一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定金喉健噴霧劑中4種有效成分*

王儷甌，楊娟艷，茅向軍，楊微微，羅奕

一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定金喉健噴霧劑中4種有效成分*

王儷甌1，楊娟艷3，茅向軍2，楊微微1，羅奕1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；2.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴陽(yáng) 550004；3.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550002)

目的 建立一測(cè)多評(píng)法的方法學(xué)考察模式，驗(yàn)證其在金喉健噴霧劑中應(yīng)用的可行性和技術(shù)適應(yīng)性。方法 采用氣相色譜法，以萘為內(nèi)標(biāo)物，以薄荷腦為參照物，建立該成分與1，8-桉葉素，樟腦，龍腦的相對(duì)校正因子，并用該校正因子進(jìn)行4種有效成分的含量測(cè)定，實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)，同時(shí)采用對(duì)一測(cè)多評(píng)計(jì)算值與內(nèi)標(biāo)法實(shí)測(cè)值的進(jìn)行比較，以驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性。結(jié)果 所建立的校正因子重復(fù)性良好，10批產(chǎn)品中4個(gè)指標(biāo)成分的含量計(jì)算值與內(nèi)標(biāo)法實(shí)測(cè)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 一測(cè)多評(píng)法作為一種新的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法用于金喉健噴霧劑4種有效成分含量測(cè)定是可行的、準(zhǔn)確的。

金喉健噴霧劑；一測(cè)多評(píng)法；校正因子，相對(duì)；含量測(cè)定

金喉健噴霧劑是以苗藥為基礎(chǔ)制備而成的中藥復(fù)方制劑，處方由艾納香油、大果木姜子油、薄荷腦(menthol)、甘草酸單銨鹽組成。主要功效祛風(fēng)解毒、消腫止痛、清咽利喉，其中艾納香油和大果木姜子油中的1，8-桉葉素(1，8-cineole)，樟腦(camphor)，龍腦(borneol)均為活性藥理成分，原標(biāo)準(zhǔn)僅有以龍腦和薄荷腦的含量測(cè)定[1]。但是中藥多成分、多功效的作用特點(diǎn)決定著單一成分或指標(biāo)評(píng)價(jià)難以表達(dá)中藥的質(zhì)量，并由此提出多成分質(zhì)量控制的模式。為了客觀評(píng)價(jià)金喉健噴霧劑的質(zhì)量，筆者采用氣相色譜(gas chromatography，GC)法對(duì)兩種以原料藥的揮發(fā)油提取物投料的主藥成分同時(shí)進(jìn)行分離與檢測(cè)，測(cè)定1，8-桉葉素、樟腦、薄荷腦、龍腦4種有效成分含量，并且引入“一測(cè)多評(píng)”法[2]以薄荷腦對(duì)照品為指標(biāo)成分，建立1，8-桉葉素，樟腦，龍腦與薄荷腦的相對(duì)校正因子進(jìn)行含量測(cè)定。目前 “一測(cè)多評(píng)”法應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑較多使用的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測(cè)定[3-9]，GC法測(cè)定僅有一篇報(bào)道[10]。筆者采用GC法將“一測(cè)多評(píng)”的方法應(yīng)用于金喉健噴霧劑的質(zhì)量控制中，對(duì)不同品牌的色譜柱進(jìn)行考查，探討一測(cè)多評(píng)法在金喉健噴霧劑質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用的可行性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ailgent 7890N氣相色譜儀，Ailgent 7693自動(dòng)進(jìn)樣裝置，氫火焰化檢測(cè)器，XS205型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.01 mg)。

1.2 試藥 1，8-桉葉素對(duì)照品(批號(hào)：C004G005，含量99.0%)，樟腦對(duì)照品(批號(hào)：110747-201409，含量：98.7%)，薄荷腦對(duì)照品(批號(hào)：110728-200506，含量100.0%)，龍腦對(duì)照品(批號(hào)：110881-201107，含量：99.3%)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，含量≥98%；萘(湘中地質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究所)、無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)均為分析純，金喉健噴霧劑樣品由貴州宏宇藥業(yè)提供(批號(hào)：141019，141020，141021，141022，141042，141043，141044，141045，141047，141049)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣為氮?dú)猓魉伲?2 mL·min-1；氫氣40 mL·min-1；空氣400 mL·min-1，柱流量1 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度為220 ℃；火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector,FID)溫度240 ℃，分流進(jìn)樣，分流比為10：1；進(jìn)樣量1 μL；程序升溫：初始50 ℃，維持10 min，以3 ℃·min-1升至120 ℃，維持5 min；內(nèi)標(biāo)法。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取萘13.914 4 g，置50 mL量瓶，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，再精密量取5 mL至25 mL量瓶，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，制成濃度為2.783 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液

2.2.2 對(duì)照品溶液配制 精密稱取1.8-桉葉素17.24 mg，樟腦26.81 mg，薄荷腦124.5 mg，龍腦對(duì)照品72.8 mg，置于5 mL量瓶，加無(wú)水乙醇溶解并定容，制成濃度分別為1，8-桉葉素3.413 5 mg·mL-1，樟腦5.292 3 mg·mL-1，薄荷腦24.9 mg·mL-1，龍腦14.458 mg·mL-1的單一對(duì)照品溶液。

2.2.3 混合對(duì)照溶液配制 精密稱取1.8-桉葉素11.98 mg，樟腦14.10 mg，薄荷腦28.51 mg，龍腦對(duì)照品11.11 mg，置于10 mL量瓶，加無(wú)水乙醇溶解并定容，制成濃度分別為1，8-桉葉素1.186 mg·mL-1，樟腦1.392 mg·mL-1，薄荷腦2.85 mg·mL-1，龍腦1.103 mg·mL-1；各精密量取1 mL置于5 mL量瓶中，再精密加入上述內(nèi)標(biāo)溶液1 mL配制成濃度為1，8-桉葉素0.237 mg·mL-1，樟腦0.278 mg·mL-1，薄荷腦0.57 mg·mL-1，龍腦0.221 mg·mL-1，萘0.557 mg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.4 供試品的制備 精密量取金喉健噴霧劑2 mL，精密加入上述內(nèi)標(biāo)溶液1 mL置于5 mL量瓶，加無(wú)水乙醇至刻度即得。

2.2.5 陰性樣品的制備 按處方量制備缺艾納香油，大果木姜子油，薄荷腦的陰性供試品，再按供試品制備項(xiàng)下制備成陰性樣品。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 在“2.1“項(xiàng)色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀中，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各色譜峰分離度良好，陰性供試品溶液無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2“項(xiàng)下1，8-桉葉素對(duì)照品、樟腦對(duì)照品0.05，0.1，0.2，0.4，0.6 mL，薄荷腦、龍腦對(duì)照品0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL，分別置于5 mL量瓶中，分別精密加入上述內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，制成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別精密吸取系列對(duì)照品溶液1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的濃度比值為橫坐標(biāo)，峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程(表1)。結(jié)果表明1，8桉葉素、樟腦、薄荷腦、龍腦在各自相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均呈出良好的線性關(guān)系。

1.1，8-桉葉素；2.樟腦；3.薄荷腦；4.龍腦；5.萘

圖1 陰性樣品(A)對(duì)照品(B)和樣品(C)GC色譜圖

1.1,8-cineole;2.camphor;3.menthol;4.borneol;5.naphthalene

Fig.1 GC chromatogram of negative sample (A), control (B) and sample (C)

表1 4種成分的回歸方程和線性范圍

Tab.1 Regression equation and linear range of four ingredients

成分回歸方程r線性范圍/(mg·mL-1)1,8-桉葉素Y=1.4922X+0.00350.99980.034^0.410樟腦Y=1.439X-0.00030.99970.053^0.635薄荷腦Y=1.4085X+0.00330.99990.996^4.980龍腦Y=1.4587X-0.01390.99990.578^2.892

2.5 儀器精密度 取“2.2.4”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算各化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD，1，8-桉葉素、樟腦、薄荷腦、龍腦的RSD分別為0.31%，0.12%，0.08%，0.07%，表明儀器精密度結(jié)果良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在前述色譜條件下分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD，1，8-桉葉素，樟腦，薄荷腦，龍腦RSD值分別為0.96%，0.78%，0.77%，0.66%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)能保持穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品6份，分別按供試品制備方法制備供試品溶液，計(jì)算各化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD，1，8-桉葉素，樟腦，薄荷腦，龍腦RSD分別為1.01%，0.92%，0.95%，0.83%。表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密量取1 mL已知含量的同一批樣品9份，分別按已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%，100%，120% 3個(gè)水平加入1，8-桉葉素，樟腦，薄荷腦，龍腦對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果1，8-桉葉素、樟腦、薄荷腦、龍腦平均回收率分別為99.0%，99.0%，102.5%，100.6%，RSD分別為2.42%，0.84%，2.31%，2.91%。見(jiàn)表2。

2.11 校正因子重復(fù)性考察

2.11.1 不同色譜柱考察 精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液(n=4)，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣1 μL，在同一臺(tái)儀器上分別考察DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；Rtx R-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm，1 μm)；Elite-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)3種不同廠家色譜柱，計(jì)算各化合物校正因子。結(jié)果DB-WAX，Rtx R-WAX，Elite-WAX的1，8-桉葉素，樟腦，龍腦平均校正因子分別為0.871，0.94，0.95；0.882，0.958，0.951；0.860，0.930，0.974；RSD為1.26%，1.51%，1.42%。

表2 4成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Recovery results of four ingredients

2.11.2 待測(cè)組分色譜峰的定位 精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液(n=4)，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣1 μL，在同一臺(tái)儀器上考察上述3種色譜柱，利用薄荷腦的相對(duì)保留時(shí)間，利用待測(cè)成分對(duì)于薄荷腦保留時(shí)間差做為上述待測(cè)成分的定位指標(biāo)，結(jié)果DB-WAX，Rtx R-WAX，Elite-WAX 1，8-桉葉素，樟腦，龍腦保留時(shí)間差分別為21.82，6.88，2.13；22.95，6.67，2.28，22.91，6.87，2.10；RSD為2.84%，1.77%，4.40%。

2.13 樣品測(cè)定 取10批金喉健噴霧劑樣品，按前述所建立的方法分別測(cè)定樣品中1，8-桉葉素，樟腦，薄荷腦，龍腦的含量，采用內(nèi)標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算不同批次的4個(gè)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所建立的內(nèi)標(biāo)法測(cè)定與一測(cè)多評(píng)法的計(jì)算結(jié)果比較無(wú)明顯差異，表明一測(cè)多評(píng)法用于金喉健噴霧劑的多成分質(zhì)量控制是可行的。

表3 金喉健噴霧劑中4種有效成分含量測(cè)定結(jié)果

Tab.3 Results of content determination on four ingredients inJinhoujianspray

mg·mL-1，n=2

3 討論

根據(jù)樣品的性質(zhì)，供試品制備方法考察使用水蒸汽蒸餾法和揮發(fā)油提取法[11]，結(jié)果表明水蒸汽蒸餾法和揮發(fā)油提取法提取待測(cè)組分有所損失，揮發(fā)油提取法提取的供試品溶液和樣品直接上樣的結(jié)果沒(méi)有太大的區(qū)別，從節(jié)約樣品處理時(shí)間方面考慮，最終選擇直接使用樣品上樣。

系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)中，分別考察不同柱溫(40，50，70，80，100 ℃)及不同流速(1，2，1.0，0.8 mL·min-1)色譜分離情況，升溫程序考察恒溫和程序升溫，結(jié)果表明恒溫目標(biāo)峰出峰時(shí)間太長(zhǎng)且薄荷腦與龍腦的峰未得到分離，綜合考慮分離度和分析時(shí)間等因素，最終選擇程序升溫，分別考察10 ℃升至180 ℃，5 ℃升至150 ℃，4 ℃升至135 ℃，樟腦，薄荷腦，龍腦都未能與周圍雜質(zhì)峰分離，最終選擇柱溫50 ℃，保持10 min，2 ℃升至120 ℃升溫程序，保持5 min，柱流量1.0 mL·min-1，該色譜條件下4個(gè)有效成分均能達(dá)到基線分離，滿足含量測(cè)定的要求。

內(nèi)標(biāo)物選擇實(shí)驗(yàn)中，考察萘、正庚烷、環(huán)己酮和水楊酸甲酯等，因樣品中目標(biāo)峰周圍雜質(zhì)峰較多，結(jié)果選擇萘作為內(nèi)標(biāo)，因其出峰時(shí)間在目標(biāo)峰之后，且與待測(cè)組分的保留時(shí)間相近卻能完全分離，且峰周圍無(wú)干擾。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)目標(biāo)峰的定位除了目標(biāo)成分峰形判斷外，考察相對(duì)保留時(shí)間之比和保留時(shí)間差來(lái)定位，結(jié)果考察不同色譜柱的待測(cè)組分保留時(shí)間差RSD<5%，使用相對(duì)保留時(shí)間比定位時(shí)，1.8-桉葉素峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD>5%，所以最終選擇采用保留時(shí)間差指認(rèn)其他3個(gè)峰的位置。

選擇一測(cè)多評(píng)內(nèi)標(biāo)參照物時(shí)因薄荷腦對(duì)照品含量較高，價(jià)格較便宜且易得，故本實(shí)驗(yàn)選用薄荷腦為參照物，由于同時(shí)實(shí)現(xiàn)4種有效成分的多指標(biāo)含量測(cè)定所用的對(duì)照品的量較大，對(duì)照品所需費(fèi)用較高，所以本實(shí)驗(yàn)引入一測(cè)多評(píng)法于金喉健噴霧劑多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)證明一測(cè)多評(píng)所得成分含量的計(jì)算值與內(nèi)標(biāo)法實(shí)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明一測(cè)多評(píng)法可以應(yīng)用于金喉健噴霧劑多指標(biāo)的含量測(cè)定。

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Analysis of Four Effective Components in Jinhoujian Spray by Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker

WANG Liou1, YANG Juanyan3, MAO Xiangjun2, YANG Weiwei1, LUO Yi1

(1.CollegeofPharmacy,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,China；2.GuizhouProvincialFoodandDrugInspectionInstitute,Guiyang550004,China；3.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China)

Objective To establish a methodological study pattern of quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS), and examine its feasibility and technical applicability in the quality control of compound preparation of traditional Chinese medicine-Jinhoujianspray. Methods Gas chromatographic method (GC) was used and naphthalene served as the internal standard.Menthol was used as the reference substance.The relative correlation factors (RCF) of 1,8-Cineole, camphor and borneol to menthol were calculated and established to carry out QAMS.The accuracy of this method was confirmed by comparison of internal standard method. Results The reproducibility of relative correction factor was perfect.The two methods did not show significant difference in 10 bathes of samples. Conclusion The QAMS method is feasible, credible, and can be used to determine active ingredients inJinhoujianspray.

Jinhoujian spray；Quantitative analysis of multi-components with a single-marker；Correlation factors, relative；Content determination

2014-10-15

2015-01-12

*貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開(kāi)發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(黔科合中藥字[2012]5030)；貴陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(筑科合同[2012204]-1)

王儷甌(1989-)，女，貴州貴陽(yáng)人，碩士，主要從事藥品質(zhì)量研究。電話：(0)13985548353，E-mail：1195790708@qq.com。

茅向軍(1964-)，男，貴州貴陽(yáng)人，主任藥師，博士，主要從事藥品質(zhì)量研究。電話：(0)13368610577，E-mail：1074459931@qq.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)10-1356-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.025