燈盞細(xì)辛合尼莫地平對(duì)谷氨酸所致神經(jīng)元凋亡的影響*

劉新迎巫祖強(qiáng)李 蓉林智勇梁佩玲董 燕王培訓(xùn)

（1.廣東省佛山市南海區(qū)羅村醫(yī)院，廣東 佛山 528226；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510405）

·研究報(bào)告·

燈盞細(xì)辛合尼莫地平對(duì)谷氨酸所致神經(jīng)元凋亡的影響*

劉新迎1巫祖強(qiáng)1李 蓉1林智勇1梁佩玲1董 燕2王培訓(xùn)2

（1.廣東省佛山市南海區(qū)羅村醫(yī)院，廣東 佛山 528226；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510405）

目的觀察燈盞細(xì)辛合尼莫地平對(duì)谷氨酸所致PC12細(xì)胞凋亡的影響。方法培養(yǎng)PC12細(xì)胞，并用谷氨酸誘導(dǎo)建立神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，用流式細(xì)胞儀觀察尼莫地平以及燈盞細(xì)辛合尼莫地平共作用對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果尼莫地平10、20 μmol/L濃度組作用2 h和尼莫地平3個(gè)濃度組作用4 h對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡均具有保護(hù)作用，燈盞細(xì)辛與尼莫地平3個(gè)濃度組合用，作用2 h和4 h對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡均具有保護(hù)作用。結(jié)論尼莫地平對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性，燈盞細(xì)辛與尼莫地平合用能有效減少和降低尼莫地平的用量和作用時(shí)間，達(dá)到神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

燈盞細(xì)辛 尼莫地平 谷氨酸 神經(jīng)元凋亡

缺血性腦卒中占全部腦卒中的60%～85%［1］，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量，帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。缺血性腦卒中級(jí)聯(lián)損傷的“瀑布反應(yīng)”是非線性和循環(huán)的，采用作用機(jī)制多樣的神經(jīng)保護(hù)劑，或聯(lián)合作用于級(jí)聯(lián)反應(yīng)不同環(huán)節(jié)的幾種神經(jīng)保護(hù)劑，即神經(jīng)保護(hù)劑雞尾酒療法可能是阻斷腦缺血發(fā)病機(jī)制的一個(gè)合理方向。本研究擬通過(guò)建立谷氨酸誘導(dǎo)損傷的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，探討燈盞細(xì)辛合尼莫地平合用對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 1）細(xì)胞株：高分化PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。2）藥物與試劑：燈盞細(xì)辛注射液，云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20130436。尼莫地平注射液，青島金峰制藥有限公司，批號(hào)13101101。高糖DMEM培養(yǎng)基（H-DMEM），Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清，?？寺」井a(chǎn)品。谷氨酸（Glu）：Amresco公司產(chǎn)品。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。完全培養(yǎng)液：含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素的HDMEM培養(yǎng)液。燈盞細(xì)辛培養(yǎng)液和尼莫地平培養(yǎng)液分別用不含胎牛血清的完全培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。3）主要儀器：MCO175型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 （日本SANYO公司產(chǎn)品）；倒置顯微鏡（日本Olympus產(chǎn)品）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)為CYTOMICS FC500，日本BECKMAN COULTER產(chǎn)品）。

1.2 PC12細(xì)胞的培養(yǎng) PC12細(xì)胞用完全培養(yǎng)基在37℃，5%CO2，飽和濕度的條件下培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 Glu誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的建立 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全融合后，磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕蕩洗兩遍，加入含Glu無(wú)胎牛血清完全培養(yǎng)液，使Glu終濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10、20、30、50 mmol/L，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)未加藥物的無(wú)血清培養(yǎng)液組作對(duì)照，在加藥培養(yǎng)后的16 h時(shí)，以MTT法測(cè)定其增殖情況。

1.4 燈盞細(xì)辛對(duì)Glu誘導(dǎo)PC12細(xì)胞增殖的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全融合后，隨機(jī)分組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，其中空白對(duì)照組和誘導(dǎo)損傷液組換用無(wú)血清完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，燈盞細(xì)辛培養(yǎng)液組，加入終濃度分別為原液、1/4原液、1/16原液、1/64原液的燈盞細(xì)辛培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h，然后除空白對(duì)照組外，其余各組均換用含上述篩選濃度的Glu誘導(dǎo)損傷液繼續(xù)培養(yǎng)16 h，以MTT法測(cè)定其增殖情況。

1.5 尼莫地平對(duì)Glu誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞凋亡的影響取出接種24孔培養(yǎng)板且鋪滿單層的PC12細(xì)胞，棄原培養(yǎng)基，用PBS蕩洗1次，隨機(jī)分為8組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，其中空白對(duì)照組和誘導(dǎo)損傷液組換用無(wú)血清完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，尼莫地平培養(yǎng)液組加入終濃度分別為20、10、5 μmol/L尼莫地平培養(yǎng)液，分別作用2 h和4 h，除空白對(duì)照組外，其余各組均換用含上述篩選濃度的Glu誘導(dǎo)損傷液繼續(xù)培養(yǎng)16 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，0.25%胰酶消化，完全培養(yǎng)液終止，1000 r/min離心5 min，棄上清，按照Annexin V-FITC試劑盒說(shuō)明操作，上流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡情況。

1.6 燈盞細(xì)辛與尼莫地平合用對(duì)Glu誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞凋亡影響 取出接種24孔培養(yǎng)板且鋪滿單層的PC12細(xì)胞，棄原培養(yǎng)基，用PBS蕩洗1次，隨機(jī)分為8組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，其中空白對(duì)照組和誘導(dǎo)損傷液組換用無(wú)血清完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，燈盞細(xì)辛與尼莫地平合用組，分別加入含燈盞細(xì)辛（通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)篩選出的燈盞細(xì)辛最佳劑量組）與尼莫地平高、中、低藥液的無(wú)血清完全培養(yǎng)液，其中3組先加燈盞細(xì)辛培養(yǎng)液作用2 h后，再加入不同劑量的尼莫地平培養(yǎng)液再共同作用2 h；另3組為燈盞細(xì)辛與不同劑量的尼莫地平培養(yǎng)液共同作用4 h后，除正常對(duì)照組外，其余各組均換用含上述篩選濃度的Glu誘導(dǎo)損傷液繼續(xù)培養(yǎng)16 h，處理同前，上流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Glu誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的建立 見(jiàn)表1。含0.1～5 mmol/L Glu對(duì)PC12細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，而10～50 mmol/L Glu對(duì)PC12細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，因此，本研究擬選用10 mmol/L Glu作為造模濃度。

表1 各組PC12細(xì)胞增殖的比較（±s）

表1 各組PC12細(xì)胞增殖的比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，△P＜0.01。

組 別 n 劑量（m m o l / L） 細(xì)胞增殖（A 5 7 0 n m）空白對(duì)照組 3 — 2 . 5 6 ± 0 . 1 3 G l u誘導(dǎo)損傷組 3 0 . 1 2 . 4 5 ± 0 . 0 5 3 0 . 5 2 . 5 0 ± 0 . 0 8 3 1 . 0 2 . 4 0 ± 0 . 0 5 3 5 . 0 2 . 4 0 ± 0 . 0 7 3 1 0 . 0 2 . 1 5 ± 0 . 1 9△3 2 0 . 0 1 . 5 0 ± 0 . 1 3△3 3 0 . 0 0 . 7 4 ± 0 . 0 6△3 5 0 . 0 0 . 0 5 ± 0 . 0 1△

2.2 燈盞細(xì)辛對(duì)Glu誘導(dǎo)PC12細(xì)胞增殖的影響 見(jiàn)表2。燈盞細(xì)辛1/4原液，1/16原液組能明顯促進(jìn)Glu損傷的PC12細(xì)胞增殖，與誘導(dǎo)損傷組比較有顯著差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；原液組和1/64原液組與誘導(dǎo)損傷組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組Glu損傷PC12細(xì)胞增殖的比較（±s）

表2 各組Glu損傷PC12細(xì)胞增殖的比較（±s）

與誘導(dǎo)損傷組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n 劑量（m m o l / L） 細(xì)胞增殖（A 5 7 0 n m）空白對(duì)照組 3 — 2 . 5 6 ± 0 . 1 3 G l u誘導(dǎo)損傷組 3 — 2 . 1 5 ± 0 . 1 9燈盞細(xì)辛組 3 原液 2 . 2 2 ± 1 . 9 5△△3 1 / 4原液 2 . 4 9 ± 0 . 1 0**3 1 / 1 6原液 2 . 6 9 ± 0 . 0 8**3 1 / 6 4原液 2 . 2 8 ± 0 . 1 3△

表3 各組Glu損傷PC12細(xì)胞凋亡的比較（±s）

表3 各組Glu損傷PC12細(xì)胞凋亡的比較（±s）

組 別 n 劑量（m m o l / L） 細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組 3 — 1 4 . 2 3 ± 4 . 3 5 G l u誘導(dǎo)損傷組 3 — 1 . 0 7 ± 0 . 1 5尼莫地平2 h組 3 2 0 2 . 4 3 ± 0 . 5 1**3 1 0 7 . 8 0 ± 1 . 9 1*△△3 5 1 2 . 1 7 ± 6 . 2 8△△尼莫地平4 h組 3 2 0 1 . 5 7 ± 0 . 6 4**3 1 0 1 . 1 6 ± 0 . 5 9**3 5 3 . 7 0 ± 1 . 3 5**

2.3 尼莫地平對(duì)Glu誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞凋亡的影響見(jiàn)表3。尼莫地平20 mol/L濃度組作用2 h，尼莫地平3個(gè)濃度組作用4 h，均能明顯抑制Glu誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞凋亡，與誘導(dǎo)損傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），提示尼莫地平對(duì)Glu誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用成時(shí)間和劑量依賴(lài)性，劑量越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，效果越明顯。

2.4 燈盞細(xì)辛與尼莫地平合用對(duì)Glu誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞凋亡影響 見(jiàn)表4。燈盞細(xì)辛原液/4與尼莫地平3個(gè)濃度組合用，無(wú)論作用2 h還是4 h，均能明顯抑制Glu誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞凋亡，與誘導(dǎo)損傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），提示燈盞細(xì)辛可以增強(qiáng)尼莫地平的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

表4 各組Glu損傷PC12細(xì)胞凋亡的比較（±s）

表4 各組Glu損傷PC12細(xì)胞凋亡的比較（±s）

組 別 n 劑量（m m o l / L） 細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組 3 — 1 4 . 2 3 ± 4 . 3 5 G l u誘導(dǎo)損傷組 3 — 1 . 0 7 ± 0 . 1 5燈盞細(xì)辛合 3 2 0 2 . 0 7 ± 0 . 9 5**尼莫地平2 h組 3 1 0 4 . 6 7 ± 1 . 0 1**△3 5 6 . 5 7 ± 2 . 6 8**△△燈盞細(xì)辛合 3 2 0 1 . 4 7 ± 0 . 5 5**尼莫地平4 h組 1 0 1 0 0 . 3 0 ± 0 . 5 2**3 5 2 . 9 3 ± 0 . 8 4**

3 討 論

腦缺血是一個(gè)復(fù)雜的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)機(jī)制，其核心問(wèn)題是神經(jīng)元損害引起的神經(jīng)功能障礙，腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞并不會(huì)立即死亡，而是神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［2］是一漸進(jìn)的過(guò)程，這就為神經(jīng)保護(hù)治療帶來(lái)了機(jī)會(huì)［3］。

目前，雖然神經(jīng)保護(hù)劑的研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但是幾乎所有的神經(jīng)保護(hù)劑臨床均無(wú)效或效果很差，或因嚴(yán)重副作用，限制了臨床應(yīng)用［4］，因此，進(jìn)一步研究新的神經(jīng)保護(hù)劑或?qū)で笮碌纳窠?jīng)保護(hù)方法成為研究的重點(diǎn)。缺血性腦卒中級(jí)聯(lián)損傷的“瀑布反應(yīng)”是非線性和循環(huán)的，采用作用機(jī)制多樣的神經(jīng)保護(hù)劑，或聯(lián)合作用于級(jí)聯(lián)反應(yīng)不同環(huán)節(jié)的幾種神經(jīng)保護(hù)劑，即神經(jīng)保護(hù)劑雞尾酒療法［5］也得到越來(lái)越多的關(guān)注。尼莫地平是二氫吡啶類(lèi)（DHPs）鈣離子拮抗劑，具有脂溶性，易于穿透血腦屏障（blood-brain barrier），并具有選擇性擴(kuò)張腦血管作用及神經(jīng)和精神藥理活性，實(shí)驗(yàn)證實(shí)尼莫地平具有明顯的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)［6］，但由于其選擇性不高、系統(tǒng)性血壓降低等副作用，限制了其臨床應(yīng)用。

燈盞細(xì)辛來(lái)源于菊科飛蓬屬植物短草飛蓬，始載于《滇南本草》，其記載有“左癱右瘓，水煎點(diǎn)水酒服”。研究顯示［7-9］，燈盞細(xì)辛能改善腦缺血患者的腦血液循環(huán)，減輕腦組織缺血性損傷，增加腦血流量，使梗死灶的血供恢復(fù)；而申亮等［10］研究顯示燈盞細(xì)辛具有較強(qiáng)的清除自由基作用；張靜等［11］研究顯示，燈盞細(xì)辛能促進(jìn)大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞的存活而達(dá)到腦保護(hù)的作用；大量現(xiàn)代藥理研究均證實(shí)，它能擴(kuò)張微細(xì)血管改善微循環(huán)，降低血液黏稠度，清除氧自由基，抗炎、對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化及缺血再灌注等廣泛的藥理作用。而其與尼莫地平合用對(duì)腦缺血患者的腦保護(hù)作用，研究甚少。

本研究結(jié)果顯示，燈盞細(xì)辛1/4原液、1/16原液組對(duì)體外建立的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型具有明顯的保護(hù)作用，尼莫地平單藥對(duì)體外建立的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型也具有保護(hù)作用，且成時(shí)間和劑量依賴(lài)性，劑量越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，效果越明顯。將燈盞細(xì)辛與尼莫地平合用，探討其共作用對(duì)體外建立的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，燈盞細(xì)辛可以增強(qiáng)尼莫地平的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，能有效減少和降低尼莫地平的用量和作用時(shí)間，達(dá)到神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。這也表明雞尾酒療法有助于神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)性治療，也進(jìn)一步提示我們臨床上二藥合用，有助于缺血性腦卒中的治療，但是二者合用的作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步探索。

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Objective：To investigate the effects of Erigeron breviscapus and nimodipine on neurons apoptosis of PC12 cell induced by glutamate.Methods：PC12 cells were cultured，using glutamate to intervention，then with flow cytometry to detect the effects of apoptosis by Erigeron breviscapus and nimodipine.Results：10，20 μmol/L dose group in 2 h and three dose group in 4 h of Nimodipine can inhibit the apoptosis of PC12 cells obviously. Erigeron breviscapus and nimodipine with different dose in 2 h and 4 h can inhibit the apoptosis of PC12 cells obviously.Conclusion：Nimodipine can inhibit the apoptosis of PC12 cells on time and is dose dependent. Erigeron breviscapus and nimodipine can inhibit the apoptosis of PC12 cells obviously.Erigeron breviscapus can induce the time and dose of nimodipine.

Erigeron breviscapus；Nimodipine；Glutamate；Neurons apoptosis

R285.6

A

1004-745X（2015）08-1367-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.020

2015-02-18）

廣東省佛山市醫(yī)學(xué)類(lèi)科技攻關(guān)項(xiàng)目（No.201308179）

To Investigate the Protective Effects of Erigeron Breviscapus and Nimodipine on Neurons Damage In-duced by Glutamate

LIU Xinying，WU Zuqiang，LI Rong，et al. Luocun Hospital of Nanhai Foshan，Guangdong，F(xiàn)oshan 528226，China