升氣壯陽膏方聯(lián)合特異性免疫對哮喘小鼠氣道炎癥的影響*

江文文莊 森廖若莎許楷斯翁澤林許尤佳

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州510120）

·研究報告·

升氣壯陽膏方聯(lián)合特異性免疫對哮喘小鼠氣道炎癥的影響*

江文文1莊 森1廖若莎2△許楷斯2翁澤林2許尤佳2

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州510120）

目的觀察中藥膏方聯(lián)合特異性免疫治療（SIT）對小鼠支氣管哮喘的治療作用。方法將BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白對照組、哮喘模型組、SIT組、SIT聯(lián)合中藥膏方組，采用卵清蛋白（OVA）腹腔注射及霧化激發(fā)構(gòu)建支氣管哮喘小鼠模型，給予SIT及中藥膏方灌胃治療，進(jìn)行肺泡灌洗液細(xì)胞計數(shù)和分類，用ELISA法測定血清IgE、肺泡灌洗液IL-4、IFN-γ含量，用HE染色法檢測小鼠肺組織病理學(xué)改變。結(jié)果SIT、中藥膏方聯(lián)合SIT治療組小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤程度減輕，其中后者作用更顯著，血清IgE水平較哮喘組下降（P＜0.05），中藥膏方組聯(lián)合SIT組較SIT下降顯著；SIT、中藥膏方聯(lián)合SIT組在肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)均減少，BALF的IL-4下降、IFN-γ上升（P＜0.05），但兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論中藥膏方聯(lián)合特異性免疫治療可以降低小鼠血清IgE水平，減輕肺部炎癥細(xì)胞浸潤程度。

膏方 支氣管哮喘 特異性免疫治療

特異性免疫治療（SIT）是目前唯一針對哮喘病因的治療，能夠改善哮喘的自然病程［1］，而其全身性不良反應(yīng)的發(fā)生和起效緩慢成為限制特異性免疫治療發(fā)展的主要因素［2］。中醫(yī)藥治療哮喘有著悠久的歷史，療效卓著。在前期研究中［3-4］，筆者嘗試中醫(yī)藥聯(lián)合SIT以期減少SIT不良反應(yīng)的發(fā)生，臨床取得滿意效果。中藥膏方是哮喘緩解期常用的治療方法，筆者觀察中藥膏方聯(lián)合SIT對哮喘小鼠的治療作用，探索其作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Balb/c小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量16～20 g，共20只，購于廣東省實驗動物中心，合格證號為44007200009645。

1.2 藥物 升氣壯陽膏方（白術(shù)80 g，補(bǔ)骨脂100 g，防風(fēng)50 g，升麻30 g，太子參60 g，陳皮20 g，石菖蒲50 g，芒果核150 g，川續(xù)斷100 g，甘草30 g）由廣東省中醫(yī)院中藥房提供，最終濃度為4.8 mg/mL。

1.3 試劑與儀器 卵清蛋白（OVA）：美國Sigma公司，批號為A5503-1G。鋁佐劑（Imject Alum）：美國Thermo公司，批號為7716。小鼠IgE ELISA試劑盒（Mouse IgE ELISA Kit 96T）：廣州妙博生物技術(shù)有限公司，批號為70-E-EK2752。小鼠IL-4 ELISA試劑盒 （Mouse IL-4 ELISA Kit 96T）：廣州妙博生物技術(shù)有限公司，批號為70-E-EK2042。小鼠IFN-γ ELISA試劑盒（Mouse IFN-γ ELISA Kit 96T）：廣州妙博生物技術(shù)有限公司，批號為70-E-EK2802。超聲霧化機(jī)：402型超聲霧化器，上海合力醫(yī)療器械廠。

1.4 模型制備 造模方法參照文獻(xiàn)報道［5］。致敏：采用OVA腹腔注射致敏；分別于第0、7、14日經(jīng)小鼠腹腔注射200 μL濃度為0.1 mg/mL混合致敏液（0.1%OVA 100 μL，與等體積佐劑液態(tài)鋁［（imject alum）混合］，對照組給予200 uL（PBS+鋁佐劑）腹腔注射。激發(fā)：于第24、25、26日將小鼠置于一密閉容器中（20 cm×40 cm× 50 cm）中，以1%的OVA溶液10 mL霧化吸入，每日1次，在最后1次激發(fā)后48 h（第28日）處死小鼠，收集標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)研究。

1.5 分組與方法 將20只Balb/c小鼠編號，再用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取分為A組：空白對照組。B組：哮喘模型組。C組：SIT組。D組：SIT加中藥膏方組，每組5只。C組、D組，于第14、16、18、20、22、24、26日，行SIT，尾跟部皮下注射OVA 1 mg，共7次，A、B組注射等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液。中藥膏方：D組于第14～27日給藥治療，每日1次，共用藥2周。予膏方以10.73 g/（kg·d）灌胃（開水沖溶，冷卻至適宜溫度，1 mL溫水約溶解0.5 mL膏方），其余各組給予等體積PBS灌胃。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 血清：于實驗第28日將小鼠摘眼球取血，留取血清，-20℃保持檢測細(xì)胞因子。肺泡灌洗：采用支氣管肺泡灌洗術(shù)行小鼠肺泡灌洗［6］，氣管內(nèi)插管，PBS 0.8 mL，灌洗2次，灌洗液回收率≥80%，以1500 r/min將BALF離心心10 min，離心管底部出現(xiàn)乳白色細(xì)胞沉淀，取上清液用于細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-4）檢測，細(xì)胞沉淀經(jīng)100 μL 0.9%氯化鈉溶液重懸后涂片，風(fēng)干后行劉氏染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類，數(shù)200個細(xì)胞，求出百分比。用所得的細(xì)胞總數(shù)乘以百分比即各類細(xì)胞的絕對計數(shù)。肺病理：取肺組織，甲醛固定，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色，然后行病理檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗，若符合正態(tài)分布、方差齊，進(jìn)行單因素方差分析；若不服從正態(tài)分布和 （或）方差不齊的資料，進(jìn)行秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 中藥膏方聯(lián)合SIT對肺泡灌洗液BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)的影響 見表1。B組、C組和D組的細(xì)胞總數(shù)均高于A組，尤其B組的細(xì)胞總數(shù)顯著增加；細(xì)胞分類方面，結(jié)果表明除了A組，其余3組的嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)均增加（均P＜0.05），其中C組和D組嗜酸性粒細(xì)胞均較B組下降，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠BALF中細(xì)胞的總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)比較（×104/mL，±s）

表1 各組小鼠BALF中細(xì)胞的總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)比較（×104/mL，±s）

與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05。下同。

組別 n 總細(xì)胞數(shù) 嗜酸性細(xì)胞數(shù)A組 5 1 . 8 ± 0 . 8 4 0 B組 5 1 1 . 2 ± 3 . 5 6*2 . 8 ± 1 . 3 0*C組 5 4 . 2 ± 1 . 4 8#1 . 4 ± 1 . 2#D組 5 4 . 8 ± 3 . 0 3#1 . 2 ± 0 . 4 5#

2.2 各組肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IFN-γ水平的比較 見表2。B組較A組IL-4明顯升高，而IFN-γ顯著降低；治療組C組和D組較哮喘組IL-4下降，IFN-γ上升（均P＜0.05）；而C組和D組比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠BALF中IL-4、IFN-γ水平和血清IgE水平比較（±s）

表2 各組小鼠BALF中IL-4、IFN-γ水平和血清IgE水平比較（±s）

組別n I g E（n g / m L）I L -4（p g / m L） I F N -γ（p g / m L）A組 5 8 9 . 2 1 ± 4 8 . 6 5 B組 5 7 5 6 . 2 6 ± 1 1 3 . 7 5*C組 5 2 8 8 . 0 9 ± 1 6 2 . 5 2#2 5 5 . 8 ± 1 0 6 . 3 4 3 5 3 . 0 4 ± 1 8 4 . 7 5 3 3 1 . 6 6 ± 1 7 5 5 . 8 9*1 1 2 . 6 2 ± 5 7 . 4 9*3 0 1 . 6 ± 1 7 7 . 3 8#2 0 8 . 9 1 ± 9 4 . 8 3#D組 5 1 5 9 . 0 1 ± 5 3 . 4 8##3 4 0 . 4 0 ± 3 2 2 . 5 1#1 7 7 . 0 4 ± 9 3 . 0 4#

2.3 各組血清IgE水平比較 見表2。B組、C組、D組小鼠肺泡灌洗液IgE的水平均高于對照組，其中C組、D組均低于B組，D組低于C組（均P＜0.05）。

2.4 各組肺病理比較 A組：小鼠支氣管壁未見炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)完好，未見平滑肌增生，管腔內(nèi)未見分泌物。B組：小鼠支氣管壁及周圍組織見大量的炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞為主，黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，部分可見黏液上皮化生，管腔內(nèi)見黏液性分泌物存留；部分區(qū)域肺泡隔增寬，血管旁多量慢性炎癥細(xì)胞浸潤。C組：支氣管壁及周圍組織炎癥細(xì)胞較模型組減少，上皮細(xì)胞受損減輕，管腔內(nèi)分泌物減少。D組：肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血程度較模型組減輕，支氣管上皮結(jié)構(gòu)完整，腔內(nèi)無明顯分泌物，氣道平滑肌層稍增生，厚度比SIT組稍薄，肺泡間隔窄，肺泡腔內(nèi)透亮，無明顯炎性滲出。

圖1 各組小鼠肺組織病理表現(xiàn)（HE，×20）

3 討 論

SIT能夠改善哮喘癥狀，可減少哮喘癥狀評分、藥物需求，減輕氣道高反應(yīng)性［7］，SIT通過干預(yù)哮喘的病理生理機(jī)制而從根本上改變疾病的自然進(jìn)程。SIT可作為一種單獨的治療方法，但對于需要適度藥物治療的患者，聯(lián)合免疫治療可取得最大的益處［8］。而SIT由于治療周期長，起效慢，費用高，存在不良反應(yīng)風(fēng)險［9］，因此治療的普及和推廣受到限制。而聯(lián)合中醫(yī)藥治療，可與SIT取長補(bǔ)短，縮短起效時間，提高療效，減少不良反應(yīng)的發(fā)生率，但是其具體機(jī)理尚未明確。

本研究利用OVA誘導(dǎo)和激發(fā)復(fù)制哮喘小鼠模型，并給以SIT治療和中藥膏方聯(lián)合SIT治療。研究結(jié)果表明，SIT治療組和中藥膏方聯(lián)合SIT組均可使小鼠的BAFL的細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)下降，肺組織病理的炎癥浸潤情況較哮喘組輕，BAFL中IL-4下降，IFN-γ上升，提示SIT可能通過上調(diào)Th1細(xì)胞功能和下調(diào)Th2細(xì)胞功能的作用，從而調(diào)節(jié)了Th1/Th2的失衡，與之前的文獻(xiàn)報道符合［10-11］；而血清IgE方面，中藥膏方聯(lián)合SIT組低于單純SIT組，但是兩組在IL-4、IFN-γ差異上均無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)合病理結(jié)果，中藥膏方聯(lián)合SIT組在肺臟炎癥細(xì)胞浸潤程度較SIT組輕，提示中藥膏方可能通過其他途徑降低血清IgE水平，減輕局部炎癥細(xì)胞浸潤，而其機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。升氣壯陽膏方由白術(shù)、補(bǔ)骨脂、防風(fēng)、升麻、太子參、陳皮、石菖蒲、芒果核、續(xù)斷、甘草等藥物組成，其中補(bǔ)骨脂、續(xù)斷補(bǔ)腎助陽，白術(shù)、太子參健脾益氣，升麻可扶助提升陽氣，防風(fēng)可升脾之清陽，陳皮、芒果核、石菖蒲可理氣化濕，甘草調(diào)和諸藥，全方共奏溫腎健脾、升陽降濁之功［12］。

目前關(guān)于SIT治療的機(jī)制存在多種解釋，有研究指出［13］，SIT的主要作用機(jī)制就是誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）形成，IL-10、TGF-B產(chǎn)物增加，可誘導(dǎo)T調(diào)節(jié)性亞群和T細(xì)胞耐受現(xiàn)象。亦有研究者指出［14-15］，T細(xì)胞無能可能是哮喘SIT的作用機(jī)制之一；目前中藥膏方聯(lián)合SIT的研究較少［16-17］，但是其療效已經(jīng)在臨床上得到驗證，有必要開展進(jìn)一步研究探索其作用機(jī)制。

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The Effects of Shengqi Zhuangyang Medicinal Extract Combined with Specific Immunotherapy on Airway Inflammation of Mouse with Bronchial Asthma

JIANG Wenwen，ZHUANG Sen，LIAO Ruosha，et al. The Second School of Clinic Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong，Guangzhou 510405，China

Objective：To observe the effects of Shengqi Zhuangyang medicinal extract combined with specific immunotherapy on airway inflammation of mouse with bronchial asthma，and to explore its mechanism in treating asthma.Methods：Twenty BALB/c mice were randomly divided into the blank control group，the asthma group，the SIT group and the SIT+medicinal extract group.Asthma was induced by intraperitoneal injection of ovalbumin（OVA）and forced inhalation of atomized OVA.The numbers of the total inflammation cells and esoinophils（EOS）in BALF were counted by alveolar wash.IL-4，IFN-γin BALF and IgE in blood were analyzed by ELISA. Pathological changes of the lung tissues were observed by HE straining.Results：After the therapy，the lung inflammation was reduced，and the IgE level in blood was lowered，especially in the SIT+medicinal extract group，and the numbers of total cells and EOS decreased.IFN-γ level was raised and IL-4 level was lowered in BALF，which had no differences between the SIT group and the SIT+medicinal extract group.Conclusion：Shengqi Zhuangyang medicinal extract combined with specific immunotherapy can reduce the inflammation of lung and lower IgE level in blood

Medicinal extract；Asthma；Specific immunotherapy

R285.5

A

1004-745X（2015）08-1324-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.004

2015-04-11）

廣東省科技計劃項目（No.2012B031800190）；廣東省中醫(yī)院中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項資助（No.YK2013B2N18）

△通信作者（電子郵箱：chindhd2002444＠sina.com）