熊果酸對慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠的治療作用

劉雁飛，韓盼，賴永繼

(武漢市中心醫(yī)院1.兒科；2.藥學(xué)部，武漢 430014)

熊果酸對慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠的治療作用

劉雁飛1，韓盼2，賴永繼2

(武漢市中心醫(yī)院1.兒科；2.藥學(xué)部，武漢 430014)

目的 探討熊果酸對角叉菜膠誘導(dǎo)的慢性非細(xì)菌性前列腺炎(CNP)大鼠的治療作用及其機(jī)制。方法 將42只斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、普適泰組、熊果酸大劑量組和小劑量組，除正常對照組外，其他組造CNP模型。普適泰組灌胃給予普適泰藥液148 mg·kg-1·d-1，熊果酸大劑量組和小劑量組分別灌胃給予熊果酸藥液100和50 mg·kg-1·d-1，正常對照組和模型對照組灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，連續(xù)給藥20 d。考察大鼠的前列腺指數(shù)，利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測大鼠血清中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)的水平，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色觀察前列腺組織的病理學(xué)變化。結(jié)果 與模型對照組比較，熊果酸大劑量組、小劑量組可顯著降低大鼠前列腺指數(shù)(P<0.05)，以及血液中細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-10的水平(P<0.05或P<0.01)。前列腺組織切片HE染色顯示熊果酸大劑量組對前列腺炎病理組織學(xué)改變有明顯的改善作用。結(jié)論 熊果酸對角叉菜膠誘導(dǎo)的慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠具有一定的治療作用，其機(jī)制可能與熊果酸對IL-1β、TNF-α和IL-10水平的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

熊果酸；前列腺炎，非細(xì)菌性，慢性；酶聯(lián)免疫吸附測定

熊果酸(ursonic acid，UA)是廣泛存在于天然植物中的一種三萜類成分，山楂、枇杷和山茱萸等均含有大量UA[1-3]。前期研究中，筆者在地梗鼠尾草全草中發(fā)現(xiàn)大量UA[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，UA可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤[5]、抗氧化[6]和鎮(zhèn)痛[7]作用，但UA作用于前列腺炎筆者未見報(bào)道。前列腺炎是泌尿外科最常見的疾病之一，流行病學(xué)研究表明其發(fā)病率約8.4%[8]。在前列腺炎患者中以慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis，CNP)患者最為多見[9]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠模型，利用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)檢測大鼠血清中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和IL-10的水平，以探討UA對CNP模型大鼠的治療作用及其可能機(jī)制。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠42只，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)，體質(zhì)量180 ～ 220 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：No.42000600000206，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0005。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，保持室溫(24±2)℃，相對濕度(55±10)%，每日給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)食物和飲水，12 h光照、12 h黑暗循環(huán)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)條例進(jìn)行。

1.2 試劑與藥物 普適泰片(商品名：舍尼通，規(guī)格：每片74 mg，批號(hào)：12082700，南京美瑞制藥有限公司)；IL-1β試劑盒(批號(hào)：R130507-007a)、TNF-α試劑盒(批號(hào)：R130507-102a)和IL-10試劑盒(批號(hào)：R130507-004a)均由武漢博士德生物工程有限公司提供；角叉菜膠(美國Sigma公司，批號(hào)：1408463v)。其他試劑均為分析純有機(jī)試劑。

1.3 藥材 地梗鼠尾草全草于2010年9月采于湖北省恩施市(北緯30.2°，東經(jīng)109.3°，海拔700 m)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院汪建平博士鑒定為唇形科鼠尾草屬植物地埂鼠尾草(Salviascapiformis)，植物標(biāo)本存放于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室(No.2010-0902)。

1.4 熊果酸的分離制備及實(shí)驗(yàn)藥物準(zhǔn)備 干燥的地埂鼠尾草27 kg經(jīng)機(jī)械粉碎成小段約1 cm，用丙酮(150 L)在室溫下冷浸提取3次，每次3 d，每次提取液減壓蒸干得到的浸膏，合并后得到總浸膏1 300 g。經(jīng)正、反相硅膠柱柱層析和重結(jié)晶得到純度>99.5% UA約40 g。將純化得到UA和陽性藥普適泰片分別混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，得到合適濃度實(shí)驗(yàn)藥物溶液備用。

1.5 動(dòng)物分組、造模與給藥 將42只雄性SD大鼠隨機(jī)分成正常對照組、模型對照組、普適泰組、熊果酸大劑量組和小劑量組，每組大鼠分別為8，10，8，8，8只。參照文獻(xiàn)[10]，在實(shí)驗(yàn)室條件下，對模型對照組、普適泰組、熊果酸大劑量組和小劑量組分別建立CNP模型。待實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)環(huán)境后，每只大鼠給予10%水合氯醛溶液350 mg·kg-1進(jìn)行麻醉，剪去毛發(fā)，擦拭碘酒，于無菌條件下沿腹部正中切開皮膚和肌層，用鑷子輕提膀胱和兩側(cè)精囊，暴露前列腺背葉；于前列腺左右兩側(cè)葉分別注入2%角叉菜膠注射液0.05 mL。注射完畢后，在縫合處涂抹少量青霉素，然后逐步縫合肌層和皮膚，放回鼠籠，自由飲食，用碘酒在手術(shù)傷口滅菌，每天2或3次直至傷口愈合。用同樣的實(shí)驗(yàn)方法對正常對照組中大鼠的前列腺兩側(cè)葉分別注入0.9%氯化鈉溶液0.05 mL。造模第8天開始給藥。普適泰組灌胃給予普適泰藥液148 mg·kg-1·d-1[11]，熊果酸大劑量組和小劑量組分別灌胃給予UA藥液100和50 mg·kg-1·d-1[12]。正常對照組和模型對照組灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。連續(xù)給藥20 d。

1.6 樣本采集 最后一次給藥后12 h內(nèi)，所有大鼠禁食不禁水。對所有大鼠稱定質(zhì)量并記錄后，摘眼球取血，在高速低溫離心機(jī)中以850×g離心10 min，取其上清液立刻凍存于-70 ℃的冰箱中，用于測定IL-1β、TNF-α和IL-10的水平。大鼠處死后，迅速剖腹，剔除粘連的結(jié)締組織和脂肪組織等，摘取前列腺組織的左右兩側(cè)葉，浸沒于0.9%氯化鈉溶液中清洗干凈，然后用吸水紙吸去表面0.9%氯化鈉溶液，稱量總濕重，用于計(jì)算前列腺指數(shù)。稱定質(zhì)量后的前列腺組織，一部分迅速浸潤在10%甲醛溶液中固定，用于病理學(xué)檢查。剩余部分的前列腺組織凍存于-70 ℃冰箱中以備用。

1.7 前列腺指數(shù)的測定 在一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，前列腺指數(shù)常常被用來檢測CNP的炎癥大小。通過記錄每只大鼠的自身體質(zhì)量及其前列腺組織的總濕重，即可得到相應(yīng)的前列腺指數(shù)。前列腺指數(shù)=前列腺組織總濕重/大鼠體質(zhì)量(單位：mg·g-1)。

1.8 大鼠血清中IL-1β，TNF-α和IL-10的含量測定 被凍存在-70 ℃冰箱中的大鼠血清，取出后，溫水浴中解凍后，迅速按照ELISA試劑盒說明方法進(jìn)行IL-1β，TNF-α和IL-10三種細(xì)胞因子的含量測定。

1.9 大鼠前列腺組織的病理學(xué)檢查 已通過10%甲醛溶液固定好的大鼠前列腺組織分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光鏡顯微鏡下觀察前列腺組織的病理切片并攝像，記錄前列腺組織的病理變化。

2 結(jié)果

2.1 前列腺指數(shù)測定 各組大鼠給藥期間體質(zhì)量和行為狀態(tài)均未見明顯差異，且無動(dòng)物死亡。由圖1可知，與正常對照組比較，模型對照組前列腺指數(shù)顯著增高，說明本實(shí)驗(yàn)CNP大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽涑晒?。與模型對照組比較，熊果酸大劑量組和小劑量組大鼠PI差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明UA在劑量為50和100 mg·kg-1·d-1時(shí)對CNP均有一定治療作用。

2.2 大鼠血清中IL-1β，TNF-α和IL-10含量測定 結(jié)果見表1。表1顯示，與正常對照組比較，其他組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-10水平均有不同程度升高。其中，模型對照組升高程度最顯著。與模型對照組比較，普適泰組和熊果酸大劑量組均呈下降趨勢(P<0.05)，但與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.普適泰組；D.熊果酸大劑量組；E.熊果酸小劑量組；與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05

圖1 5組大鼠前列腺指數(shù)測定值

A.normal control group；B.model control group；C.Pushitaigroup；D.ursolic acid high-dose group；E.ursolic acid low-dose group；Compared with normal control group，*1P<0.01；Compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

Fig.1 Prostate index (PI) of five groups of rats

2.3 大鼠前列腺組織病理檢查結(jié)果 見圖2。病理檢

查顯示，正常對照組前列腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)比較完整，前列腺腺腔排列緊密，較規(guī)則，腺腔血液充盈，腺腔與腺腔間少有炎癥細(xì)胞浸潤。模型對照組前列腺組織呈現(xiàn)嚴(yán)重病理變化，腺腔不規(guī)則，且呈現(xiàn)不同程度前列腺增生，間質(zhì)內(nèi)明顯可見大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫，充血嚴(yán)重。與模型對照組比較，普適泰組、熊果酸大劑量組、小劑量組前列腺組織均表現(xiàn)出不同程度改善。

3 討論

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與模型對照組比較，50和100 mg·kg-1·d-1UA均可顯著降低模型大鼠前列腺指數(shù)，對CNP有一定治療作用。細(xì)胞因子在CNP的發(fā)病機(jī)體中常常表現(xiàn)為不同程度的升高和降低[13]，大量的研究發(fā)現(xiàn)：促炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-1β在炎癥反應(yīng)中通過加氧酶加速前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)合成，由于PGE2具有較強(qiáng)的致炎作用，從而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。在機(jī)體自我免疫調(diào)解中，抗炎癥細(xì)胞因子如IL-10通過抑制促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，從而抑制炎癥細(xì)胞的黏附浸潤，促進(jìn)組織的修復(fù)再生[14]。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA試劑盒測定大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-10的水平，與模型對照組比較，熊果酸大劑量、小劑量組呈顯著性降低。該結(jié)果表明UA在發(fā)揮治療作用的過程中，可能通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而起到改善前列腺炎的炎癥狀況。前列腺組織切片顯示UA對前列腺炎病理組織具有明顯的改善作用，也證明以上結(jié)論。

表1 5組大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-10的水平

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05Compared with normal control group，*1P<0.01；Compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

A.正常對照組；B.模型對照組；C.普適泰組；D.熊果酸大劑量組；E.熊果酸小劑量組

A.normal control group；B.model control group；C.Pushitaigroup；D.ursolic acid high-dose group；E.ursolic acid low-dose group

Fig.2 Histopathological images of prostates in five groups of rats (HE，×100)

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2016年全國醫(yī)藥學(xué)術(shù)交流會(huì)暨

臨床藥學(xué)與藥學(xué)服務(wù)研究進(jìn)展培訓(xùn)班征文通知

隨著醫(yī)藥衛(wèi)生體制改革的不斷深入和發(fā)展，保障患者用藥安全、有效、經(jīng)濟(jì)、適當(dāng)，已經(jīng)成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。為促進(jìn)臨床醫(yī)師、藥師、護(hù)士間溝通與交流，提高合理用藥水平，經(jīng)中國藥理學(xué)會(huì)和《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》編輯部研究，決定于2016年5月下旬在成都市舉辦“2016年全國醫(yī)藥學(xué)術(shù)交流會(huì)暨臨床藥學(xué)與藥學(xué)服務(wù)研究進(jìn)展培訓(xùn)班”。會(huì)議主題：臨床藥學(xué)服務(wù)與藥物警戒實(shí)踐。會(huì)議由中國藥理學(xué)會(huì)主持，《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》編輯部承辦。屆時(shí)將邀請國內(nèi)著名專家、學(xué)者就會(huì)議主題作專題報(bào)告，并進(jìn)行學(xué)術(shù)交流和研討，凡參加會(huì)議的代表均可獲得國家繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育學(xué)分10分?，F(xiàn)將征文內(nèi)容及有關(guān)事項(xiàng)通知如下。

1 征文內(nèi)容

①藥物警戒制度的建立與實(shí)踐；②藥物相關(guān)問題與臨床藥學(xué)服務(wù)；③藥物配伍相容性與合理用藥；④藥物安全信號(hào)的發(fā)現(xiàn)與評價(jià)；⑤靜脈輸液用藥的安全及其規(guī)范建設(shè)；⑥上市后藥品有效性和安全性再評價(jià)；⑦用藥差錯(cuò)的表現(xiàn)與防范措施；⑧藥品不良反應(yīng)監(jiān)測與個(gè)案報(bào)道;⑨防止抗菌藥物濫用的對策與經(jīng)驗(yàn)介紹;⑩與會(huì)議主題相關(guān)的其他內(nèi)容。

2 征文要求

未公開發(fā)表的論文均可作為本次征文稿件，來稿全文在4 000字以內(nèi)(論文撰寫格式請參照《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》2015年第1期投稿須知或登陸《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》網(wǎng)站首頁查看)，綜述不超過5 000字。論文請通過《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》網(wǎng)站(www.yydbzz.com或者www.yydb.cn)在線投稿，并請?jiān)谡撐氖醉撚疑辖亲⒚鳌皶?huì)議征文”。與會(huì)代表提交的論文均將作為大會(huì)交流材料，若經(jīng)大會(huì)學(xué)術(shù)組研究同意，優(yōu)秀論文可作大會(huì)發(fā)言，請論文發(fā)言者預(yù)先制作Powerpoint課件并按時(shí)與會(huì)。征文經(jīng)有關(guān)專家審閱通過后，可在《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》(中國藥理學(xué)會(huì)主辦，國家科技部中國科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊正刊或增刊發(fā)表。征文截止時(shí)間：2016年3月30日。會(huì)議具體時(shí)間地點(diǎn)將另行通知。編輯部地址：武漢市解放大道1095號(hào)同濟(jì)醫(yī)院《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》編輯部，郵編：430030，電話：027-83643083，027-83666619(fax)，E-mail：yydbzz@163.com。

中國藥理學(xué)會(huì)

Effect of Ursolic Acid on Chronic Nonbacterial Prostatitis in Rats

LIU Yanfei1, HAN Pan2, LAI Yongji2

(1.DepartmentofPediatrics, 2.DepartmentofPharmacy,theCentralHospitalofWuhanCity,Wuhan430014,China)

Objective To investigate the therapeutic effect and mechanism of ursolic acid on carrageenan-induced chronic nonbacterial prostatitis (CNP) of SD rats. Methods Forty-two SD rats were randomly divided into five groups: normal control group, model control group,Pushitaigroup, ursolic acid high-dose group, and low-dose group.Except for normal control group, chronic nonbacterial prostatitis model was established using carrageenan.The rats ofPushitaigroup were treated with the solution ofPushitaiat the dose of 148 mg·kg-1·d-1for twenty days.The rats of ursolic acid high-dose and low-dose groups were administered with ursolic acid at the doses of 100 and 50 mg·kg-1·d-1for twenty days, respectively.The rats of normal and model control groups were treated with isometric 5% CMC-Na for twenty days.The prostate index (PI) was calculated from the ratio of isolated rat prostate weight and body weight of rat.The expressions of IL-1β, TNF-α, and IL-10 were detected by ELISA.The histology and morphology of the prostate was observed with the aid of hematoxylin-eosin staining. Results Compared with the model control group, PI and the levels of IL-1β, TNF-α, and IL-10 in serum were significantly decreased in ursolic acid high-dose,and low dose groups (P<0.05).Moreover, the pathological changes of prostate were improved significantly. Conclusion Ursolic acid has certain therapy effects on chronic nonbacterial prostatitis, which may be related to its regulating the expressions of IL-1β, TNF-α, and IL-10.

Ursolic acid；Prostatitis, nonbacterial, chronic；Enzyme-linked immuno-sorbent assay

2014-08-07

2014-11-18

劉雁飛 (1981-)，女，吉林白城人，醫(yī)師，碩士，主要從事兒科工作。電話：027-82201767，E-mail：blania_aifei@126.com。

賴永繼 (1986-)，男，河南駐馬店人，藥師，博士，主要從事天然藥物生物活性研究。電話：027-82201722，E-mail：laiyongji1024@163.com。

R965；R697.33

A

1004-0781(2015)10-1292-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.007