蔬菜土傳病害生防木霉菌株資源的篩選及其防治效果評價

（農(nóng)業(yè)部蔬菜遺傳改良重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

蔬菜土傳病害生防木霉菌株資源的篩選及其防治效果評價

朱萍萍 凌 健 席亞東 陳國華 茆振川 楊宇紅*謝丙炎

（農(nóng)業(yè)部蔬菜遺傳改良重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

采用平板對峙接種法和溫室盆栽試驗，測定18種木霉共175個菌株對黃瓜枯萎病菌、辣椒疫霉病菌和番茄青枯病菌3種不同類型的蔬菜土傳病害病原菌的防效，篩選生防木霉資源。試驗結(jié)果表明：拮抗試驗中，拮抗黃瓜枯萎病菌的木霉菌株有50株，抑制率達70.0%～86.3%；拮抗辣椒疫霉病菌的木霉菌株43株，抑制率達70.4%～88.7%。盆栽試驗中，篩選出番茄青枯病的生防菌株32株，防效達50.0%～92.7%。進一步對在拮抗試驗中對黃瓜枯萎病菌抑制率達75%以上的其中13株木霉菌進行盆栽防效評價，獲得防效超過60%的高效菌株2株，分別為T52（深綠木霉）和32080（平菇木霉）。

木霉；黃瓜枯萎病菌；辣椒疫霉病菌；番茄青枯病菌；生物防治

木霉作為一類重要的生防菌，其生境廣、環(huán)境適應(yīng)能力強，在幾乎所有溫度的自然土壤中均有存在，在朽木、樹皮及其他真菌中（Kubicek et al．，2008）、甚至在昆蟲體內(nèi)（Yoder et al．，2008）、海洋中（Gal-Hemed et al．，2011）均能分離到木霉菌株。木霉生長繁殖速度快，種群資源豐富，對植物有良好的促生或生防作用，是目前研究、應(yīng)用最多的生防菌之一。

特定種類的木霉不僅能顯著促進植物的生長發(fā) 育（Chang et al．，1986；Yedidia et al．，2001；Vinale et al．，2008），還能直接拮抗植物病原微生物，或通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性及局部抗性等發(fā)揮生防作用（Hermosa et al．，2012），如朱廷恒等（2004）研究發(fā)現(xiàn)木霉菌株T97可通過競爭和重寄生對多種植物病原真菌產(chǎn)生較強的拮抗作用；Shoresh等（2005）的研究結(jié)果顯示棘孢木霉菌株T203參與誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的茉莉酸或水楊酸途徑；Moran-Diez等（2009）研究表明哈茨木霉菌株T34能通過分泌多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)擬南芥（Arabidopsis）產(chǎn)生類似系統(tǒng)抗性的反應(yīng)；Mastouri等（2012）報道哈茨木霉菌株T22處理番茄種子，可通過誘導(dǎo)葉綠體內(nèi)超氧化物歧化酶基因表達，整株植物體內(nèi)該酶活性顯著提升，增強幼苗活力，減輕冷、熱及鹽等脅迫對植株的影響，從而促進番茄生長。因此，采用木霉生防植物病原菌，不僅可以顯著減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，而且能通過促進植物生長等增強植物應(yīng)對生物、非生物因素脅迫的能力（Moran-Diez et al．，2009；Hermosa et al．，2012），進而解決化學(xué)肥料、農(nóng)藥等帶來的一系列生態(tài)環(huán)境問題。雖然木霉資源豐富，但已知高效、穩(wěn)定的生防菌株資源仍然十分匱乏。為尋找能有效控制蔬菜主要土傳病害的木霉資源，本文以前期工作獲得的175株木霉菌株為原始材料，采用平板對峙及溫室盆栽防治的方法篩選對黃瓜枯萎病菌、辣椒疫霉病菌及番茄青枯病菌3種土傳病害病原菌具有拮抗或防治活性的木霉菌株，旨在為蔬菜土傳病害的生物防治提供新的菌株資源和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試木霉菌株共175株，包括18個種，主要為哈茨木霉（表1），由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)、湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院、河北科技師范學(xué)院、山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所7個單位提供。

供試致病菌株分別為Fuw-BN-7（黃瓜枯萎病菌，F(xiàn)usarium oxysporum f. sp. cucumebrium Owen）、Phy-01（辣椒疫霉病菌，Phytophthora capsici）、RS-60（番茄青枯病菌，Ralstonia solanacearum），由本所病害課題組分離純化保存。

表1 供試木霉菌及其拉丁名

1.2 供試作物

供試黃瓜品種為中農(nóng)6號，番茄品種為麗春，均購自中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司。

1.3 拮抗效果測定

2014年4月，參考肖淑芹等（2011）的平板對峙接種方法，測定175株木霉對黃瓜枯萎病菌、辣椒疫霉病菌的拮抗效果。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)3個平板。28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)5 d后，分別測量木霉處理及對照種內(nèi)病原菌的菌落直徑，記錄菌落生長狀況，計算抑制率。

抑制率（%）=（對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/（對照病原菌菌落直徑）×100%

1.4 溫室盆栽防效測定

1.4.1 木霉菌對番茄青枯病盆栽防效測定 將在PDA平板上28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d的木霉菌用攪拌機攪碎，每皿加水400 mL，制成木霉菌液，于2014年4月番茄幼苗3～4葉期澆灌于植株根部，每株灌菌液30 mL；待木霉菌在土中定殖7 d后采用傷根灌注法接種番茄青枯病菌，接種濃度為1×107cfu·mL-1，接種時用刀片劃傷根部后每株用20 mL菌液灌根。以澆灌清水和硫酸鏈霉素800倍液分別作陰性對照（CK-）和陽性對照（CK+）。

1.4.2 木霉菌對黃瓜枯萎病盆栽防效測定 選擇對黃瓜枯萎病菌平板拮抗效果達75%以上的其中13株木霉菌，進一步測定其溫室盆栽防治黃瓜枯萎病的效果。具體方法：2014年5月將在PDA平板上28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d的木霉菌用攪拌機攪碎，每皿加水400 mL，制成木霉菌液，每盆育苗土接種2皿木霉菌攪碎后的菌液并混合均勻，置室溫下保濕培養(yǎng)7 d后，將黃瓜枯萎病菌采用胚根接種法接種（翁祖信 等，1985），接種后直接播于該育苗土上，以未經(jīng)木霉處理的育苗土作空白對照。

盆栽試驗每處理3次重復(fù)，每重復(fù)10株幼苗。待空白對照嚴重發(fā)病時，調(diào)查各處理病株率或病級數(shù)（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2010），并計算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×相對應(yīng)級別數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）×100

防治效果（%）=〔對照病情指數(shù)（或病株率）-處理病情指數(shù)（或病株率）〕/對照病情指數(shù)（或病株率）× 100%

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉對黃瓜枯萎病菌的拮抗效果

供試的175株木霉菌對黃瓜枯萎病菌均有一定的拮抗作用，拮抗效果為39.1%～86.3%。其中，抑菌率達50%以上的木霉菌株有170株；抑菌率超過70%的木霉菌株50株（表2），包含13個種，主要為哈茨木霉、長枝木霉及T. asperelloides；抑菌率達80%的木霉菌株4株，分別為長枝木霉2株（T29、T60），綠木霉1株（T47），深綠木霉1株（T52）。木霉菌在PDA平板上對黃瓜枯萎病菌的拮抗效果主要表現(xiàn)為競爭作用和重寄生作用（圖1），以競爭作用為主，占供測菌株的87.1%，包括所有參試木霉種。

表2 部分木霉菌對黃瓜枯萎病菌的拮抗效果

圖1 部分木霉菌對黃瓜枯萎病菌（平板上方）的拮抗效果

2.2 木霉對辣椒疫霉病菌的拮抗效果

參試木霉菌株對辣椒疫霉病菌的抑菌率為36.0%～88.7%，均表現(xiàn)一定的拮抗作用，且91.8%的參試木霉菌株的抑菌率在50%～80%。其中，抑菌率在70%以上的菌株有43株 （表3），包含7個種，主要為哈茨木霉、長枝木霉及T. asperelloides；抑菌率超過80%的菌株10株，分別為哈茨木霉4株（T152、T175、Shi-8-9、mc-2），長枝木霉2株（T29、T127），T. asperelloides 2株（T33、30437），檸檬綠木霉1株（T169），平菇木霉1株（32080）。木霉菌株拮抗辣椒疫霉病菌的機制主要為競爭和重寄生（圖2），其中具有競爭作用的菌株94株，包括所有的參試木霉種。

2.3 木霉對黃瓜枯萎病的盆栽防效

對平板拮抗試驗中對黃瓜枯萎病菌抑菌效果達75%以上的其中13株木霉菌株進行盆栽防效測定，發(fā)現(xiàn)供測木霉對黃瓜種子的出苗率、植株生長均無不利影響，但總體防效不高，絕大部分木霉菌株的盆栽防效在40%以下，遠低于離體拮抗效果（圖3），僅篩選出防效超過60%的木霉菌株2株，即T52（深綠木霉）和32080（平菇木霉），防效分別為72.0%和60.1%。

表3 部分木霉菌對辣椒疫霉病菌的拮抗效果

圖2 部分木霉菌對辣椒疫霉病菌（平板下方）的拮抗效果

2.4 木霉對番茄青枯病的盆栽防效

木霉盆栽防治番茄青枯病的測定結(jié)果表明，絕大多數(shù)木霉菌株對番茄青枯病盆栽防治效果不佳，一些木霉菌甚至加重青枯病的發(fā)生。在參試的175株木霉菌株中，防治青枯病效果達50%以上的木霉菌株有32株（表4），包含11個種，哈茨木霉菌株占46.9%；其中，防效接近或超過對照藥劑硫酸鏈霉素（69.2%）的木霉菌株20株，分別屬于9個種；防治效果達到80%以上的菌株4株，分別為T87（微孢木霉）、T173（哈茨木霉）、Shi-1-10（T. asperelloides）和18-8（棘孢木霉）。

圖3 木霉菌對黃瓜枯萎病菌的平板拮抗作用和盆栽防治效果

表4 部分木霉菌對番茄青枯病的盆栽防效

3 結(jié)論與討論

本試驗中供試175株木霉菌株包含18個種，種質(zhì)資源豐富，且來源于全國多個省份農(nóng)作物種植區(qū)的土壤、腐朽的木頭及死亡線蟲蟲體等，已有研究表明部分菌株具有促進植物生長、生防蔬菜病原線蟲的潛力（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。相對于目前主要的生防木霉種哈茨木霉、長枝木霉、鉤狀木霉和綠色木霉等，本試驗擴大了木霉種類的篩選范圍，發(fā)現(xiàn)一些研究甚少的木霉種類對蔬菜土傳病害具有較好的生防潛力。如T. asperelloides是近幾年才與棘孢木霉在種水平上區(qū)分開的一種新的木霉種，目前對其生防潛力的研究甚少。本試驗通過對11株T. asperelloides生防3種主要蔬菜土傳病害病原菌的初步研究，篩選出針對不同病害有生防效果的菌株，為進一步深入研究該種和挖掘新的生防木霉資源提供了科學(xué)依據(jù)。

哈茨木霉、長枝木霉及T. asperelloides為平板對峙試驗中篩選出生防菌株最多的3個種，且對黃瓜枯萎病菌的最高平板抑制率均超過75%，而對辣椒疫霉病菌則高達80%以上，為極具生防潛力的木霉種類，因此，在木霉生防菌株篩選時需要引起重視。

木霉菌株生防黃瓜枯萎病的平板對峙和溫室盆栽試驗結(jié)果表明，木霉菌株對該病菌的拮抗作用并不與盆栽防效成正相關(guān)。這可能是因為木霉生長速度快，因而在平板上生長時具有明顯的競爭優(yōu)勢，而在盆栽試驗中，木霉的生長優(yōu)勢不一定能體現(xiàn)出來；除了共有的競爭、抗生和重寄生等生防機制（Atanasova et al．，2013；劉增亮 等，2014；Abo-Elyousr et al．，2014）外，在溫室盆栽時，木霉不僅需要與病原菌競爭有限的空間和資源，還要與植物互作，通過與病原菌競爭植物表面的生態(tài)位、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等多種機制生防病原菌（Bae et al.，2009）。木霉菌的生防機制研究仍是以后的工作重點之一。

劉增亮，李梅，張玉杰，張林，楊曉燕，蔣細良．2014．哈茨木霉Thga1基因敲除突變株對幾種植物病原真菌的離體拮抗作用．中國生物防治學(xué)報，30（3）：370-375．

翁祖信，蔣興祥，肖小文．1985．黃瓜枯萎病抗病性鑒定方法研究——胚根接種法．中國蔬菜，（2）：30-33．

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Screening and Bio-control Effect Assessment of Trichoderma Strains against 3 Soilborn Vegetable Pathogens

ZHU Ping-ping，LING Jian，XI Ya-dong，CHEN Guo-hua，MAO Zhen-chuan，YANG Yu-hong*，XIE Bing-yan
（Vegetable Genetic Improvement，Ministry of Agriculture Key Laboratory，Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081，China）

This paper had screened the bio-control resources of 18 Trichoderma species，including 175 strains，against 3 kinds of soil-born vegetable pathogens as Fusarium oxysporum f. sp. cucumebrium Owen，Phytophthora capsici and Ralstonia solanacearum through confront culture experiments and green house potted plant experiments. The results indicated that through confront culture experiments，we have screened out 50 Trichoderma strains with inhibitation rate as 70.0%-86.3% against Fusarium oxysporum f. sp. cucumebrium Owen，and 43 Trichoderma strains with inhibitation rate as 70.4%-88.7% against Phytophthora capsici．And the potted plant experiments have screened out 32 Trichoderma strains with bio-control efficacy of 50.0%-92.7% against Ralstonia solanacearum．We further assessed the bio-control efficacy of 13 Trichoderma strains with antagonistic inhibitation rate higher than75% by potted plant experiment，and found 2 Trichoderma strains T52 （Trichoderma atroviride） and 32080 （Trichoderma pleurotum） with high bio-control efficacy over 60%．

Trichoderma spp.；Fusarium oxysporum f. sp. cucumebrium Owen；Phytophthora capsici；Ralstonia solanacearum；Bio-control

朱萍萍，女，碩士研究生，專業(yè)方向：分子植物病理學(xué)，E-mail：ping574992751@126.com

*通訊作者（Corresponding author）：楊宇紅，研究員，專業(yè)方向：植物病理學(xué)，E-mail：yangyuhong@caas.cn

2015-03-09；接受日期：2015-04-21

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303014），國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（CARS-25-B-01），農(nóng)業(yè)部園藝作物遺傳改良重點開放實驗室項目