抑制自嗜增強(qiáng)Salirasib誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞凋亡

王進(jìn)軍 劉建民 梁勇

Ras超家族是一類重要的功能蛋白。它們介導(dǎo)生長因子、細(xì)胞因子和多種細(xì)胞外信號(hào)的信息通路，對(duì)細(xì)胞生長、分化、存活、增殖等有重要作用。Ras通路的激活與人類很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，超過33%的腫瘤伴有Ras亞型（H，K，N）的突變[1]，因此，Ras蛋白常被作為腫瘤治療的靶向。Salirasib（FTS）是一種合成的Ras抑制劑，它能阻止Ras蛋白固著于膜上，降低了細(xì)胞中Ras的水平，進(jìn)而抑制了Ras依賴的細(xì)胞生長[2]。

自嗜，是細(xì)胞成分的自我消化過程，能夠維持蛋白合成及降解之間的平衡。自嗜對(duì)細(xì)胞的正常生長很重要。細(xì)胞在遭遇諸如缺氧、化療或放療等應(yīng)激時(shí)，會(huì)啟動(dòng)賴以生存的自嗜。

通過自嗜，細(xì)胞可以清除降解胞內(nèi)受損的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、衰老的細(xì)胞器以及不再需要的生物大分子等[3]。在消化的同時(shí)，自嗜也為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的重新構(gòu)建提供了原料，即細(xì)胞結(jié)構(gòu)的再循環(huán)。因此，作為應(yīng)激狀態(tài)下啟動(dòng)的生存機(jī)制，自嗜對(duì)細(xì)胞的存活起著關(guān)鍵作用。研究表明，自嗜參與了諸如胰腺癌、乳腺癌和肝癌等腫瘤疾病的進(jìn)程。然而，關(guān)于自噬在促進(jìn)生存和誘導(dǎo)死亡之間變化的具體分子機(jī)制尚不完全明確，可能與細(xì)胞代謝失衡有關(guān)[4]。氯喹通常作為抗瘧疾藥使用，研究顯示，氯喹可以通過阻止自嗜體與溶酶體的結(jié)合而終止自嗜[5]。

近年研究顯示，抑制自嗜可以作為腫瘤治療的一種新方法[6]。本研究中們檢測(cè)了氯喹聯(lián)合FTS對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，單獨(dú)FTS能誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞系MG 63和U 2-OS中自嗜的發(fā)生，并對(duì)細(xì)胞的生長起抑制作用。氯喹抑制自嗜后，能增強(qiáng)FTS對(duì)細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)Caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡。本研究表明，聯(lián)合治療較單藥效果更為突出。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞系來源 人骨肉瘤細(xì)胞系MG 63和U 2-OS購于中科院典藏細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 FTS和CQ購自Sigma-Aldrich，Anti-actin 購自MP Biomedicals,Anti-caspase 3和Antisurvivin 購自 Santa Cruz，Anti-LC 3 購自 Sigma-Aldrich。

1.2.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀（FCM，Becton Dickinson）、倒置相差顯微鏡(O L Y M P U S,I X 70-S 8F)、超凈臺(tái)(HERAEUS,HFSafe 1200)、CO2培養(yǎng)箱(HERAEUS)、恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Inc)、超純水裝置(MILLIPORE)、小型臺(tái)式離心機(jī)(SIGMA)、電子天平(TC 32 A)、低溫冰箱(Sanyo)、高速離心機(jī)(Biofμge HERAEUS)、核酸蛋白定量分光光度計(jì)（GeneQuant，美國Amersham公司）Western電泳設(shè)備（Bio-Rad）、熒光定量PCR 儀（ABI Prism 7000）、瓊脂糖膠電泳儀（Bio-Rad）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，放置在37℃，5%CO2孵箱中。測(cè)細(xì)胞活性時(shí)，將其與等量0.4%的臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，然后在顯微鏡下觀察。

1.3.2 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核提取物的制備 通過CelLytic TM和NuCLEAR TM試劑盒制備細(xì)胞提取物。先用無菌的PBS水洗滌細(xì)胞，吸凈PBS，將含有蛋白酶抑制劑的裂解液均勻滴在細(xì)胞上，放在冰上15 min后，用刮匙將細(xì)胞從培養(yǎng)皿刮下，收集混合液。然后高速離心15 min，收集上清液，于-20℃儲(chǔ)存。通過蛋白定量分析評(píng)估蛋白濃度，所得提取物用于Western blot分析。

1.3.3 Western印跡 制備12%的SDS-PAGE電泳凝膠后，將蛋白裂解液每個(gè)泳道上蛋白樣20 μg。然后，以80 V，90 min分離蛋白。之后，恒壓120 v進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，持續(xù)90 min。將PVDF膜于牛奶中封閉1 h，然后加入一抗結(jié)合PVDF膜，于4℃孵育過夜。第2天，將膜在室溫下?lián)u1 h，然后孵育二抗，1 h后用PBST洗膜3次。之后，通過標(biāo)準(zhǔn)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光發(fā)檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)。

1.3.4 Sub-G 1期的檢測(cè) 用無菌的PBS將經(jīng)過藥物處理的細(xì)胞清洗2遍，于0.1% Triton X-100環(huán)境孵育10 min，再次洗滌，之后再于25 mg/mL的碘化丙啶及1 μg/mL的RNase A中孵育15 min。通過FACScan流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析細(xì)胞熒光，檢測(cè)細(xì)胞Sub-G 1期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 10.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)計(jì)量資料采用“±s”表示；2組正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)的組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTS誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞系MG 63和U 2-OS中自嗜的發(fā)生為了確定FTS能否誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞系MG 63和U 2-OS中自嗜的發(fā)生，Western檢測(cè)了LC 3-II蛋白的表達(dá)水平。LC 3-II蛋白是自嗜發(fā)生的標(biāo)志蛋白。用不同特定濃度的FTS處理細(xì)胞一定時(shí)間，Western檢測(cè)LC 3-II蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，F(xiàn)TS在兩個(gè)細(xì)胞系中均誘導(dǎo)了自嗜的發(fā)生，且呈劑量依賴關(guān)系。見圖1。

圖1 FTS誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞系MG 63和U 2-OS中 LC 3-II蛋白的表達(dá)

2.2 氯喹對(duì)FTS誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞系MG 63和U 2-OS中自嗜的影響 確定了FTS可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞系MG 63和U 2-OS發(fā)生自嗜后，進(jìn)一步檢測(cè)氯喹對(duì) LC 3-II蛋白表達(dá)水平的影響。氯喹能通過抑制自嗜體和溶酶體的融合而抑制自嗜過程的進(jìn)展，因此會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) LC 3-II蛋白的積累。用特定濃度的FTS單藥或者聯(lián)合氯喹處理細(xì)胞。結(jié)果顯示，氯喹處理能明顯增加FTS誘導(dǎo)的 LC 3-II蛋白的積累。與單獨(dú)FTS處理相比，聯(lián)合治療明顯增強(qiáng)了 LC 3-II蛋白的水平。見圖2。

圖2 氯喹增強(qiáng)了骨肉瘤細(xì)胞系MG 63和U 2-OS中FTS誘導(dǎo)的自嗜

2.3 FTS聯(lián)合氯喹對(duì)細(xì)胞活性的影響 檢測(cè)單獨(dú)FTS及聯(lián)合氯喹治療對(duì)細(xì)胞活性的影響。分別用60um和50um的FTS單獨(dú)或聯(lián)合氯喹（4uM）處理骨肉瘤細(xì)胞系MG63和U2-OS一定時(shí)間。臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性。如圖3A和B所示，單獨(dú)FTS治療已明顯抑制了細(xì)胞的生長。在聯(lián)合氯喹的情況下，F(xiàn)TS的效果更加明顯。該結(jié)果表明，F(xiàn)TS可以抑制細(xì)胞生長，但其誘導(dǎo)的自嗜可能部分保護(hù)細(xì)胞，氯喹抑制自嗜可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。

圖3 氯喹增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞系MG 63和U 2-OS中FTS誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制

2.4 FTS聯(lián)合氯喹對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，在2個(gè)細(xì)胞系中，氯喹均增強(qiáng)了FTS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。圖4顯示，與單獨(dú)治療組相比，聯(lián)合治療使處于Sub-G 1期的細(xì)胞數(shù)明顯增多。因此，氯喹促進(jìn)了FTS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖4 與單獨(dú)治療組相比，聯(lián)合治療使處于Sub-G 1期的細(xì)胞數(shù)明顯增多

2.5 FTS聯(lián)合氯喹誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制 為了進(jìn)一步闡明FTS聯(lián)合氯喹誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，檢測(cè)了經(jīng)處理后細(xì)胞系中兩種重要凋亡蛋白的表達(dá)：caspase-3和survivin。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療明顯增強(qiáng)了Caspase-3的水平，減弱了survivin的表達(dá)。見圖5。因此，F(xiàn)TS聯(lián)合氯喹誘導(dǎo)了兩種細(xì)胞系中依賴Caspase-3的凋亡。

圖5 與單獨(dú)治療組相比，聯(lián)合治療明顯誘導(dǎo)了兩種細(xì)胞系中依賴caspase-3的凋亡

3 討論

本研究顯示，F(xiàn)TS能誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞系MG 63和U 2-OS中自嗜的發(fā)生，并對(duì)細(xì)胞的生長起抑制作用。氯喹抑制自嗜后，能顯著增強(qiáng)FTS對(duì)細(xì)胞的生長抑制及Caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡。

Ras通路是許多信號(hào)通路的交匯點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞活性起著調(diào)控作用[7]。作為一種Ras抑制劑，F(xiàn)TS能阻止Ras蛋白固著于膜上，降低了細(xì)胞中Ras的水平，進(jìn)而抑制了Ras依賴的細(xì)胞生長。然而，F(xiàn)TS在抑制細(xì)胞生長的同時(shí)，也誘導(dǎo)了自嗜的發(fā)生。自嗜是一種進(jìn)化高度保守的過程，是細(xì)胞內(nèi)的防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制[8]。通過自嗜，細(xì)胞可以消除和降解受損、變性、衰老及失去功能的細(xì)胞器、變性蛋白質(zhì)及核酸大分子等，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。有文獻(xiàn)認(rèn)為，自嗜的發(fā)生有助于促進(jìn)細(xì)胞的存活，但也有文獻(xiàn)表明，過度自嗜將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。還有研究表明，自嗜不僅有抑癌作用，在腫瘤的形成過程中自嗜也起作用[10]。

先前有研究表明，F(xiàn)TS誘導(dǎo)的自嗜在一定程度上對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，該結(jié)果提示我們可以研究FTS聯(lián)合自嗜抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞活性的影響。多年來，氯喹在臨床上一直被用于瘧疾的治療，其藥效安全，是理想的自嗜抑制劑。一些研究報(bào)道，氯喹還具有抗腫瘤的良好效果。總之，本研究表明FTS除了能抑制細(xì)胞生長外，還能誘導(dǎo)保護(hù)性的自嗜并激活凋亡通路，氯喹抑制自嗜將增強(qiáng)FTS誘導(dǎo)的凋亡，這為腫瘤治療提供了一種新的途徑。

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