紫花牡荊素對SKOV3卵巢癌干細胞樣細胞FoxO3a磷酸化的影響

姜玲，曹曉正，李程，肖蕎，楊劍鋒

1. 湖南師范大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長沙410000；

2. 湖南師范大學醫(yī)學院病理學教研室，湖南 長沙410013

紫花牡荊素對SKOV3卵巢癌干細胞樣細胞FoxO3a磷酸化的影響

姜玲1，曹曉正2，李程2，肖蕎2，楊劍鋒2

1. 湖南師范大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長沙410000；

2. 湖南師范大學醫(yī)學院病理學教研室，湖南 長沙410013

背景與目的：腫瘤干細胞的存在是卵巢癌高復發(fā)率和高死亡率的原因。本文研究紫花牡荊素(casticin，CAS)對SKOV3細胞系卵巢癌干細胞樣細胞(ovarian cancer stem cell like cells，OCSLCs)自我更新能力的影響及其機制。方法：體外培養(yǎng)SKOV3細胞系細胞，干細胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)SKOV3得到和擴增卵巢癌球形成細胞，即OCSLCs。蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)分析FoxO3a磷酸化水平。FoxO3a特異性siRNA轉(zhuǎn)染抑制FoxO3a蛋白表達，并測定腫瘤球形成率。結(jié)果：與親本細胞相比，OCSLCs高表達磷酸化FoxO3a蛋白，具有更高的腫瘤球形成率［(3.1±0.3)% vs (34.8±6.8)%，P＜0.05］。CAS顯著抑制OCSLCs腫瘤球形成能力，并降低FoxO3a磷酸化水平。FoxO3a特異性siRNA轉(zhuǎn)染抑制FoxO3a蛋白表達，拮抗CAS抑制OCSLCs腫瘤球形成作用。結(jié)論：降低FoxO3a磷酸化水平參與CAS抑制SKOV3細胞系OCSLCs腫瘤球形成作用。

卵巢癌；腫瘤干細胞；FoxO3a；自我更新

卵巢癌是婦科腫瘤死亡的最主要原因。手術(shù)聯(lián)合鉑類和紫杉烷類藥物的卵巢癌標準一線治療，自1996年以來沒有顯著改變［1］。大多數(shù)卵巢癌患者對化療敏感，但腫瘤常在5年內(nèi)復發(fā)，卵巢癌患者在標準治療后的5年生存率迄今為15%～30%［2］。目前，迫切需要尋求改善患者長期生存的治療藥物。近年的研究表明卵巢癌干細胞(ovarian cancer stem cells，OCSCs)在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中起決定性作用，針對性抑制或清除OCSCs的藥物發(fā)現(xiàn)研究可能是卵巢癌治療的革命性進步［3］。有研究顯示，卵巢癌SKOV3細胞系球形成細胞具有卵巢癌干細胞樣細胞(ovarian cancer stem-like cells，OCSLCs)的自我更新特性［4］，中藥蔓荊子的主要活性成分紫花牡荊素(casticin，CAS)通過活化FoxO3a抑制FoxM1誘導卵巢癌細胞凋亡［5］。因此，本文主要研究CAS是否和如何抑制源自SKOV3細胞系OCSLCs自我更新能力。

1 材料和方法

1.1 細胞與細胞培養(yǎng)

人卵巢癌細胞系SKOV3細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。用添加10% vol/vol胎牛血清(FBS)、100 IU/mL青霉素G和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基維持與擴增細胞。在成球培養(yǎng)中，收集細胞，用添加有100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、20 ng/mL人重組表皮生長因子、10 ng/mL人重組堿性成纖維細胞生長因子、不含維生素A的2% wt/vol B27以及1% wt/vol N2添加物(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細胞。以1 000個細胞/孔的密度接種于超低黏附6孔板(Corning Inc.，Corning，NY，USA)。每周2次添加生長因子。在傳代成球培養(yǎng)中，300×g離心收集腫瘤球細胞，并將細胞分散成單細胞懸液，然后，干細胞培養(yǎng)基超低黏附板懸浮培養(yǎng)，形成新腫瘤球。第2次傳代SKOV3細胞系球形成細胞被用于后續(xù)試驗。腫瘤球形成率以下列公式計算：腫瘤球總數(shù)/接種的活細胞總數(shù)×100%。

1.2 試劑與抗體

CAS購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，相對分子質(zhì)量為374.3，呈黃色結(jié)晶，純度為98.0%；用二甲基亞砜溶解(DMSO)溶解，制備為10 mmol/L儲存液，在使用前用DMEM培養(yǎng)基(購自美國Invitrogen公司)稀釋至標示的濃度?？笷oxO3a、抗p-FoxO3a和抗β-actin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自美國Millipore公司；LipofectamineTM2000購自湖南科泰生物技術(shù)有限公司。

1.3 FoxO3a特異性siRNA轉(zhuǎn)染

非特異性對照小干擾RNA(UUCUCCG AACGUGUCACGUdTdT)和FoxO3a小干擾RNA(ACUCCGGGUCCAGCUCCAC)由上海復蒙基因生物科技有限公司合成。按照產(chǎn)商推薦的操作步驟使用LipofectamineTM2000進行小干擾RNA的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，并進行藥物處理、Western blot分析和腫瘤球形成率測定。

1.4 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)分析

［5］的方法完成Western blot分析?？笷oxO3a、抗p-FoxO3a和抗β-actin抗體被用作一抗。Bio-Rad含量測定系統(tǒng)測定蛋白濃度?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF。使用ECL高級蛋白印跡分析系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ，USA)檢測信號。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 SKOV3細胞系原代與傳代成球培養(yǎng)腫瘤球形成率的比較

干細胞培養(yǎng)基超低黏附板懸浮培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細胞系細胞6 d得到非黏附克隆性腫瘤球(圖1A)。腫瘤球細胞分散成單細胞，以1 000個細胞/mL的密度傳代懸浮培養(yǎng)得到第2代球形成細胞(圖1B)；第2代腫瘤球細胞能形成第3代腫瘤球(圖1C)。與原代SKOV3細胞系成球培養(yǎng)腫瘤球形成率［(3.1±0.3)%］相比，再次成球培養(yǎng)腫瘤球形成率［(14.6±3.5)%］增高，第3代球形成細胞的腫瘤球形成率最高［(34.8±6.8)%］，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，在后續(xù)研究中，使用SKOV3第3代球形成細胞作為OCSLCs。

2.2 SKOV3細胞系細胞與球形成細胞FoxO3a磷酸化水平的比較

（3）調(diào)料：熟悉各種調(diào)料的性質(zhì)，根據(jù)各個菜的特點研究調(diào)料，使用調(diào)料的特征來提高質(zhì)量，豐富口味，由于調(diào)料更新較快，要不斷吸取新調(diào)料來促進菜品提高，研究調(diào)料有利于研究新菜品，豐富菜品口味。

Western blot分析結(jié)果顯示，與卵巢癌SKOV3細胞系細胞相比，SKOV3第3代球形成細胞高表達磷酸化FoxO3a蛋白(圖2)。

2.3 CAS對SKOV3細胞系球形成細胞腫瘤球形成率的影響

腫瘤球形成實驗結(jié)果顯示，CAS降低卵巢癌SKOV3細胞系球形成細胞的腫瘤球形成率，呈濃度依賴性(圖3)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 CAS對SKOV3細胞系球形成細胞磷酸化FoxO3a蛋白表達的影響

Western blot分析結(jié)果顯示，CAS明顯抑制卵巢癌SKOV3細胞系球形成細胞磷酸化FoxO3a蛋白表達(圖4)。

2.5 FoxO3a特異性siRNA轉(zhuǎn)染對CAS降低SKOV3細胞系球形成細胞FoxO3a磷酸化水平和腫瘤球形成率的影響

Western blot分析結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO3a特異性siRNA有效抑制SKOV3細胞系球形成細胞FoxO3a蛋白表達(圖5A)。腫瘤球形成實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3a特異性siRNA顯著減弱CAS抑制SKOV3細胞系球形成細胞腫瘤球形成作用(圖5B)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 卵巢癌SKOV3細胞系球形成細胞Fig.1 The sphere -for mingcells derived from ovarian cancer SKOV3 cells

圖2 卵巢癌SKOV3細胞系球形成細胞高表達磷酸化FoxO3a蛋白Fig. 2 Expression of phosphorylated FoxO3a in sphere-forming cells and parental cells

圖3 CAS以濃度依賴方式降低SKOV3細胞系球形成細胞腫瘤球形成率Fig. 3 Effects of CAS on the tumor sphere formation of Sphereforming cells derived from ovarian cancer SKOV3 cells

3 討 論

越來越多的證據(jù)支持腫瘤干細胞理論，該理論認為腫瘤是由一小群腫瘤干細胞引起和維持［6］。腫瘤干細胞的概念對腫瘤的預防和治療具有極深遠的臨床意義［7］。大量研究發(fā)現(xiàn)一些飲食來源的化合物是靶向腫瘤干細胞的有前途的化學預防藥物，如CAS［8］、萊菔硫烷［9］和金雀異黃素［10］等。有研究證實，SKOV3細胞系球形成細胞具有OCSLCs特性，包括自我更新能力和高致瘤性［4］。因此，基于CAS可能靶向抑制OCSLCs自我更新，本研究檢測CAS是否和如何抑制卵巢癌SKOV3細胞系OCSLCs腫瘤球形成能力。

圖4 CAS下調(diào)SKOV3細胞系球形成細胞磷酸化FoxO3a蛋白表達Fig. 4 CAS down-regulated expression of pFoxO3a in sphereforming cells derived from ovarian cancer SKOV3 cells

圖5 FoxO3a特異性siRNA轉(zhuǎn)染對FoxO3a蛋白表達和CAS抑制SKOV3細胞系球形成細胞腫瘤球形成作用的影響Fig. 5 Effect of FoxO3a specific siRNA transfection on FoxO3a expression and CAS inhibited tumor spheres formation of sphereforming cells derived from ovarian cancer SKOV3 cells

總之，腫瘤球形成法結(jié)果證實，CAS能靶向OCSLCs。此外，本研究結(jié)果表明，CAS活化FoxO3a是其作用可能機制之一。這些研究結(jié)果支持使用CAS預防和治療卵巢癌，并為臨床評價CAS靶向治療卵巢癌提供了支持性實驗依據(jù)。

［參 考 文 獻］

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［2］ LIAO J, QIAN F, TCHABO N, et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism ［J］. PLoS One, 2014, 9(1): e84941.

［3］ CHEN D, PAMU S, CUI Q, et al. Novel epigallocatechin gallate (EGCG) analogs activate AMP-activated protein kinase pathway and target cancer stem cells ［J］. Bioorg MedChem, 2012, 20(9): 3031-3037.

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［10］ MONTALES M T, RAHAL O M, KANG J, et al. Repression of mammosphere formation of human breast cancer cells by soy isoflavone genistein and blueberry polyphenolic acids suggests diet-mediated targeting of cancer stem-like/progenitor cells［J］. Carcinogenesis, 2012, 33(3): 652-660.

［11］ DUBROYKA A, KIM S, SALAMONE R J, et al. The role of PTEN/Akt/PI3K signaling in the maintenance and viability of prostate cancer stem-like cell populations［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106: 268-273.

［12］ SUNAYAMA J, SATO A, MATSUDA K, et al. FoxO3a functions as a key integrator of cellular signals that control glioblastoma stem-like cell differentiation and tumorigenicity［J］. Stem Cells, 2011, 29(9): 1327-1337.

The effects of casticin on phosphorylation of FoxO3a in stem-like cells derived from ovarian cancer SKOV3 cell line

JIANG Ling1, CAO Xiaozheng2, LI Cheng2, XIAO Qiao2, YANG Jianfeng2(1.Department of Obstetrics and Gynecology, the First Affiliated Hospital of Human Normal University, Changsha Hunan 410000, China; 2. Department of Pathology, Medical College of Hunan Normal University, Changsha Hunan 410013, China)

YANG Jianfeng E-mail: yjfbl@sohu.com

Background and purpose:Ovarian cancer is associated with a high recurrence and mortality due to the existence of cancer stem cells. The purpose of this study was to investigate the effect of casticin (CAS) on the capability of self-renewal in ovarian cancer stem cell like cells (OCSLCs) derived from SKOV3 cell line.Methods:SKOV3 cell line cells were cultured in vitro, and OCSLCs were obtained and amplified through suspended culture with conditioned medium of the stem cells. The phosphorylation level of FoxO3a was analyzed using Western blot. The protein expression of FoxO3a was inhibited by FoxO3a specific siRNA transfection, and then the ratio of sphereformation was detected.Results:Compared with parental cells, OCSLCs over-expressed phosphorylated FoxO3a (pFoxO3a) and had elevated ratio of sphere-formation [(3.1±0.3)% vs (34.8±6.8)%, P<0.05]. CAS significantly inhibited the capability of sphere-formation in OCSLCs and down-regulated the expression level of pFoxO3a. And the transfection of FoxO3a specific siRNA suppressed the protein expression of FoxO3a and attenuated the inhibitory effect of CAS on the sphere-formation of OCSLCs.Conclusion:Reduced expression level of pFoxO3a is involved in the effect that CAS inhibits sphere-formation of OCSLCs derived from SKOV3 cell line.

Ovarian cancer; Cancer stem cell; FoxO3a; Self-renewal

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.007

R737.31

A

1007-3639(2015)05-0360-05

2014-06-16

2014-09-18）

湖南省教育廳科學研究一般項目(13C524)。

楊劍鋒 E-mail:yjfbl@sohu.com.