莧菜活性物提取工藝及抑菌活性研究

夏日照 謝 燕 尹 維 張 亞 廖曉蘭

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）

莧菜活性物提取工藝及抑菌活性研究

夏日照 謝 燕 尹 維 張 亞 廖曉蘭*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）

以對柑橘潰瘍病菌抑制率為考察指標，采用乙酸乙酯浸提莧菜葉干粉，獲得莧菜活性物，通過正交試驗分別考察料液比、提取次數(shù)、提取時間對莧菜活性物提取效果的影響。結(jié)果表明：不同因素對莧菜活性物提取效果的影響程度不同，依次為料液比＞提取溫度＞提取時間；正交試驗優(yōu)化得到莧菜活性物最佳提取工藝參數(shù)為：料液比1∶5、提取溫度30 ℃、提取時間24 h，在此條件下莧菜活性物的抑制率為73.81%。紫外線、C源（蔗糖）和無機鹽離子（NaCl）的脅迫作用均對莧菜活性物抑菌活性影響不大；莧菜活性物有一定的耐熱性，溫度為80 ℃時抑制率仍可達49.41%。

莧菜活性物；正交試驗；提取工藝；抑菌活性

莧為莧科莧屬（Amaranthus L.）作物總稱，生長快、耐瘠、耐旱，種植地區(qū)分布全球，我國大部分地區(qū)都有栽培，按其栽培目的不同可分為粒用莧、菜用莧、飼用莧、觀賞莧等，Teutonico與 Knorr等學(xué)者把莧鑒定為主要是菜用型，認為所有莧屬物種的葉子均能食用，因此習(xí)慣上把莧統(tǒng)稱為莧菜（肖深根 等，2000）。目前莧菜（Amaranthus tricolor）的開發(fā)利用涉及食用（Silva-Sanchez et al.，2008）、工業(yè)（王寧 等，2009）、觀賞（汪勁武，1996）、飼用（武之新和徐玉鵬，1997）以及醫(yī)用（Mendonca et al.，2009；Zeashan et al.，2009） 等方面，有關(guān)莧菜在農(nóng)業(yè)植物病害防治方面的研究鮮見報道，僅有Lyapkova等（2001）研究發(fā)現(xiàn)莧菜種子含有抗真菌多肽，可抑制部分植物病原真菌；Abd Aziz等（2011）研究發(fā)現(xiàn)莧菜葉片中提取的蛋白質(zhì)對黃瓜花葉病毒（CMV）具有顯著的抑制作用。筆者在研究過程中發(fā)現(xiàn)莧菜活性物對柑橘潰瘍病菌（X. axonopodis pv. citri）、水稻細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）、西瓜細菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli）、煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）以及歐式桿菌（Erwinia carotovora）等常見植物病原細菌有極好的室內(nèi)平板抑制效果，其中對柑橘潰瘍病菌的離體試驗結(jié)果表明莧菜活性物在防治植物細菌性病害方面有巨大的潛力（尹維，2014）。

本研究在前期試驗的基礎(chǔ)上，為獲得大量穩(wěn)定的莧菜活性物，采用正交試驗對莧菜活性物提取工藝進行優(yōu)化和完善，并對其穩(wěn)定性進行了初步探究，以期為莧菜活性物進一步開發(fā)為新型生防制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2014年7～9月在植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室進行。供試莧菜由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)瀏陽科研基地提供，選取株高為18～23 cm的圓葉紅莧菜，取葉片洗凈、曬干，高速粉碎機粉碎，過60目篩，陰涼處保存?zhèn)溆?。試驗指示菌為柑橘潰瘍病菌，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實驗室提供，鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序比對（表1）。

表1 柑橘潰瘍病菌測序結(jié)果

供試培養(yǎng)基為蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g、蛋白胨5.0 g、磷酸氫二鉀0.5 g、結(jié)晶硫酸鎂0.25 g、瓊脂24.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0～7.2。

1.2 菌懸液制備及抑菌活性測定

柑橘潰瘍病菌菌懸液制備：挑取活化培養(yǎng)24 h的標準菌落，加入無菌水，比對麥式比濁管，調(diào)整菌懸液濃度為3×108cfu·mL-1。

抑菌活性測定：采用抑菌圈法（孫長霞 等，2012），在蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基表面接種200 μL菌懸液并涂布均勻，取已滅菌的打孔器（Φ=7 mm）在培養(yǎng)皿中心打取小孔，分別注入莧菜活性物150 μL，設(shè)相應(yīng)空白對照，重復(fù)2次；26～28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.3 莧菜活性物制備

稱取40.0 g莧菜葉干粉，按料液比1∶20加入乙酸乙酯（分析純，下同），常溫振蕩提取24 h，收集上清液；40 ℃旋蒸至膏狀物，80 mL無水乙醇（分析純，下同）溶解定容，冷藏備用。

1.4 莧菜活性物提取純化工藝優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）3個因素對莧菜活性物提取工藝進一步優(yōu)化，采用L9（34）正交表進行試驗（表2），以確定最佳提取條件。

稱取莧菜葉干粉20.0 g，放入1 000 mL錐形瓶中，按設(shè)計的料液比（加入乙酸乙酯）、溫度和時間進行提取。

將上述處理液在搖床上常溫振蕩提取24 h，重復(fù)1次，收集上清液；40 ℃減壓旋蒸至膏狀物，40 mL無水乙醇溶解定容，抑菌活性測定方法同1.2。

1.5 莧菜活性物的穩(wěn)定性

1.5.1 溫度處理 取冷藏的莧菜活性物6份，分別在50、60、70、80、90、100 ℃條件下水浴處理20 min，以未處理莧菜活性物為對照，抑菌活性測定方法同1.2。

1.5.2 紫外線照射處理 取冷藏的莧菜活性物6份，分別用紫外燈照射處理5、15、30、60、120 min，以未處理莧菜活性物為對照，抑菌活性測定方法同1.2。

1.5.3 C源和無機鹽離子脅迫作用 取冷藏的莧菜活性物10份，分別按體積比2∶1與濃度為10%、20%、30%、40%、50%的蔗糖溶液和濃度為5%、10%、15%、20%、25%的NaCl溶液混合，配制成含不同濃度糖和NaCl的混合液，以未處理莧菜活性物為對照，抑菌活性測定方法同1.2。

1.6 數(shù)據(jù)處理

活性物濃度（g·mL-1）=膏狀物質(zhì)量/定容有機溶劑

采用DPS、Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理，運用Duncan’s新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莧菜活性物提取工藝優(yōu)化

由表2極差分析可知，RB＞RA＞RC，即各因素對莧菜活性物提取效果的影響程度依次為料液比＞提取溫度＞提取時間。在本試驗設(shè)計范圍內(nèi)，莧菜活性物的最佳提取條件為B1A1C3，即當料液比為1∶5、提取溫度為30 ℃、提取時間為24 h時莧菜活性物抑菌效果最佳。按B1A1C3條件進行3次平行試驗，抑菌圈直徑達到46.53 mm，抑制率為73.81%，高于表3中任意一組試驗結(jié)果，故B1A1C3為莧菜活性物最優(yōu)提取條件。

表2 莧菜活性物提取工藝優(yōu)化的L9（34）正交試驗結(jié)果

2.2 溫度對莧菜活性物抑菌活性的影響

如圖1所示，當溫度為50～80 ℃時，莧菜活性物抑菌活性基本沒有變化，抑制率維持在50%左右；當溫度超過80 ℃時，抑菌活性明顯開始下降；當溫度達到100 ℃時，基本喪失了抑菌活性，抑制率僅為19.12%。這表明莧菜活性物在一定溫度范圍內(nèi)具有較好的熱穩(wěn)定性，但過高的溫度會破壞活性物結(jié)構(gòu)，從而使其失活，降低抑菌活性。

圖1 不同溫度對莧菜活性物抑菌活性的影響

2.3 紫外線對莧菜活性物抑菌活性的影響

如圖2所示，紫外燈照射處理時間對莧菜活性物抑菌活性影響不大，抑制率基本維持在55%左右。由此可見，莧菜活性物分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，活性基團不易被破壞，對紫外光具有極高的穩(wěn)定性。

圖2 不同紫外線照射時間對莧菜活性物抑菌活性的影響

2.4 C源和無機鹽離子對莧菜活性物抑菌活性的影響

如圖3、4所示，隨著蔗糖和NaCl濃度的增加，莧菜活性物的抑制率變化不明顯，維持在48%左右。表明莧菜活性物本身具有較好的抑菌作用，無機鹽離子（NaCl）、C源（蔗糖）對莧菜活性物的脅迫作用不明顯。

圖3 不同蔗糖濃度對莧菜活性物抑菌活性的影響

圖4 不同NaCl濃度對莧菜活性物抑菌活性的影響

3 結(jié)論與討論

L9（34）正交試驗結(jié)果表明，莧菜活性物最佳提取工藝為料液比1∶5、提取溫度30 ℃、提取時間24 h，對柑橘潰瘍病菌的抑制率為73.81%。但是在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，隨著提取莧菜干粉質(zhì)量的增加，該工藝組合往往不能達到預(yù)期的提取效果。這可能是因為1∶5的料液比太小，無法充分溶解莧菜干粉和振蕩，在造成試驗材料消耗的同時，影響了結(jié)果的精確性、穩(wěn)定性，不利于莧菜活性物的大量提取。當料液比1∶20、溫度30 ℃、提取時間24 h（B3A1C3）時，與理論最優(yōu)條件B1A1C3的抑制率差別不大（B3A1C3為71.13%，B1A1C3為73.81%），而且二者所用乙酸乙酯的回收率也都達到了90%以上。這解決了試驗過程中因溶劑較少而降低提取效率的問題，同時也邁出了莧菜活性物由試驗提取走向生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵一步，為莧菜活性物的工業(yè)化大規(guī)模提取，實現(xiàn)活性成分的分離合成提供了技術(shù)可能。

植物源活性成分種類繁多，穩(wěn)定性不一，其活性會因光照、紫外線、溫度以及金屬鹽離子等因素而受到破壞（吳傳萬 等，2004）。莧菜是一種功能性蔬菜，富含紅色素、花色苷色素、酚類、蛋白質(zhì)、黃酮類、角烯鯊等活性成分。紅色素主要以溶劑浸提和超聲波萃取為主（呂玉珍 等，2010；陳曉光 等，2012；曾慶祝 等，2012；張瑞 等，2013）；植物甾醇和三萜類皂苷合成先導(dǎo)物角鯊烯的提取方法也有研究（岳才軍 等，2010）；至于黃酮類、蛋白質(zhì)等常見植物源活性成分更是有完整的提取工藝（李啟照，2013；林燕茹和張曉芝，2013）。本試驗提取的莧菜活性物穩(wěn)定性好，在紫外線、C源和無機鹽離子的脅迫下抑菌活性基本保持不變；耐熱性好，80 ℃時對柑橘潰瘍病菌的抑制率仍有49.41%。這說明莧菜中可能含有與目前已發(fā)現(xiàn)提取的活性物不同的活性成分，且性質(zhì)穩(wěn)定，能滿足田間復(fù)雜環(huán)境的要求，有利于推動莧菜活性物從實驗室向大田應(yīng)用的轉(zhuǎn)變。因此，純化和了解其活性成分，不僅對了解莧菜活性物的抑菌機制有重要意義，而且對莧菜活性物的開發(fā)利用等都有重要的理論參考和實用價值。

莧科植物種類繁多，總計60屬約850種，多以草本或灌木為主，其中莧屬是莧科植物重要的一科，該屬有反枝莧（Amaranthus retroflexus）、籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus L.）、刺莧（Amaranthus spinosus）、 尾 穗 莧（Amaranthus caudatus L. ）、綠穗莧（Amaranthus hybridus L. ）等40余種。隨著科技進步，莧科植物在農(nóng)用和藥用方面的價值逐漸受到人們關(guān)注。Lina和Manuel（2007）從籽粒莧中分離出一種抗真菌肽，對白色念珠菌（Candida albicans）、褐黃曲霉（Aspergillus ochraceus）等真菌表現(xiàn)出極佳的抑制作用；綠穗莧和尾穗莧對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等細菌也表現(xiàn)出顯著的抑菌活性（Maiyo et al.，2010）；作為重要外來入侵生物的反枝莧也在植物化感作用和改善植物根際土壤方面表現(xiàn)出促進作用（Zhang & Mu，2008；龔振平 等，2010）。上述報道均表明了莧菜中是含有抑菌活性物的，且可以利用一定提取方法進行有效提取。這與本試驗結(jié)果是一致的，為進一步挖掘莧菜及其他莧科植物作為植物源農(nóng)藥新材料和探究莧菜活性物具體結(jié)構(gòu)提供了科學(xué)依據(jù)。

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“什么是今天該有的男性氣質(zhì)”,《人民日報》評論員如是發(fā)問。是傳統(tǒng)意義上的“金戈鐵馬”的豪情壯志,亦或是大行其道的“桃面柔膝”？而依我之見，正氣凜然，剛健勇毅的精神風(fēng)貌，方才是今日中國男兒所應(yīng)該追求的。

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Extraction and Antibacterial Activity of Actives Sub

XIA Ri-zhao，XIE Yan，YIN Wei，ZHANG Ya，LIAO Xiao-lan*
（Hunan Key Lab. Biol & Ctrl of Plant Dis & Pests，College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Took inhibition ratio of citrus cankor pathogen as investigation target，lixivite dry powder of Amaranthus leaf blades with ethyl acetate and gained Amaranthus tricolor actives．Examined the effect of solidliquid ratio，extraction temperature，and extraction time of Amaranthus tricolor actives by orthogonal experiment．The results indicated that different factors had different degree effects on extraction efficiency．Three extraction parameters were ranked in descending order of their effect on extraction of Amaranthus tricolor actives as follows solid-liquid ratio＞extraction temperature＞extraction time．Their optimal levels were 1∶5，30 ℃，24 h，respectively．Under these conditions，the inhibition rate was 73.81%．Ultraviolet radiation，C source（sucrose）and inorganic ion（NaCl） stress had little effects on Amaranthus tricolor actives stability．It posses certain heat tolerance，its inhibition rate was still up to 49.41%，when the temperature was 80 ℃．

Amaranthus tricolor active；Extraction technology；Antibacterial activity

夏日照，男，碩士研究生，專業(yè)方向：植物病害生物防治，E-mail：908302479@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：廖曉蘭，女，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：生防資源的挖掘與利用，E-mail：liaoxl88@126.com

2015-01-07；接受日期：2015-04-05