONGA線栓法[5-6]加以改進，10%水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，取頸部正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總和頸內(nèi)、外動脈，結(jié)扎頸外動脈。在頸外動脈近分叉處剪一“V”形切口，插入頭端燒圓涂蠟呈鈍形的直徑為 0.245 mm 的尼龍魚線，線栓插入深度18～20 mm(距離頸總動脈分叉點)，有輕微阻力時停止，扎緊并固定栓線，縫合皮膚，2 h后抽提栓線至頸總動脈內(nèi)制備再灌注損傷模型。假手術(shù)組只分離血管，不插入尼龍線。

1.5 神經(jīng)功能損傷評分 參照LONGA等[5]介紹的5分法對腦缺血24 h后 的大鼠進行神經(jīng)功能評分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：提尾懸空不能伸展對側(cè)前爪；2分：行走向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走困難，并向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，伴意識障礙。神經(jīng)功能缺損達 1～3 分者納入實驗。

1.6 腦組織EB含量的測定 腦缺血23 h后，經(jīng)舌下靜脈注射2% EB溶液1 mL，大鼠全身迅速變藍。1 h后，處死大鼠，取出大腦，將缺血側(cè)大腦組織勻漿置于50%三氯醋酸中混勻，放置24 h，測定620 nm處吸光度(A)值。同時測定已知濃度的梯度EB溶液的A值，并繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算出待測樣品的EB含量。

1.7 腦組織MPO活性測定 取缺血側(cè)大鼠腦組織，利用試劑盒提供的勻漿介質(zhì)，將腦組織制成 10%組織勻漿，按MPO試劑盒說明書進行操作。采用考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)含量。

1.8 腦組織TNF-α的含量測定 取缺血側(cè)大鼠腦組織，勻漿，按ELISA檢測試劑盒說明書步驟操作測定腦組織中TNF-α的表達。

1.9 免疫印跡法(Western blot)檢測腦組織MMP-9的表達水平 取缺血側(cè)大鼠腦組織100 mg加入到1 mL蛋白裂解液，勻漿，離心提取總蛋白，并測定蛋白濃度。經(jīng)灌膠、上樣、10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后，分別加入兔抗大鼠 MMP-9 多克隆抗體(1：500)、鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1：1 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的相應(yīng)二抗(1：2 000)，室溫孵育2 h，再經(jīng)洗膜緩沖液洗膜，超敏電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒A液和B液反應(yīng)，壓片、X線膠片曝光顯影、圖像采集。再用Image Pro-Plug 610圖像分析軟件測定目的條帶的累積A值，以β-actin為內(nèi)參照，以目的條帶的累積A值與β-actin條帶的累積A值比值作為目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 蒺藜皂苷對大鼠腦缺血神經(jīng)功能損傷的影響 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能無損傷，腦缺血-再灌注24 h 后，模型對照組大鼠神經(jīng)功能損傷評分與假手術(shù)組比較顯著增高，蒺藜皂苷能減輕腦缺血-再灌注大鼠的神經(jīng)功能損傷評分(F=17.14，P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.2 蒺藜皂苷對大鼠腦組織EB含量的影響 腦缺血-再灌注24 h后，大鼠腦組織EB含量明顯增高；與模型對照組比較，蒺藜皂苷小劑量組和大劑量組缺血腦組織EB含量均明顯降低(F=21.08，P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 4組大鼠神經(jīng)功能損傷評分和腦組織EB含量比較

與假手術(shù)組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01Compared with sham operation group，*1P<0.01; compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.3 蒺藜皂苷對大鼠腦組織MPO活性的影響 腦缺血-再灌注24 h后大鼠腦組織MPO活性明顯增高；與模型對照組比較，蒺藜皂苷小劑量組和大劑量組缺血腦組織MPO的活性均明顯降低(F=52.01，P<0.01)。結(jié)果見表2。

2.4 蒺藜皂苷對大鼠腦組織TNF-α含量的影響 腦缺血-再灌注24 h后，大鼠腦組織TNF-α的含量明顯增高。與模型對照組比較，蒺藜皂苷小劑量組和大劑量組缺血腦組織TNF-α的含量均明顯降低(F=33.40，P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 4組大鼠腦組織MPO活性和TNF-α含量比較

與假手術(shù)組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01Compared with sham operation group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.5 蒺藜皂苷對大鼠腦組織MMP-9表達水平的影響 腦缺血-再灌注24 h后，大鼠腦組織MMP-9的蛋白表達水平明顯增高。與模型對照組比較，蒺藜皂苷小劑量組和大劑量組缺血腦組織MMP-9 蛋白表達水平均明顯降低。與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注24 h后大鼠腦組織MMP-9的蛋白表達水平明顯增高[(1.280±0.143)%，(2.200±0.186)%，P<0.01]。而與模型對照組比較，蒺藜皂苷小劑量組和大劑量組缺血腦組織MMP-9 的蛋白表達水平均明顯降低[(1.770±0.181)%，(1.480±0.146)%，F(xiàn)=30.39，P<0.01]。見圖1。

圖1 4組大鼠腦組織MMP-9的表達

Fig.1 MMP-9 expression in brain in four groups of rats

3 討論

腦缺血-再灌注后炎癥反應(yīng)和炎癥因子的釋放可以增加血腦屏障通透性，而血腦屏障通透性的增加一方面加重腦水腫，另一方面有利于炎癥因子和炎癥細胞通過血腦屏障，促進炎癥反應(yīng)和細胞凋亡[7-8]。因此，抑制炎癥、降低血腦屏障通透性從而減輕腦缺血-再灌注損傷是臨床治療目的之一。

本實驗通過建立大鼠腦缺血-再灌注模型，證實了蒺藜皂苷具有減輕腦缺血神經(jīng)功能損傷作用，即蒺藜皂苷對大鼠腦缺血具有神經(jīng)保護作用，這與以往研究一致[3-4]。同時發(fā)現(xiàn)，蒺藜皂苷治療組缺血腦組織中MPO活性均明顯降低。MPO是中性粒細胞的特異性標志物，其活性可反映中性粒細胞的浸潤程度及組織炎癥反應(yīng)的程度[9]。提示蒺藜皂苷可顯著減輕腦缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。蒺藜皂苷可明顯降低腦組織TNF-α的含量。TNF-α是體內(nèi)最重要的炎癥遞質(zhì)之一，研究表明腦缺血早期TNF-α水平增高，且與神經(jīng)功能缺損程度相關(guān)[10]。TNF-α的激活在腦缺血炎癥反應(yīng)中起著核心作用，介導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞及炎癥遞質(zhì)等的表達，加重腦損傷，擴大腦梗死體積[11]。蒺藜皂苷可能是通過減少TNF-α的表達來抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕腦缺血-再灌注損傷。

EB是小分子指示劑，與血漿蛋白結(jié)合后不能通過

血腦屏障，只有當(dāng)血腦屏障破壞時才進入腦組織，可作為評估血腦屏障損傷的定性指標。本研究結(jié)果顯示，蒺藜皂苷可明顯降低缺血腦組織EB的含量，表明蒺藜皂苷可減輕腦缺血-再灌注損傷所致的血腦屏障破壞。蒺藜皂苷也可明顯降低缺血腦組織MMP-9 的蛋白表達水平。MMPs是分解細胞外基質(zhì)最重要的一類蛋白酶類。研究表明腦缺血后MMPs分解細胞外基質(zhì)、破壞基底膜并開放血腦屏障是導(dǎo)致腦缺血-再灌注損傷病情加重的重要因素之一[12]。MMP-9是MMPs家族的主要成員，其表達量和活性的增高可促進血腦屏障通透性的增高，促進腦水腫和白細胞浸潤，早期選擇性抑制MMP-9可顯著減輕腦梗死[13]。因此，推測蒺藜皂苷可能是通過降低 MMP-9 的表達改善血腦屏障的完整性，從而減輕缺血性腦損傷。

綜上所述，蒺藜皂苷可能通過抑制 TNF-α 的表達、減輕炎癥反應(yīng)，抑制 MMP-9 表達、減輕血腦屏障破壞，進而減輕大鼠腦缺血-再灌注損傷，發(fā)揮其對大鼠腦缺血的神經(jīng)保護作用。

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Effects of Gross Saponins of Tribulus terrestris L. on Inflammatory Reaction and Permeability of Blood-brain Barrier in Rats Following Cerebral Ischemic Injury

ZHAI Fengguo，ZHOU Fubo，LI Houzhong，GUO Sufen，LIN Feng，GUAN Lixin

(DepartmentofPharmacology，MudanjiangMedicalUniversity，Mudanjiang157011，China)

Objective To explore the effects of gross saponins ofTribulusterrestrisL.on inflammatory reaction and permeability of blood-brain barrier in rats following cerebral ischemia-reperfusion injury and their potential mechanisms. Methods Sixty SD rats were divided into sham operation group，model control group，gross saponins ofTribulusterrestrisL.at low-dose (10 mg·kg-1)and high-dose groups(30 mg·kg-1).Cerebral ischemia -reperfusion model was established with suture emboli method in middle cerebral artery of rats.Neural injury scores，the contents of Evans blue (EB) and myeloperoxidase( MPO) activities in rat brain were measured 24 hours after the cerebral reperfusion post 2 h ischemia.Content of tumor necrosis factor-α (TNF-α) in rat brain was detected by ELISA; expression levels of matrix metalloproteinase-9(MMP-9) in rat brain was determined by Western blot. Results Compared to the model control group，the neurological deficit scores were significantly decreased(P<0.05)，MPO activities and EB contents decreased(P<0.05 orP<0.01)in the treatment groups.The expression levels of TNF-α were significantly lower in the treatment groups(0.760±0.110) mg·g-1and (0.670±0.073) mg·g-1compared to (0.920±0.128) mg·g-1in the model control group (P<0.05 orP<0.01).The MMP-9 expression levels were (1.770±0.181)% and(1.480±0.146)%，significantly lower than(2.200±0.186)% in the model control group(P<0.01). Conclusion Gross saponins ofTribulusterrestrisL.exert neuroprotective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats through inhibiting the inflammatory reaction and decreasing the permeability of blood-brain barrier，which may be associated with the decrease of the TNF-α content and downregulation of the MMP-9 expression.

Gross saponins ofTribulusterrestrisL.;Ischemia-reperfusion， cerebral;Inflammation; Blood-brain barrier; Matrix metalloproteinase

2014-04-22

2014-09-23

*黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(11551527)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2012-276)；牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目(2010-02)

翟鳳國(1974-)，女，黑龍江鶴崗人，副教授，博士，研究方向：心腦血管病藥理。電話：(0)15145331192，E-mail：zhaifengguo1974@163.com。

關(guān)利新(1960-)，男，黑龍江牡丹江人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心腦血管病藥理。電話：0453-6984213，E-mail：guanlixin777@163.com。

R282.71；R285

A

1004-0781(2015)09-1131-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.002