桃葉珊瑚苷對急性腦出血大鼠腦組織IL-1β及NF-κB的影響*

劉秋庭姚 靚涂鄂文譚 莉李曉輝王 照胡 丹

（1.湖南省腦科醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410007）

·研究報告·

桃葉珊瑚苷對急性腦出血大鼠腦組織IL-1β及NF-κB的影響*

劉秋庭1姚 靚2涂鄂文1譚 莉1李曉輝1王 照1胡 丹2

（1.湖南省腦科醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410007）

目的觀察桃葉珊瑚苷對急性腦出血大鼠血腫周圍組織白介素-1β（IL-1β）及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）表達(dá)的影響，探討桃葉珊瑚苷保護(hù)腦出血后神經(jīng)元損傷的機(jī)制。方法健康SD大鼠90只按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦出血組、桃葉珊瑚苷組。腦出血組及桃葉珊瑚苷組于大鼠尾殼核區(qū)注入自體非肝素抗凝動脈血，建立腦出血動物模型，假手術(shù)組于相同部位注入0.9%氯化鈉注射液。造模成功后，桃葉珊瑚苷組于術(shù)后2 h給予桃葉珊瑚苷4.2 mg/kg，腹腔注射，每日1次。而假手術(shù)組及腦出血組在同樣時間給予相同劑量0.9%氯化鈉注射液。每組設(shè)置12 h、2 d、3 d、5 d、7 d等5個時間點(diǎn)，Longa評分法評估神經(jīng)功能缺損，免疫組化方法檢測血腫周圍腦組織中IL-1β和NF-κB的表達(dá)。結(jié)果與腦出血組比較，桃葉珊瑚苷組血腫周圍IL-1β和NF-κB表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論桃葉珊瑚苷對腦出血后神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制 IL-1β和NF-κB的表達(dá)有關(guān)。

腦出血 桃葉珊瑚苷IL-1β NF-κB

腦出血（ICH）是神經(jīng)內(nèi)科一種具有高致死率及致殘率的多發(fā)病和常見病。目前臨床上除運(yùn)用傳統(tǒng)脫水藥物治療外，治療手段較少。ICH急性期腦組織發(fā)生一系列的病理生理變化，其中炎癥反應(yīng)在ICH后繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮了重要作用［1］。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，通過誘導(dǎo)多種炎癥因子表達(dá)，在腦缺血及細(xì)胞凋亡中起著中心環(huán)節(jié)的作用［2］。本實驗通過觀察桃葉珊瑚苷對ICH大鼠血腫周圍腦組織白介素-1β（IL-1β）和NF-κB表達(dá)及神經(jīng)功能缺損評分的影響，觀察其對腦出血后繼發(fā)性腦損害的保護(hù)作用，以探索腦出血治療的新思路?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠90只，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，體質(zhì)量250～270 g。

1.2 藥物與試劑 桃葉珊瑚苷購于四川維克奇生物科技有限公司。免抗大鼠IL-1β和NF-κB免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物試劑公司；通用型二抗免疫組化試劑盒購于北京中山金橋生物試劑公司。

1.3 分組與造模 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成假手術(shù)組、腦出血組、桃葉珊瑚苷組，每組30只。治療組于造模后2 h給予桃葉珊瑚苷4.2 mg/kg，腹腔注射，每日1次［3］。假手術(shù)組及腦出血組在同樣時間給予相同劑量的0.9%氯化鈉注射液。參照Rosenberg等報道的方法制備大鼠腦出血模型。用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠 （400 mg/kg），將其俯臥位固定在立體定位儀上，調(diào)節(jié)門齒托的高度，使大鼠前囟前、后囟處于同一水平，沿頭皮正中切一長10 mm切口，無菌操作暴露前囟，定位于前囟前0.2 mm，中線向右旁開3 mm處鉆一直徑為0.5 mm的小孔，進(jìn)針深度為5.5 mm（即尾殼核位置）。取大鼠尾靜脈自體抗凝血50 μL，用微量進(jìn)樣器在8～10 min內(nèi)緩慢、多次、少量注入，注血結(jié)束后留針10 min后緩慢退針，局部用骨蠟封閉后縫合皮膚。假手術(shù)組于相同部位注入等量無菌0.9%氯化鈉注射液。以術(shù)后見明顯肢體癱瘓，大鼠腦切片中有明顯的圓形、橢圓形或不規(guī)則形的血腫存在為模型成功標(biāo)準(zhǔn)，不符合以上標(biāo)準(zhǔn)及死亡者剔除。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行，術(shù)畢將大鼠放回籠中飼養(yǎng)，自由活動進(jìn)食進(jìn)水。

1.4 觀察指標(biāo) 1）大鼠神經(jīng)功能缺損評價。參照Longa 5級評分法［4］，對神經(jīng)功能評分。0級：無體征，記0分。1級：動物不能完全伸直其前肢，記1分。2級：動物一側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象，記2分。3級：動物不能站立或打滾，記3分。4級：無自發(fā)性活動，有意識障礙記4分。2）免疫組織化學(xué)染色檢測IL-1β和NF-κB的表達(dá)。每組設(shè)置12 h、2 d、3 d、5 d、7 d等5個時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)6只大鼠。在相應(yīng)時間點(diǎn)用水合氯醛深度麻醉大鼠，劍突下橫切口，沿膈肌與胸廓交界處剪開膈肌，暴露心臟，于心尖向上進(jìn)針，插入升主動脈，固定針頭，剪開右心耳，快速滴入37℃0.9%氯化鈉注射液100 mL，至右心耳流出液體變清亮，后用4%的多聚甲醛（0.1 mmol/L PBS配制，pH 7.2～7.4）灌注（10 mL/min），先快后慢，約250 mL。斷頭開顱取全腦，去除嗅腦、小腦和低位腦干，將腦組織置于濃度為4%的多聚甲醛中固定48 h。于穿刺針點(diǎn)為中心分別向前、后各移1.0 mm將腦組織冠狀切開，修成包含出血區(qū)及周邊區(qū)的4 mm、厚約2 mm的腦片，常規(guī)石蠟包埋，然后在切片機(jī)上連續(xù)切片，片厚2 μm，行IL-1β和NF-κB免疫組化染色。切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 M檸檬酸鈉緩沖液微波修復(fù)10 min；滴加一抗，4℃過夜，PBS液漂洗2 min×3次；加二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗2 min× 3次；DAB顯色，中性樹膠封片。在400倍視野下，用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)軟件隨機(jī)觀察并計數(shù)血腫周圍4個不重復(fù)視野的不同時間段大腦IL-1β和NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSSl3.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較 見表1。假手術(shù)組無明顯神經(jīng)功能缺損，腦出血組與桃葉珊瑚苷組神經(jīng)功能缺損呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，都于術(shù)后3 d達(dá)高峰，其中，桃葉珊瑚苷組神經(jīng)功能缺損程度評分顯著低于腦出血組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分比較（分，±s）

與腦出血組比較，△P＜0.05。

組別 n 1 2 h 2 d 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 3 0腦出血組 3 0 0 . 2 0 ± 0 . 4 0 - -2 . 6 0 ± 0 . 3 0 2 . 0 0 ± 0 . 3 0 1 . 4 0 ± 0 . 5 0 --1 . 1 0 ± 0 . 5 0 0 . 8 0 ± 0 . 3 0桃葉珊瑚苷組 3 0 2 . 3 0 ± 0 . 4 0△1 . 7 0 ± 0 . 6 0△0 . 8 0 ± 0 . 5 0△0 . 4 0 ± 0 . 6 0△0 . 2 0 ± 0 . 5 0△

2.2 各組血腫周圍腦組織IL-1β表達(dá)的比較 見表2。假手術(shù)組僅見少量淡黃色陽性染色細(xì)胞，同組各時間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后12 h腦出血組及桃葉珊瑚苷組腦血腫區(qū)域即出現(xiàn)黃色淡染細(xì)胞，術(shù)后3 d兩組IL-1β免疫反應(yīng)達(dá)高峰，可見黃褐色深染的IL-1β陽性神經(jīng)細(xì)胞，組間比較，桃葉珊瑚苷組其陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于腦出血組（P＜0.05）。

表2 各組血腫周圍腦組織IL-1β表達(dá)比較（ng/L，±s）

表2 各組血腫周圍腦組織IL-1β表達(dá)比較（ng/L，±s）

與腦出血組同期比較，△P＜0.05。下同。

組別 n 1 2 h 2 d 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 3 0腦出血組 3 0 6 . 0 0 ± 1 . 2 0 6 . 0 0 ± 1 . 2 0 7 . 0 0 ± 1 . 1 0 2 6 . 0 0 ± 1 . 2 0 3 6 . 0 0 ± 1 . 5 0 5 9 . 0 0 ± 3 . 4 0 6 . 0 0 ± 1 . 2 0 5 . 0 0 ± 1 . 1 0 4 0 . 0 0 ± 2 . 9 0 4 6 . 0 0 ± 2 . 6 0桃葉珊瑚苷組 3 0 1 9 . 0 0 ± 0 . 6 0△3 0 . 0 0 ± 0 . 3 0△4 0 . 0 0 ± 3 . 5 0△3 2 . 0 0 ± 2 . 2 0△2 6 . 0 0 ± 2 . 5 0△

2.3 各組血腫周圍腦組織NF-κB表達(dá)的比較 見表3。假手術(shù)組大鼠腦內(nèi)NF-κβ陽性表達(dá)極少，腦出血組見較多NF-κB p65陽性表達(dá)，與腦出血組比較，桃葉珊瑚苷組各時間點(diǎn)NF-κβ p65陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。

表3 各組腦血腫周圍NF-κβ數(shù)目情況比較（±s）

表3 各組腦血腫周圍NF-κβ數(shù)目情況比較（±s）

組別 n 1 2 h 2 d 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 3 0腦出血組 3 0 3 . 4 4 ± 0 . 2 8 3 . 5 3 ± 0 . 4 0 3 . 4 8 ± 0 . 2 3 2 1 . 8 2 ± 1 . 9 3 5 9 . 0 6 ± 3 . 4 5 9 1 . 2 2 ± 5 . 1 4 3 . 5 7 ± 0 . 3 6 3 . 5 2 ± 0 . 2 8 7 1 . 4 2 ± 4 . 1 3 5 0 . 0 2 ± 2 . 2 1桃葉珊瑚苷組 3 0 1 5 . 9 1 ± 1 . 6 7△4 1 . 2 0 ± 2 . 5 1△5 8 . 0 6 ± 3 . 7 4△4 2 . 7 3 ± 3 . 2 8△3 0 . 1 5 ± 2 . 1 3△

2.4 NF-κB、IL-1β及神經(jīng)功能缺損評分的相關(guān)性經(jīng)Spesrman等級相關(guān)分析，NF-κB和IL-1β呈正相關(guān)（r=0.94，P＜0.01），NF-κB和神經(jīng)功能缺損評分呈正相關(guān)（r=0.93，P＜0.01）。

3 討 論

桃葉珊瑚苷是一種環(huán)烯醚帖類化合物，具有多種生物學(xué)活性，如降血壓、肝臟保護(hù)、抗炎、抗微生物、止痛、通便、抗腫瘤等，尤其是能夠緩解由腦病引起的損傷［5-6］。本實驗結(jié)果顯示：桃葉珊瑚苷組神經(jīng)功能缺損評分較腦出血組明顯降低，提示桃葉珊瑚苷有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。

NF-κB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，主要由NF-κB p50和NF-κB p65組成的異源性二聚體，廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體受到特定刺激時，如炎癥遞質(zhì)、紫外線等，通過白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）介導(dǎo)的一系列信號途徑，導(dǎo)致IκB蛋白磷酸化降解，使NF-κB恢復(fù)活性，從而調(diào)控ICAM-1、TNF-α等炎性因子的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等重要的病理生理過程［7］。研究表明，ICH急性期IL-1β在血清和腦脊液中的表達(dá)明顯增高，并于出血后2～3 d達(dá)高峰；用重組IL-1β向大鼠腦內(nèi)注射，發(fā)現(xiàn)注射通道周圍出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤和水腫形成，繼續(xù)給予大劑量注射，腦水腫更明顯。因此，IL-1β是通過炎癥反應(yīng)及增加血腦屏障通透性，引起腦水腫，使其成為ICH后炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志［8］。本實驗結(jié)果顯示，大鼠腦出血后腦組織IL-1β和大鼠神經(jīng)功能缺損評分呈正相關(guān)，IL-1β和NF-κB的表達(dá)水平也顯著相關(guān)，由此推斷NF-κB可能通過調(diào)控IL-1β的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致繼發(fā)性腦神經(jīng)損傷。

桃葉珊瑚苷具有抗炎作用，在由抗原刺激的大鼠嗜堿性白細(xì)胞（RBL-2H3 mast）培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷可抑制由抗原刺激產(chǎn)生的TNF-α和IL-1等炎癥因子的基因表達(dá)與蛋白合成；同時，桃葉珊瑚苷能抑制NF-κB的亞單位由細(xì)胞胞漿內(nèi)向核內(nèi)的轉(zhuǎn)位，并通過抑止κBα的磷酸化阻止Iκ-Bα的降解，使胞漿內(nèi)Iκ-Bα濃度升高，進(jìn)而抑制NF-κβ活性，而下調(diào)TNF-α，產(chǎn)生抗炎效果［9］。本實驗結(jié)果表明，桃葉珊瑚苷能有效減輕腦出血后繼發(fā)性腦神經(jīng)損傷，且明顯抑制腦組織IL-1β表達(dá)，這提示IL-1β可能成為桃葉珊瑚苷通過抗炎來減輕繼發(fā)性腦神經(jīng)損傷的作用靶點(diǎn)。

［1］ Xiang JZ，Hai Y，Shu CH.Brain edema after intracerebral hemorrhage in rats：the role of inflammation［J］.Neurology Indian，2006，54（4）：402-407.

［2］ Yamamoto M，Takeda K.Role of nuclear I kappa B proteins in the regulation of host immune responses［J］.Infect Chemother，2008，14（4）：265-269.

［3］ 金雷，薛宏宇，徐永平.桃葉珊瑚苷對糖尿病大鼠線粒體抗氧化作用［J］.山西醫(yī)藥，2008，48（4）：16-17.

［4］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebralartery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

［5］ An SJ，Pae HO，Oh GS，et al.Inhibition of TNF-α，IL-1，and IL-6 productions and NF-κB activation in lipopolysaccharide-activated RAW 264.7 macrophages by catalposide，an iridoid glycoside isolated from Catalpa ovata G［J］.Don（Bignoniaceae）.Int Immunopharmacol，2002，2（15）：1173-1181.

［6］ 薛宏宇，金禮吉，金雷.桃葉珊瑚苷在初級糖尿病腦病中的神經(jīng)保護(hù)作用［J］.中國科學(xué)，2008，38（7）：599-605.

［7］ Yamamoto M，Takeda K.Role of nuclear I kappa B proteins in the regulation of host immune responses［J］.Infect Chemother，2008，14（4）：265-269.

［8］ Carhuapoma JR，Barker PB，Hanley DF，et al.Human brain hemorrhage：quantification of perihematoma edema by use of diffusion weighted MR imaging［J］.Am J Neuroradiol，2002，23（8）：1322-1326.

［9］ Jeong HJ，Koo HN，Na HJ，et al.Inhibition of TNF-alpha and IL-6 production by Aucubin through blockade of NF-kappa B activation RBL-2H3mast cells［J］.Cytokine，2002，18（5）：252.

The Influence of Aucubin on IL-1β and NF-κβ Expression after Cerebral Hemorrhage in Rats

LIU Qiuting，YAO Liang，TU Ewen，et al.Brain Hospital of Hunan Province，Hunan，Changsha 410007，China

Objective：To explore the possible mechanism of Aucubin to neuroprotection by inhibiting the expression of IL-1β and NF-κB to reduce inflammatory response after cerebral hemorrhage and open up new ideas for questing cerebral hemorrhage treatment.Methods：90 adult male Sprague Dawley rats were randomly divided into the sham operation group，the cerebral hemorrhage group and the aucubin group.Autologous blood was injected into the rat caudate nucleus to prepare cerebral hemorrhage，and sham operation group injected with saline at the same site.Two hours after the surgery，the aucubin group was injected intraperitoneal with aucubin 4.2 mg/ kg once a day，each rat of the sham operation and cerebral hemorrhage rats was injected the same amount of saline.After surgery，each group was randomly divided into five time points，which were 12 h，2 d，3 d，5 d and 7 d.The neural function score of a model rat was evaluated by longa score.The expression of IL-1β and NF-κβ around the hematoma was tested by immunohistochemistry.Results：In the aucubin group，the number of IL-1β and NF-κβ around the hematoma decreased significantly at each time point，than the cerebral group.Conclusion：The aucubin has an evident protective effect on injured neuron after cerebral hemorrhage in rats.

Cerebral hemorrhage；Aucubin；IL-1β；NF-κβ

R285.5

A

1004-745X（2015）08-1327-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.005

2015-03-24）

湖南省科技廳科技項目 （2013SK3214）