高效液相色譜法同時測定尿液中4種腎臟病常用藥物

李 靜, 郭展辰, 趙 旭, 馬玉花, 韓 萍, 封 順(新疆大學(xué), 石油天然氣精細(xì)化工教育部&新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 烏魯木齊 830046)

技術(shù)與應(yīng)用

高效液相色譜法同時測定尿液中4種腎臟病常用藥物

李 靜, 郭展辰, 趙 旭, 馬玉花, 韓 萍, 封 順*
(新疆大學(xué), 石油天然氣精細(xì)化工教育部&新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 烏魯木齊 830046)

建立了一種高效液相色譜同時測定尿液中4種腎臟病常用藥物依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米及纈沙坦含量的方法。色譜分離選用WondaSil C18-WR (150 mm×4.6 mm, 5 μm);以10.0 mmol/L乙酸銨溶液(pH 3.90)和乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,于254 nm波長下檢測,18 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了4種藥物的分離分析。結(jié)果表明依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米、纈沙坦分別在0.15～300 mg/L、0.05～100 mg/L、0.75～750 mg/L、0.05～100 mg/L范圍內(nèi)線性良好,檢出限依次為1.38×10-2、7.67×10-3、3.69×10-2、1.16×10-2mg/L,平均加標(biāo)回收率在89.49%～99.20%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)在4.12%～9.44%之間。結(jié)果表明該方法樣品處理簡便、快速,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,為腎臟病患者尿液中的治療藥物濃度監(jiān)測提供了一種新方法。

高效液相色譜法;依那普利;氨苯蝶啶;呋塞米;纈沙坦;尿液;腎臟病

腎臟病是一種代謝性疾病,近年來隨著人們生活水平的提高,其發(fā)病率也不斷上升。腎臟病后期會導(dǎo)致慢性腎功能衰竭,嚴(yán)重威脅著患者的生命。腎臟病患者需終身服藥,目前臨床治療中常用藥物主要有依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米、纈沙坦等。但是這4種藥物均具有一定的毒性,如依那普利在腎功能不全患者體內(nèi)容易蓄積,氨苯蝶啶服用過量較易發(fā)生高鉀血癥和腎損害,呋塞米過量會出現(xiàn)腎毒性,纈沙坦過量會出現(xiàn)低血壓伴隨頭暈等癥狀。因此在治療過程中需要嚴(yán)格控制劑量,以減少長期服用對人體健康產(chǎn)生的危害。

尿液是唯一能夠在無創(chuàng)條件下大量獲得的體液,在臨床診斷中相對穩(wěn)定,可在較長的時間內(nèi)不發(fā)生變化,因此近年來引起了人們越來越多的重視[1]。而這4種常用藥物中依那普利口服劑量的94%左右以依那普利或其降解產(chǎn)物依那普利拉存在于尿液中。氨苯蝶啶口服劑量約20%會以原形排出至尿液中?？诜蝗讜?8%以原形經(jīng)腎臟排泄,12%經(jīng)肝臟代謝由膽汁排泄。纈沙坦以原形藥物代謝,70%經(jīng)膽道排泄,其余通過腎臟排泄。上述4種藥物均可在尿液中找到其原形,且其含量與服藥劑量有著直接的聯(lián)系,因此可以通過監(jiān)測尿液中這4種藥物的含量,判定藥物用量是否合適,避免藥物過量服用。

目前這4種腎臟病常用藥物含量測定的方法有高效液相色譜法(HPLC)[2-5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6,7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-12]和紫外分光光度法[13-17]等,但上述報道多僅限于一種藥物的分離與分析,其原因是這4種藥物分子所含官能團(tuán)種類不同,酸堿性具有較大的不同,導(dǎo)致彼此間疏水性差異較大,對4種藥物同時分離與分析具有較大的困難。針對該問題,本文建立了一種高效液相色譜方法用于快速分離分析尿液中這4種腎臟病常用藥物,為臨床治療中根據(jù)個體情況確定用藥劑量提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜系統(tǒng),包括SPD-16紫外-可見檢測器和LC Solution工作站(島津公司)。離心濃縮系統(tǒng)(Speed Vac Concentrator Iss 110)。

馬來酸依那普利片(江蘇制藥股份有限公司);復(fù)方利血平氨苯蝶啶片(華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司);呋塞米片(江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司);纈沙坦膠囊(北京諾華制藥有限公司),其分子結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米和纈沙坦的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of enalapril, triamterene, furosemide and valsartan

乙酸銨(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司);乙腈(色譜純);高純水采自低有機(jī)物型超純水機(jī)(FDY2002-SUV,青島富勒姆科技有限公司);其他試劑均為分析純。所有試劑均直接使用,未經(jīng)其他處理。

1.2 色譜條件

色譜柱:WondaSil C18-WR(150 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相:A相為10.0 mmol/L的乙酸銨水溶液(pH 3.90), B相為乙腈;梯度洗脫:0～3.00 min, 5%B; 3.01～14.00 min, 5%B～60%B; 14.01～16.00 min, 60%B～80%B; 16.01～18.00 min, 80%B;流速:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣體積:20 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

首先采用C18固相萃取柱(WAT03590, 100 mg,沃特世科技有限公司)對市售依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米、纈沙坦進(jìn)行提純。提純后的藥品經(jīng)HPLC分析,以保證其純度。用10.0 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 3.90)準(zhǔn)確配成質(zhì)量濃度分別為3.00×102、1.00×102、7.50×102、1.00×102mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于冰箱冷藏保存,備用。分別用10.0 mmol/L乙酸銨水溶液逐級稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配制含依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米、纈沙坦質(zhì)量濃度0.15～300 mg/L、0.05～100 mg/L、0.75～750 mg/L、0.05～100 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品收集

于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院體檢中心采集樣本,共收集晨起尿樣3例,志愿者身體健康,一星期之內(nèi)未服用任何藥物,24 h內(nèi)未飲用含咖啡因的飲品。同時于住院部腎病科收集患者晨起尿樣1例。尿樣收集后,在2 h內(nèi)進(jìn)行處理,4 ℃下3 000g離心10 min,以除去固形物,上清液置于-80 ℃冰箱中保存,備用。

1.5 樣品前處理

尿樣在室溫下解凍,混合均勻,取200 μL上清液于1.5 mL具塞離心管中,加冷丙酮800 μL, 4 ℃靜置30 min, 12 000g離心15 min除去蛋白質(zhì),將上清液真空冷凍干燥,并用400 μL 10.0 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 3.90)復(fù)溶作為樣品溶液。用10.0 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 3.90)逐級稀釋10倍,過0.45 μm濾膜,備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

4種腎臟病常用藥物的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。其中依那普利結(jié)構(gòu)中有仲氨基、叔氨基和羧基,氨苯蝶啶中只有伯氨基和叔氨基,呋塞米中含伯氨基、仲氨基和羧基,而纈沙坦中含叔氨基和羧基,這說明4種藥物的疏水性差異較大;同時由于均含有堿性官能團(tuán)氨基,這會導(dǎo)致色譜峰形出現(xiàn)較為嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。為改善峰形,提高定量準(zhǔn)確性,參照文獻(xiàn)[18]所建議的色譜優(yōu)化過程,首先分別考察這4種藥物在不同類型緩沖鹽(pH 3.90的磷酸鹽和乙酸銨體系)、不同乙腈體積分?jǐn)?shù)(1%～80%)下的等度洗脫色譜行為,以保留時間、峰形等為指標(biāo),篩選出最佳緩沖鹽及其濃度和乙腈體積分?jǐn)?shù),然后再對梯度洗脫條件進(jìn)一步優(yōu)化,進(jìn)而篩選出最佳色譜條件(見1.2節(jié))。在此優(yōu)化色譜條件下,4種藥物的典型HPLC色譜圖列于圖2。

表1 4種藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L. LOD:S/N=3; LOQ:S/N=10.

2.2 線性范圍及檢出限

不同質(zhì)量濃度的4種藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化后的色譜條件下進(jìn)行分析(n=3),以質(zhì)量濃度-峰面積平均值作圖,制作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,以S/N=3確定檢出限,S/N=10確定定量限。由表1可以看出,4種藥物的線性擬合相關(guān)系數(shù)r均大于0.995,線性良好,可以用于準(zhǔn)確定量。同時檢測線性范圍達(dá)到4～5個數(shù)量級,適用濃度范圍廣。

圖2 (a)4種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、(b)加標(biāo)正常人尿樣和 (c)患者尿樣的HPLC典型色譜圖Fig.2 Typical HPLC chromatograms of (a) a standard mixture of the four drugs, (b) spiked urine sample and (c) a patient urine sample Conditions: WondaSil C18-WR (150 mm×4.6 mm, 5 μm); flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength, 254 nm; mobile phase A, 10 mmol/L CH3COONH4 solution (pH 3.90); B, CH3CN; gradient program: 0-3.00 min, 5%B; 3.01-14.00 min, 5%B-60%B; 14.01-16.00 min, 60%B-80%B; 16.01-18.00 min, 80%B.Peak identification: 1. enalapril; 2. triamterene; 3. furosemide; 4. valsartan.

2.3 回收率、精密度及尿樣測定

為驗(yàn)證方法的可靠性,首先對3例健康志愿者的尿液樣本采用1.5節(jié)的方法進(jìn)行處理,分別在上述3個尿樣中添加3個濃度水平的目標(biāo)物,并在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行分離分析,所得HPLC典型色譜圖見圖2b;對3個尿樣中同一藥物在同一加標(biāo)濃度水平的數(shù)據(jù)求平均值,并計算回收率和精密度。由表2可知依那普利的平均回收率為93.39%,氨苯蝶啶的平均回收率為99.20%,呋塞米的平均回收率為89.49%,纈沙坦的平均回收率為98.27%, RSD均小于10%,表明方法的重現(xiàn)性良好,所建立的方法可用于實(shí)際樣品中4種藥物的分離分析。

表2 4種藥物在尿樣中的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

*P<0.05.

2.4 實(shí)際患者尿樣的測定

在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院住院部腎病科隨機(jī)采集晨尿樣本1例,在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行分析,從圖2c中僅能觀察到纈沙坦的特征峰,說明該患者僅口服過纈沙坦,該結(jié)果與臨床醫(yī)囑一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的可靠性,對該例尿樣進(jìn)行加標(biāo)回收率測定,3次測定的平均加標(biāo)回收率為97.10%, RSD為2.33%,表明方法的重現(xiàn)性良好,所建立的方法可用于實(shí)際樣品中纈沙坦的分離分析。

3 結(jié)論

本文采用傳統(tǒng)的反相高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)了對尿液中4種疏水性差異較大,含有堿性官能團(tuán)的腎臟病常用藥物依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米及纈沙坦的同時分離。方法簡便,可靠,為監(jiān)測腎臟病患者尿液中常用藥物的濃度提供了一種快速檢測方法。

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Simultaneous determination of four drugs for kidney diseases in urine by high performance liquid chromatography

LI Jing, GUO Zhanchen, ZHAO Xu, MA Yuhua, HAN Ping, FENG Shun*

(KeyLaboratoryofOil&GasFineChemicals,MinistryofEducationandXinjiangUyghurAutonomousRegion,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was proposed for the simultaneous determination of four drugs for kidney disease, enalapril, triamterene, furosemide and valsartan. After proteins being removed by acetone precipitation method, freeze drying and redissolving in mobile phase, the urine samples were analyzed by HPLC. Chromatographic separation was performed on a WondaSil C18-WR (150 mm×4.6 mm, 5 μm) in gradient elution mode using 10.0 mmol/L ammonium acetate aqueous solution (pH 3.90) and acetonitrile as mobile phases at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm. Under the optimized conditions, good linearities were obtained in the range of 0.15-300 mg/L, 0.05-100 mg/L, 0.75-750 mg/L, 0.05-100 mg/L, and the detection limits were 1.38×10-2, 7.67×10-3, 3.69×10-2, 1.16×10-2mg/L for enalapril, triamterene, furosemide and valsartan, respectively. The recoveries were in the range of 89.49%-99.20% with the relative standard deviations (RSDs) among 4.12%-9.44%. The method is simple, accurate and effective, and the results showed the method is applicable for the analysis of the four drugs for kidney diseases in real urine samples.

high performance liquid chromatography (HPLC); enalapril; triamterene; furosemide; valsartan; urine; kidney disease

10.3724/SP.J.1123.2015.07022

新疆大學(xué)2014年國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目(201410755015).

2015-07-21

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1210-04

*通訊聯(lián)系人.Tel:(0991)8582087,E-mail:fengshunxd@hotmail.com.