SSR標記輔助芥藍×甘藍型油菜種間雜交后代的遺傳背景篩選

于海龍 方智遠 楊麗梅 劉玉梅 莊 木 李占省 呂紅豪 張揚勇

（中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

SSR標記輔助芥藍×甘藍型油菜種間雜交后代的遺傳背景篩選

于海龍 方智遠 楊麗梅 劉玉梅 莊 木 李占省 呂紅豪 張揚勇*

（中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

為篩選芥藍×甘藍型油菜種間雜交后代的遺傳背景，加速回交轉育進程，采用蕾期授粉結合胚挽救手段進行遠緣雜交，獲得芥藍和甘藍型油菜的種間雜種F1和BC1群體。利用已有的220對SSR引物對雙親進行多態(tài)性篩選，獲得多態(tài)性引物51對。挑選均勻分布在甘藍9條染色體上、擴增穩(wěn)定、條帶清晰的33對多態(tài)性SSR引物，對3株F1單株和35株BC1單株進行遺傳背景篩選。NTSYSpc2.11a分析結果表明：F1植株的遺傳背景與親本甘藍型油菜更為接近，遺傳相似系數(shù)為0.74；而BC1植株的遺傳背景差異較大，與親本芥藍的遺傳相似系數(shù)在0.26～0.65之間。在35株BC1植株中，單株14Y1與芥藍的遺傳背景最為相近，形態(tài)觀察結果進一步驗證了該單株的遺傳背景與回交親本芥藍更相似，可用于下一步回交轉育。

芥藍；甘藍型油菜；種間雜種；遺傳背景；SSR標記

芥藍（Brassica oleracea var. alboglabra，CC，2n=2x=18）屬十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，以花薹為主要食用器官，是蕓薹屬中重要的蔬菜作物之一。相對于大白菜和結球甘藍，芥藍種質資源較少，遺傳背景比較狹窄。遠緣雜交是豐富蕓薹屬植物種質資源的重要手段之一（林超 等，2007）。通過遠緣雜交可以打破種、屬間的生殖隔離，有效地進行不同種、屬間雜交，創(chuàng)造植物新類型、獲得新種質資源，因此遠緣雜交可以作為拓寬芥藍遺傳背景的有效途徑之一。此外，由于芥藍的生長周期短，1 a可繁殖2～3代，因此利用芥藍進行遠緣雜交可快速實現(xiàn)目的性狀的轉移和改良。喬海云（2012）利用蕾期授粉結合胚挽救技術獲得了芥藍與菜薹的種間雜種，并研究了菜薹與芥藍種間雜交的親和性。韓甫（2011）利用芥菜型油菜與芥藍進行種間雜交，獲得異源三倍體種間雜種，并對影響種間雜交的因素、雜種性狀特征及種間雜種小孢子培養(yǎng)進行了研究。陳洪高（2006）通過蘿卜與白花芥藍雜交，合成了蘿卜-芥藍異源四倍體，該異源四倍體可用作向甘藍型油菜轉移蘿卜優(yōu)異性狀的橋梁材料。滿紅等（2007）利用四倍體菜薹和四倍體芥藍雜交，獲得了菜薹和芥藍的異源四倍體種間雜種。

甘藍型油菜（Brassica napus，AACC）是由甘藍（B. oleracea，CC）和白菜（B. rapa，AA）雜交后自然加倍獲得的，屬于十字花科蕓薹屬，19世紀30年代從歐洲引進，是我國重要的油料作物之一。甘藍型油菜作為甘藍類蔬菜的近緣種之一，具有一些控制特異性狀的優(yōu)異基因，如抗根腫病基因（季海雯，2013）、Ogura細胞質雄性不育育性恢復基因（Primard-Brisset et al.，2005）等，這正是甘藍類蔬菜所缺乏的。利用芥藍和甘藍型油菜遠緣雜交可以有效地拓寬芥藍的遺傳背景，可作為創(chuàng)制芥藍新種質的一條途徑。但到目前為止，關于芥藍和甘藍型油菜種間雜交的研究較少，且甘藍型油菜與甘藍類蔬菜遠緣雜交困難，后代育性低，很難獲得種間雜種。

21世紀初，分子標記技術就已經(jīng)應用于甘藍類蔬菜的遺傳育種（王曉武和方智遠，2001），隨著甘藍基因組測序與重測序的完成（Liu et al.，2014）以及生物信息學技術的發(fā)展，越來越多的分子標記得以開發(fā)，并用于甘藍親緣關系和遺傳背景多樣性分析（劉基生 等，2014），以及品種指紋圖譜構建和種子純度鑒定（王慶彪 等，2014）等研究。

本試驗采用蕾期授粉結合胚挽救手段進行遠緣雜交，獲得芥藍和甘藍型油菜的種間雜種F1和BC1群體，利用多態(tài)性SSR引物對雜交后代及回交后代的遺傳背景進行聚類分析，篩選出遺傳背景接近于親本芥藍的回交后代，作為下一步回交轉育的花粉供體，提高雜交后代回交育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芥藍高代自交系2份，其中1份由華南農業(yè)大學雷建軍老師提供，編號K1；1份由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甘藍課題組提供，編號JL6。甘藍型油菜高代自交系4份，其中2份由中國農業(yè)科學院油料作物研究所李云昌老師提供，編號Y6、Y7；另外2份由中國農業(yè)科學院油料作物研究所王漢中老師提供，編號Y8、Y9。

1.2 種間雜交和胚挽救

各材料均于2012年9月下旬播種，待幼苗6～7片葉時挑選長勢一致的健壯植株定植在溫室中，常規(guī)栽培管理。以1份芥藍材料為母本、4份甘藍型油菜材料為父本，配制4個雜交組合（K1×Y6、K1×Y7、K1×Y8和K1×Y9），獲得種間雜種F1。在盛花期采用人工剝蕾去雄重復授粉的方法：取父本新鮮花粉，涂抹在母本去雄花蕾的柱頭上，每天早晚重復授粉2次。為了進一步提高遠緣雜交的成功率，授粉后20 d進行胚挽救處理。子房表面消毒方式為：用75%乙醇消毒30 s，然后用8%次氯酸鈉消毒12 min，再用無菌水沖洗3次，每次5 min，以洗凈殘留的次氯酸鈉。離體培養(yǎng)環(huán)境條件為：溫度（25±2）℃，光照時間16 h·d-1，光照強度2 000 lx。胚培養(yǎng)采用MS固體培養(yǎng)基。利用芥藍材料K1、JL6與F1種間雜種進行大量回交，并結合胚挽救方法獲得BC1群體。

1.3 多態(tài)性SSR標記的篩選與背景標記的確定

利用王慶彪等（2014）設計開發(fā)的甘藍20對指紋圖譜EST-SSR核心引物，以及選取本所甘藍課題組設計開發(fā)的均勻分布在甘藍9條染色體上的200對SSR引物，對雙親（芥藍、甘藍型油菜）進行多態(tài)性篩選，選取擴增穩(wěn)定、條帶清晰、在雙親間有多態(tài)性的引物用于雜交、回交后代的遺傳背景分析。

植物基因組DNA提取采用改良CTAB法（Saghai-Maroof et al.，1984），PCR反 應 體 系（20 μL）：10×Buffer（含Mg2+）2 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.2 μL，模板DNA（20 ng·μL-1）5 μL，ddH2O 9.6 μL，本步驟所用試劑均購于北京迪寧生物科技發(fā)展公司。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，合適的退火溫度（退火溫度根據(jù)引物的Tm值設定）30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴增產物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，恒壓160 V、1.5 h，快速銀染法染色。

1.4 數(shù)據(jù)處理

針對引物擴增產生的每個等位變異，不同材料在該等位變異處有帶記為1，無帶記為0，最終整理得到一個由0/1構成的數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYSpc2.11a軟件計算親本和雜種單株間的遺傳相似系數(shù)，采用非加權類平均法（UPGMA）進行聚類分析。

1.5 雜種后代的形態(tài)學性狀調查

觀察、記錄雜交、回交后代植株成熟期的形態(tài)學特征，如葉形、花大小、葉裂數(shù)、葉耳數(shù)和花色等，調查標準參照《芥藍種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》（李錫香和方智遠，2008）。

2 結果與分析

2.1 SSR標記篩選結果

從220對SSR引物中篩選得到多態(tài)性引物51對，引物多態(tài)率為23.18%。挑選均勻分布在甘藍9條染色體上的擴增穩(wěn)定、條帶清晰、帶型差異較明顯、易于識別的多態(tài)性引物33對用于遺傳背景分析（表1、圖1）。

表1 33對多態(tài)性SSR引物信息

圖1 引物SSR53、SSR81、SSR94在親本中的擴增結果

33對多態(tài)性引物在雙親中共擴增得到125個等位變異，每對引物產生的等位變異數(shù)不等，變幅為2～8，平均每對引物擴增出3.79個等位變異。33對引物的多態(tài)性信息含量（PIC）在0.11～0.56之間，具有較好的鑒別能力，且它們均勻分布在甘藍的9條染色體上。

2.2 種間雜種的獲得及遺傳背景分析

利用蕾期授粉結合胚挽救方法，共獲得種間雜種F1植株7株，編號YL1、YL2-1、YL3、YL4、YL5、YL6、YL7；其中YL1、YL7由K1×Y7獲得，YL2-1、YL6由K1×Y8獲得，YL4、YL5由K1×Y6獲得，YL3由K1×Y9獲得。開花期觀察發(fā)現(xiàn)7株單株中只有YL2-1和YL6花粉較多。以YL2-1、YL2-3（YL2-3為YL2-1分化后經(jīng)加倍處理獲得的植株）、YL6為父本，與芥藍回交獲得BC1植株45株，編號14Y1～14Y45；經(jīng)形態(tài)觀察和倍性鑒定，其中35株為真雜種，10株為假雜種。

利用獲得的33對多態(tài)性SSR引物對親本、F1和BC1植株進行PCR擴增，采用NTSYSpc2.11a軟件計算單株間的遺傳相似系數(shù)，并進行聚類分析。結果在遺傳相似系數(shù)約為0.6處分為2個類群，親本芥藍和BC1單株14Y1聚為一支，親本甘藍型油菜、F1植株及除14Y1之外的BC1植株聚為一支；在遺傳相似系數(shù)約為0.7處分為4個類群，親本甘藍型油菜、親本芥藍、BC1植株14Y1、F1植株和除14Y1之外的BC1植株各自聚為獨立的一支（圖2）。

其中F1植株和親本芥藍K1間的遺傳相似系數(shù)為0.26，與親本甘藍型油菜的相似系數(shù)為0.74，這表明F1植株的遺傳背景與親本甘藍型油菜較為接近。BC1植株和親本芥藍K1、JL6間的遺傳相似系數(shù)在0.26～0.65之間，說明不同回交后代的遺傳背景差異較大（表2）。35株BC1植株中，14Y1、14Y7、14Y37和親本芥藍間的遺傳相似系數(shù)較大，分別為0.65、0.54、0.57，表明這3株BC1單株與芥藍的遺傳背景更相似。

圖2 親本、種間雜種F1和BC1群體的SSR聚類結果

表2 種間雜交后代（F1、BC1）植株和親本間的遺傳相似系數(shù)

對33對多態(tài)性標記在BC1植株中的分布情況進行統(tǒng)計（表3），發(fā)現(xiàn)在35株回交后代中，不同染色體上的標記呈現(xiàn)出親本芥藍帶型的頻率不同，其中染色體C8上的標記比其他染色體呈現(xiàn)親本芥藍帶型的頻率更高，而C4染色體上的標記和C9染色體靠前端標記（SSR773、SSR785）的頻率較低?？傮w而言，絕大多數(shù)標記在35株回交后代中呈現(xiàn)親本芥藍基因型的頻率低于50%；其中只有1個例外，標記SSR572容易回交后呈現(xiàn)親本芥藍基因型，35株中有30株回交后該標記帶型與芥藍基因型相同。

2.3 種間雜交后代的形態(tài)特征

由圖3可見，F(xiàn)1單株形態(tài)特征總體介于兩親本之間，植株營養(yǎng)生長旺盛，呈現(xiàn)超親優(yōu)勢，株型偏向于父本甘藍型油菜；葉基部有縱向排列的1～3對翅狀小葉，葉色較亮，蠟粉較少，有葉裂和葉耳，葉緣有鋸齒（圖3-a），葉表面和葉柄都具有刺毛（圖3-c），這些性狀特征均與父本甘藍型油菜相近，但不如父本明顯。在花色和花蕾形態(tài)方面，F(xiàn)1花色淡黃，介于兩親本之間；花冠較大，均大于兩親本（圖3-d）；花蕾飽滿細長，呈現(xiàn)兩親本中間形態(tài)（圖3-b）。

BC1植株營養(yǎng)生長的超親優(yōu)勢總體不如F1植株明顯，如最大外葉長和寬、葉柄長均小于F1植株（表4）。BC1植株間形態(tài)分離明顯，不同單株的葉裂數(shù)、葉耳數(shù)、花色、花大小各不相同；F1植株花色全部為淡黃色，BC1植株花色分離，部分單株呈現(xiàn)白色（圖3-f）。BC1植株中部分單株株型接近親本芥藍（圖3-g）。

2.4 BC1植株中重點單株的選擇

對BC1植株中攜帶親本芥藍的背景標記情況進行統(tǒng)計，單株14Y1攜帶親本芥藍的背景標記數(shù)最多（19個），其中染色體C7、C8上的標記基本都呈現(xiàn)親本芥藍形態(tài)，而這些標記在F1植株中均呈現(xiàn)雜合形態(tài)（表3）。結合其植物學性狀觀察，其株型（小） （圖3-g）、葉形（圓）、葉色（深綠）、葉面蠟粉（中等）（圖4-a）、花色（白） （圖4-b）等性狀均偏向于回交親本芥藍。該單株可作為重點回交對象，用于下一步的回交轉育。

表3 SSR標記在BC1植株中呈現(xiàn)親本芥藍基因型的情況

圖3 種間雜交后代植株的形態(tài)學特征

表4 種間雜交后代（F1、BC1）植株部分農藝性狀調查結果

圖4 BC1單株14Y1和雙親葉形、花形態(tài)比較結果

3 結論與討論

在蕓薹屬作物中，利用種間或屬間遠緣雜交已逐漸成為種質創(chuàng)新和優(yōu)良性狀轉移的一種重要方法，通過遠緣雜交獲得的種間雜種由于其親本親緣關系較遠，有可能產生比品種間或亞種間更大的雜種優(yōu)勢；該種間雜種也可作為橋梁親本將優(yōu)良性狀轉移到目的作物中。Hagimori等（1992）以花椰菜、蘿卜為材料，利用體細胞雜交獲得了抗性與蘿卜基本一致的抗根腫病雜種；獲得的這些屬間雜種花粉可育，可作為橋梁親本與蕓薹屬其他作物雜交，將抗根腫病性狀轉移到蕓薹屬栽培種中。Ayotte等（1987）利用遠緣雜交結合胚挽救手段成功將甘藍型油菜的抗除草劑性狀轉移到甘藍中。Choudhary等（2000）通過B. tournefortii與Raphanus candatus雜交，獲得異源雙二倍體Rapha-nofortii；該異源雙二倍體花粉活力高、種子生育力強，且這種特性隨著世代推進而增強，因此具有潛力開發(fā)成新的經(jīng)濟作物；此外，該異源雙二倍體可用作橋梁親本將兩親本的優(yōu)良性狀轉移到蕓薹屬其他作物中。本試驗通過遠緣雜交結合胚挽救技術獲得了芥藍和甘藍型油菜種間雜種，有利于創(chuàng)新芥藍種質資源和拓寬遺傳背景，這在前人的研究中鮮見報道。同時，由于芥藍無需低溫春化過程，可大大縮短育種時間，因此該種間雜種可作為橋梁材料從甘藍型油菜中導入優(yōu)良特異性狀，如油菜的Ogura CMS恢復基因Rfo（Primard-Brisset et al.，2005）、油菜抗根腫病基因（季海雯，2013）。下一步將利用分子標記鑒定本試驗中獲得的35株BC1植株是否攜帶有甘藍型油菜的重要優(yōu)異基因，這對于芥藍和其他甘藍類蔬菜的種質創(chuàng)新具有重要意義。

背景選擇是指對基因組中除了目標基因之外的其他部分的選擇，即遺傳背景的選擇。背景選擇的對象幾乎包括了整個基因組，這就要求用來選擇的標記能夠覆蓋整個基因組。隨著基因組測序的完成，基于基因組重測序可開發(fā)大量的SNP、SSR和InDel標記，它們在基因組內分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強、檢測容易，均可用作背景選擇標記。而SSR標記與其他標記相比，特異性好；數(shù)量豐富、覆蓋整個基因組；擴增穩(wěn)定、多態(tài)性較好；材料間通用性較強（周延清，2005）。SSR標記已成功應用于大豆（段紅梅 等，2003）、小麥（董冬，2011）、玉米（周洪昌 等，2011）、甘藍（劉基生 等，2014）、番茄（蘇曉梅，2014）、中國李（左立輝 等，2015）等多種作物的背景選擇。與傳統(tǒng)育種相比，利用分子標記可以大大提高回交育種篩選效率，在2～3代完全恢復成輪回親本的基因型（Young & Tanksley，1989；岳效飛，2011）。本試驗中，利用SSR標記結合形態(tài)學觀察對BC1植株進行背景篩選，獲得了遺傳背景和形態(tài)最接近親本芥藍的植株14Y1，作為下一步回交育種的花粉供體。本試驗在對SSR標記恢復成輪回親本基因型的頻率調查時還發(fā)現(xiàn)，不同染色體不同區(qū)段恢復成輪回親本基因型的頻率不同，如在14Y1單株C8染色體上的連續(xù)4對標記SSR646、SSR680、SSR688、SSR696均呈現(xiàn)親本芥藍形態(tài)，這初步表明回交后該染色體大部分區(qū)段已呈現(xiàn)輪回親本基因型，但整條染色體是否全部與輪回親本基因型一致，仍需進一步擴大標記數(shù)量進行驗證。

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Genetic Background Screen of Inter-specific Hybrids between SSR Marker Assisted Chinese Kale and Rapeseed

YU Hai-long，F(xiàn)ANG Zhi-yuan，YANG Li-mei，LIU Yu-mei，ZHUANG Mu，LI Zhan-sheng，LYU Hong-hao，ZHANG Yang-yong*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

To screen the genetic background and increase the back-cross breeding efficiency of the interspecific hybrids and their back-cross offsprings between Chinese kale（Brassica oleracea var. alboglabra，CC，2n=2x=18） and rapeseed（Brassica napus，AACC），the F1inter-specific hybrids and their BC1backcross offsprings between Ogu-CMS Chinese kale and rapaseed were obtained through hand pollination combined with embryo rescue technology. A total of 220 SSR primers were used to detect polymorphisms between the parents，in which 51 pairs of SSR primers showed polymorphism. 33 pairs of primers were selected to analyze the genetic background of 3 F1plants and 35 BC1plants，with even distribution on 9 chromosomes and stable amplifications．The results of analysis by software NTSYSpc2.11a showed that the similarity coefficients between F1plants and rapeseed was 0.74，which indicated that the genetic background of F1plants was closer to rapeseed than to Chinese kale，while the similarity coefficients between BC1plants and Chinese kale varied from 0.26-0.65，with big genetic background differences among BC1plants．In all 35 BC1plants，the genetic background of individual 14Y1 was the closest to Chinese kale，which was further confirmed by morphological observation．Thus，the individual 14Y1 could be used as donor plant for further backcross.

Chinese kale；Rapeseed；Inter-specific hybrid；Genetic background；SSR markers

于海龍，男，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：yuhailongnet@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：張揚勇，男，副研究員，碩士生導師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：zhangyangyong@caas.cn

2015-03-15；接受日期：2015-04-29

國家“863”計劃項目（2012AA100202），創(chuàng)新能力專項資金項目（2014EG134236），農業(yè)部大宗蔬菜產業(yè)技術體系項目（CARS-25），農業(yè)部園藝作物遺傳改良重點開放實驗室項目