番茄品種SSR標(biāo)記鑒定技術(shù)研究

（北京市種子管理站，北京100088）

番茄品種SSR標(biāo)記鑒定技術(shù)研究

趙海艷 吳明生*宋 歌 牛 茜 田慧芳

（北京市種子管理站，北京100088）

以16個(gè)番茄品種為材料，從200對(duì)番茄SSR引物中篩選出20對(duì)適合用于番茄品種鑒定的引物，用該20對(duì)引物對(duì)66個(gè)番茄品種進(jìn)行分析，共檢測(cè)出52個(gè)等位基因變異，等位基因變異范圍為2～5個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生2.6個(gè)等位基因變異。通過(guò)遺傳聚類方法對(duì)引物組合的品種鑒別能力進(jìn)行分析，結(jié)果顯示僅用9對(duì)引物構(gòu)成的引物組合就可以對(duì)66個(gè)番茄品種進(jìn)行有效鑒別，該9對(duì)引物組合構(gòu)建的SSR-DNA指紋圖譜可作為品種的遺傳標(biāo)簽用于品種真?zhèn)舞b定。

番茄；SSR；品種鑒定；指紋圖譜

番茄（Solanum lycopersicum L.）是我國(guó)的主要栽培蔬菜之一，但我國(guó)番茄種質(zhì)資源相對(duì)匱乏，加上消費(fèi)者對(duì)番茄風(fēng)味的特殊要求，導(dǎo)致育種單位所采用的育種材料集中在少數(shù)種質(zhì)資源上，育成的品種遺傳差異小。由于親緣關(guān)系相近的品種很難利用外觀形態(tài)加以區(qū)別，容易出現(xiàn)一品多名、一名多品，或以劣充好的違法行為。因此，亟須建立一套準(zhǔn)確、高效的番茄品種鑒定技術(shù)。

與傳統(tǒng)的品種鑒定方法相比，SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于玉米、水稻等主要農(nóng)作物的品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建（宋建 等，2006），在品種打假維權(quán)方面取得很好效果。在番茄方面，Suliman等（2002）利用AFLP、SSR、SNP等技術(shù)對(duì)番茄品種進(jìn)行多態(tài)性分析，認(rèn)為SSR標(biāo)記較適合于種質(zhì)資源多樣性分析。王日升等（2006）比較了SSR 標(biāo)記和形態(tài)標(biāo)記在番茄栽培品種遺傳多樣性的分析結(jié)果上具有高度一致性，表明SSR標(biāo)記可用于番茄品種鑒別。本試驗(yàn)對(duì)200對(duì)番茄SSR引物進(jìn)行篩選獲得適合番茄品種鑒定的候選引物，通過(guò)遺傳相似聚類分析方法確定適合66個(gè)番茄品種鑒定的SSR引物組合，并構(gòu)建了番茄品種的SSR-DNA指紋，以期為番茄品種分子鑒定和品種權(quán)保護(hù)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013～2014年在北京市種子管理站種子檢測(cè)室進(jìn)行。供試番茄材料由本站收集，共計(jì)66個(gè)品種，包括櫻桃番茄和普通番茄，其品種名稱和主要性狀見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取番茄的基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物 200對(duì)SSR引物來(lái)自Benor等（2008）和番茄基因數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.sgn.cornell. edu），普通引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，熒光標(biāo)記引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系總體積為12 μL。包括30 ng模板DNA，MgCl22.5 mol·L-1，dNTPs 0.15 mol·L-1，引物0.25 μmol·L-1，Taq 聚合酶0.1 U，1×Taq Buffer。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 普通引物的PCR產(chǎn)物和熒光標(biāo)記引物的PCR產(chǎn)物分別通過(guò)生物大分子分析儀（LabChip GX）和毛細(xì)管電泳儀（ABI 3500XL）進(jìn)行分析。

表1 66個(gè)番茄品種的名稱及主要性狀

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 SSR擴(kuò)增分離結(jié)果采用“0，1”統(tǒng)計(jì)方法，在同一分子量上，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”。多態(tài)性信息含量PIC=1-∑Pi2，Pi表示在i位點(diǎn)上的等位基因頻率。通過(guò)NTSYS-pc Version 2.0軟件按照非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法（UPGMA）完成遺傳聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

基于生物大分子分析儀電泳平臺(tái)，將不同果形、果色和生長(zhǎng)類型的16個(gè)番茄品種作為引物篩選材料，對(duì)200對(duì)SSR引物質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，從中篩選出等位基因大于2、擴(kuò)增譜帶清晰且重復(fù)性好的20對(duì)SSR引物作為番茄品種鑒定的候選引物（表2）?；诿?xì)管電泳平臺(tái)，用66個(gè)番茄品種對(duì)篩選的20對(duì)引物多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（表2）20個(gè)SSR位點(diǎn)共檢測(cè)出52個(gè)等位基因變異，等位基因變異范圍為2～5個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因變異數(shù)為2.6個(gè)；20個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)出88個(gè)基因型（圖1），變幅為3～11個(gè)，平均為4.4個(gè)；20個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性信息量（PIC）變幅為0.678～0.860，平均為0.756，均為高度多態(tài)性信息引物，表明篩選出的引物能較好地反映66份番茄品種的基因型多樣性水平，可用于番茄品種種質(zhì)分析。

表2 篩選的20對(duì)引物信息

2.2 引物組合與指紋圖譜構(gòu)建

為構(gòu)建66個(gè)番茄品種適宜的鑒定引物組合，將篩選的引物按照其多態(tài)性信息量高低（表2）排序，分別采用前1對(duì)、前2對(duì)、前3對(duì)等一直到前20對(duì)引物對(duì)66個(gè)番茄品種進(jìn)行遺傳相似性聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)引物組合數(shù)量達(dá)到16對(duì)時(shí)才可以將所有品種區(qū)別開(kāi)（圖2），品種間遺傳相似系數(shù)為0.182～0.977，品種間至少存在1個(gè)位點(diǎn)的差異。由于前10對(duì)引物和前6對(duì)引物以及前15對(duì)引物和前12對(duì)引物在鑒別品種數(shù)量上沒(méi)有差異（圖2），引物的增加對(duì)整個(gè)引物組合鑒別能力沒(méi)有明顯影響，所以將引物7、8、9、10、13、14和15剔除，最終的組合只需9對(duì)引物，即引物SSR255、X13437、SSR111、U81996、SSR266、AI773078、SSR598、SSR43和SSR20。用該9對(duì)引物組合對(duì)66個(gè)品種進(jìn)行遺傳相似性聚類分析（圖3），品種間遺傳相似系數(shù)為0.148～0.963，平均遺傳相似系數(shù)為0.601，與用前16對(duì)引物獲得平均遺傳相似系數(shù)0.605差異不是很明顯。中研988和硬粉8號(hào)之間遺傳相似系數(shù)最大為0.963，在LEaat003和SSR111位點(diǎn)上有差異。

圖1 番茄品種在SSR111位點(diǎn)上表現(xiàn)的基因型

圖2 引物數(shù)量與鑒別品種數(shù)量的關(guān)系

圖3 9對(duì)引物組合的聚類結(jié)果

將9個(gè)SSR位點(diǎn)的等位基因按其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度從小到大排列，采用“0，1”統(tǒng)計(jì)方法，即在同一等位基因上，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，基于毛細(xì)管電泳結(jié)果構(gòu)建了66個(gè)番茄品種的DNA指紋圖譜（表3），可作為番茄品種的遺傳標(biāo)簽，用于品種的真?zhèn)舞b定。

表3 66個(gè)番茄品種的DNA指紋

3 結(jié)論與討論

雖然多種DNA標(biāo)記技術(shù)可用于番茄品種的鑒定研究（朱海山 等，2003；蘇永濤 等，2010；劉淑君 等，2011），但是要在實(shí)際檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，選用的標(biāo)記技術(shù)必須具備多態(tài)性豐富、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好、電泳譜帶容易識(shí)別、簡(jiǎn)便易行且使用成本低等特點(diǎn)。相比較RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性差和AFLP技術(shù)的繁雜，SSR標(biāo)記則更適合用于品種的實(shí)際檢測(cè)，因此也被國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）列為DNA指紋建庫(kù)方法之一。目前SSR標(biāo)記用于番茄品種鑒定的研究相對(duì)較少，主要還是用于品種遺傳多樣性分析（王日升 等，2006；申璐 等，2011），而且結(jié)果分析基本上還是基于普通PAGE膠電泳技術(shù)，形成的指紋數(shù)據(jù)也難以整合（王柏柯 等，2010）。本試驗(yàn)在廣泛篩選引物的基礎(chǔ)上，通過(guò)毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)篩選的引物特征進(jìn)行分析，篩選獲得的20對(duì)引物特異性好、峰型簡(jiǎn)單易辨認(rèn)、分型結(jié)果穩(wěn)定重演性強(qiáng)，利用其中的9對(duì)引物構(gòu)成的組合就可以對(duì)66個(gè)番茄品種進(jìn)行有效鑒別，同時(shí)還構(gòu)建了66個(gè)番茄品種SSR-DNA指紋，為番茄品種快速鑒定奠定了基礎(chǔ)。

馴化和育種選擇使得栽培番茄的遺傳變異急劇變窄（Bai & Lindhout，2007），Archak等（2002）的研究顯示印度新近育成的番茄品種遺傳基礎(chǔ)比早期的窄，申璐等（2011）研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)番茄品種也存在這一問(wèn)題，而且遺傳基礎(chǔ)比國(guó)外的更窄。本試驗(yàn)中66份供試材料所產(chǎn)生的平均遺傳相似系數(shù)為0.601，最大的遺傳相似系數(shù)為0.963，也表現(xiàn)出供試品種的遺傳基礎(chǔ)接近的特點(diǎn)，這不僅制約著我國(guó)番茄新品種的培育，而且加大了當(dāng)下番茄品種的鑒別工作難度。因此要把9對(duì)SSR引物組合應(yīng)用到番茄品種真實(shí)性的實(shí)際檢測(cè)中，在更大范圍內(nèi)進(jìn)行品種甄別，需要補(bǔ)充新的引物到組合中去，這也是下一步研究的重點(diǎn)。

劉淑君，楊悅儉，葉青靜．2011．AFLP技術(shù)在番茄品種鑒定中的應(yīng)用．浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，（4）：749-753．

申璐，沈火林，柴敏．2011．采用InDel和SSR標(biāo)記分析番茄品種基因組DNA多態(tài)性．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，16（2）：34-42．

宋建，陳杰，陳火英．2006．利用SSR 分子標(biāo)記分析番茄的遺傳多樣性．上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)科學(xué)版，24（6）：524-528．

蘇永濤，劉楊，莊天明．2010．栽培番茄品種指紋圖譜的AFLP分析．中國(guó)蔬菜，（18）：34-39．

王柏柯，余慶輝，楊生保．2010．4個(gè)加工番茄新品種SSR指紋圖譜的構(gòu)建與品種鑒定．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，47（7）：1474-1478．

王日升，李楊瑞，楊麗濤．2006．番茄栽培品種SSR 標(biāo)記和形態(tài)標(biāo)記的遺傳多樣性分析．熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，14（2）：120-125．

朱海山，張宏，毛昆明．2003．RAPD標(biāo)記鑒定番茄雜交種子純度的研究．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，18（3）：270-272．

Archak S，Karihaloo J L，Jain A．2002．RAPD markers reveal narrowing genetic base of Indian tomato cultivars．Current Science，82：1139-1143．

Bai Y L，Lindhout P．2007．Domestication and breeding of tomatoes：what have we gained and what can we gain in the future? Annals of Botany，100（5）：1085-1094．

Benor S，Zhang M Y，Wang Z F，Zhang H S．2008．Assessment of genetic variation in tomato（Solanum lycopersicum L．）inbred lines using SSR molecular markers．Genet Genomics，35（6）：373-379．

Suliman P S，Kashkush K，Shas H．2002．Generation and mapping of AFLP，SSRs and SNPs in Lycopersicon esculentum．Cell Mol Biol Lett，7（2A）：593-597．

Studies on Tomato Variety Identification Technology Using SSR Marker

ZHAO Hai-yan，WU Ming-sheng*，SONG-Ge，NIU-Qian，TIAN Hui-fang
（Beijing Seed Administration Station，Beijing 100088，China）

Taking 16 tomato hybrid varieties as material， 20 pairs of primer suited for tomato variety identification were screened from 200 pairs of SSR primer， and 66 tomato varieties were analyzed. 52 allelic gene variations were identified among these varieties. The allelic gene variation was in the range of 2-5， with an average of 2.6 allelic gene variation each locus. The cultivar identification ability of primer combination was analyzed by genetic clustering method. The results showed that the 66 tomato varieties could be efficiently identified by only 9 pairs of SSR primer. The SSR-DNA fingerprinting constructed with these 9 pairs of primer combination could be used as genetic tag for variety authenticity identification.

Tomato；SSR；Variety identification； Fingerprinting

趙海艷，女，碩士，農(nóng)藝師，專業(yè)方向：種子質(zhì)量檢測(cè)，E-mail：zhaoh_yan@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：吳明生，男，高級(jí)農(nóng)藝師，專業(yè)方向：種子質(zhì)量檢測(cè)，E-mail：chpwcx2010@sina.com

2014-06-06；接受日期：2014-11-15

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（D131100000413001）