乙肝病毒X蛋白上調(diào)肝癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α的作用和機(jī)制研究

劉利平，楊盛力，何婉，孫楓林，鮑世韻

1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院肝膽外科，廣東 深圳 518020；

2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院普通外科，湖北 武漢 430077；

3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 深圳 518020

乙肝病毒X蛋白上調(diào)肝癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α的作用和機(jī)制研究

劉利平1，楊盛力2，何婉3，孫楓林1，鮑世韻1

1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院肝膽外科，廣東 深圳 518020；

2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院普通外科，湖北 武漢 430077；

3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 深圳 518020

背景與目的：乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。有研究顯示，兩者在肝癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，但相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究擬進(jìn)一步在細(xì)胞水平上探討HBx對(duì)HIF-1α的調(diào)控作用及機(jī)制。方法：用LipofectemineTM2000包裹HBx表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肝癌Huh7細(xì)胞。蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)Huh7細(xì)胞中HIF-1α和HIF-1β蛋白的表達(dá)；特異性試劑盒檢測(cè)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性；實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)HIF-1α及其靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和多藥耐藥基因1(multi-drug resistance gene 1，MDR1)mRNA表達(dá)變化；免疫共沉淀法檢測(cè)HIF-1α、HBx和希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白(protein von Hippel-Lindau，pVHL)間的相互作用。結(jié)果：轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒后，Huh7細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)錄活性及其靶基因VEGF和MDR1的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，然而HBx對(duì)HIF-1α mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響(P>0.05)。同時(shí)，HBx顯著削弱pVHL介導(dǎo)的泛素化水解蛋白酶降解HIF-1α的活性。免疫共沉淀法檢測(cè)進(jìn)一步提示，HBx可直接結(jié)合pVHL，而對(duì)HIF-1α沒(méi)有結(jié)合作用。結(jié)論：HBx可能通過(guò)直接結(jié)合pVHL，抑制其與HIF-1α的相互作用，從而增強(qiáng)HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄活性。

肝細(xì)胞癌；缺氧誘導(dǎo)因子-lα；乙肝病毒X蛋白；希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白

肝細(xì)胞性肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，與慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染密切相關(guān)［1］。乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是HBV開(kāi)放讀碼框編碼的一種多功能蛋白，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)多種與轉(zhuǎn)錄、基因調(diào)控有關(guān)的因子結(jié)合，廣泛激活病毒與細(xì)胞的啟動(dòng)子，參與基因和信號(hào)通路調(diào)控，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。肝臟雖然血供豐富，但腫瘤內(nèi)由于新生血管功能缺陷和細(xì)胞代謝旺盛，常常導(dǎo)致局部組織嚴(yán)重缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)適應(yīng)缺氧微環(huán)境最重要的因子，對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新血管生成、促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、介導(dǎo)腫瘤化療耐藥起著重要作用［4-5］。作為肝癌發(fā)生、發(fā)展兩個(gè)最重要的調(diào)節(jié)蛋白，HBx和HIF-1α的相互作用越來(lái)越受到關(guān)注，雖有研究顯示兩者在肝癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，但相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明［6］。本研究擬進(jìn)一步在細(xì)胞水平上探討HBx的HIF-1α的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

HBx質(zhì)粒(FLAG-154X)由美國(guó)德雷塞爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院M. J. Bouchard博士贈(zèng)送，經(jīng)PCR擴(kuò)增HBx序列并插入pcDNA3.1載體，構(gòu)建HBx表達(dá)質(zhì)粒(pc3.1-HBx)，HIF-1α質(zhì)粒(HA-HIF-1α)和帶有FLAG標(biāo)簽的希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白(protein von Hippel-Lindau，pVHL)質(zhì)粒(FLAG-pVHL)由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所的J. S Issaacs博士贈(zèng)送。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，鼠抗人單克隆抗體HIF-1α、HIF-1β、HBx和β-actin、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG、蛋白A/G磁珠購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，鼠抗人單克隆抗體FLAG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。HIF-1α特異性轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman公司。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

肝癌細(xì)胞Huh7由含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，將Huh7細(xì)胞(5×105個(gè)/孔)接種于6孔板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中生長(zhǎng)至80%左右匯度。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染，按照脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)操作，24 h后收集細(xì)胞檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量RCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞mRNA的表達(dá)

收獲各組Huh7細(xì)胞，加入TRIzol液1 mL提取細(xì)胞總RNA，測(cè)RNA的濃度和純度，取1 μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。各基因需要的PCR引物見(jiàn)表1。cDNA被稀釋10倍后每個(gè)PCR反應(yīng)孔中加入1 μL，并加入10 nmol的上、下游引物各0.5 μL，無(wú)核酸酶的超凈水8 μL和SYBR Green Supermix 10 μL。PCR反應(yīng)在ABI 7900HT qRT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)上運(yùn)行，程序設(shè)置為：95 ℃2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。采用2?ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)。

表1 qRT-PCR引物Tab. 1 The primers for qRT-PCR

1.2.3 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)蛋白的表達(dá)

用RIPA液提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，采用SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白，采用恒壓100 V，90 min將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的HIF-1α、HIF-1β、HBx、FLAG和β-actin抗體，于4 ℃溫育過(guò)夜。TBST洗膜后加入1︰3 000稀釋的過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗，室溫溫育60 min，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.4 免疫共沉淀檢測(cè)蛋白間相互作用

用RIPA液提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，取500 μg總蛋白加入HBx抗體10 μg振蕩溫育12 h，然后加入20 μL蛋白A/G瓊脂糖磁珠沉淀免疫復(fù)合物，RIPA液洗滌3遍后，加入SDS緩沖液30 μL，置于水中煮沸10 min，然后行Western blot檢測(cè)：用HBx、HIF-1α和FLAG抗體檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。

1.2.5 HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)

采用美國(guó)Cayman公司的試劑盒檢測(cè)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性［7］。首先提取細(xì)胞核蛋白，取20 μg核蛋白加入到預(yù)先包被含有HIF-1α反應(yīng)原件的特異性雙鏈DNA的96孔板中，然后4 ℃溫育16 h，PBS洗板3遍后加入特異性HIF-1α抗體，再用PBS洗板3遍并加入HRP標(biāo)記的特異性二抗，然后加入顯色劑在用分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(D)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HBx對(duì)HIF-1α的表達(dá)調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄活性作用

在常氧條件下，Huh7細(xì)胞中HIF-1α被pVHL介導(dǎo)的泛素化水解酶降解，通常Western blot檢測(cè)表達(dá)很低。為了更好地顯示HBx對(duì)HIF-1α的調(diào)節(jié)作用，本研究共轉(zhuǎn)染了HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒以提高HIF-1α的基礎(chǔ)表達(dá)水平。HBx顯著上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，然而對(duì)HIF-1β的表達(dá)沒(méi)有明顯影響(圖1A)。HIF-1α轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與HIF-1β形成二聚體，并與下游靶基因啟動(dòng)子結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。HBx顯著上調(diào)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.05，圖1B)。進(jìn)一步qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HBx后HIF-1α靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和多藥耐藥基因1(multi-drug resistance gene 1，MDR1) mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05，圖1C)。因此，HBx對(duì)肝癌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性有明顯的上調(diào)作用。

2.2 HBx增強(qiáng)HIF-1α表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性作用機(jī)制

為了明確HBx上調(diào)HIF-1α表達(dá)作用機(jī)制，本研究首先檢測(cè)HBx對(duì)HIF-1α mRNA的影響。HBx對(duì)HIF-1α mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響(P>0.05，圖2A)。pVHL可以促進(jìn)泛素化水解酶介導(dǎo)的HIF-1α降解，因而Huh7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pVHL質(zhì)粒后HIF-1α表達(dá)明顯降低。然而，同時(shí)轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞HIF-1α表達(dá)沒(méi)有明顯改變，提示HBx可能通過(guò)抑制pVHL的作用上調(diào)HIF-1α的表達(dá)(圖2B)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HBx可以結(jié)合pVHL從而干擾pVHL介導(dǎo)的HIF-1α泛素化水解酶降解途徑，但HBx對(duì)HIF-1α沒(méi)有結(jié)合作用(圖2C)。因此，HBx可能通過(guò)結(jié)合pVHL，阻止其與HIF-1α相互作用，從而增強(qiáng)HIF-1α的穩(wěn)定性。

圖1 HBx對(duì)HIF-1α的表達(dá)調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄活性作用Fig. 1 The roles of HBx in regulating the expression and transcriptional activation of HIF-1α

圖2 HBx增強(qiáng)HIF-1α表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性作用機(jī)制Fig. 2 Mechanisms of HBx in up-regulating the expression and transcriptional activation of HIF-1α

3 討 論

肝癌是全世界第三大惡性腫瘤，在每年新增的約50萬(wàn)肝癌病例中，其中有一半發(fā)生在我國(guó)［1］。早期的小肝癌手術(shù)切除預(yù)后較好，5年生存率可達(dá)75%，但大部分患者臨床確診時(shí)即為中晚期，從而失去手術(shù)機(jī)會(huì)或術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率較高［8］。因此，深入探索肝癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，對(duì)肝癌的防治有著重要意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在肝癌組織中高表達(dá)，且與肝癌包膜不完整、門(mén)脈侵犯、術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和總生存時(shí)間降低關(guān)系密切［9］。同時(shí)，HIF-1α在肝癌組織中的表達(dá)與HBx呈正相關(guān)［10］。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步在細(xì)胞水平闡明HBx上調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄激活作用。HIF-1α在細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β結(jié)合形成二聚體，成為有活性的HIF-1復(fù)合物，與受其調(diào)節(jié)的下游靶基因的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物啟動(dòng)下游靶基因VEGF和MDR1等的轉(zhuǎn)錄［11］。VEGF是腫瘤新生血管形成最關(guān)鍵的生子因子，與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12-13］。MDR1是一種最典型的多藥耐藥基因，其編碼的P-糖蛋白是一種ATP依賴(lài)性膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，作用類(lèi)似于排出泵，可通過(guò)將化療藥物從癌細(xì)胞中外排而使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而降低藥效，是導(dǎo)致肝癌化療耐藥的重要因子［14-15］。因此，HBx可以通過(guò)增強(qiáng)HIF-1α的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展，并導(dǎo)致預(yù)后不良。

研究表明，HIF-1α蛋白表達(dá)的調(diào)控最重要的是在轉(zhuǎn)錄后水平［16］。本研究也發(fā)現(xiàn)，HBx對(duì)HIF-1α mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響。在常氧條件下，HIF-1α蛋白脯氨酸殘端發(fā)生羥基化，從而被pVHL識(shí)別并結(jié)合，啟動(dòng)E3泛素化水解酶介導(dǎo)的蛋白降解途徑［17-18］。作為一個(gè)抑癌基因，pVHL通常因?yàn)榛蛲蛔兌Щ?，從而?dǎo)致一系列腫瘤的發(fā)生，如腎癌、血管母細(xì)胞瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤［19］。我們研究發(fā)現(xiàn)，HBx可以直接結(jié)合pVHL，進(jìn)而可能抑制pVHL與HIF-1α的結(jié)合，導(dǎo)致E3泛素化水解酶介導(dǎo)的HIF-1α蛋白降解受阻，從而上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。因此，本研究結(jié)果可能揭示了一個(gè)新的HBx致癌機(jī)制，即通過(guò)直接結(jié)合pVHL導(dǎo)致其失去活性，從而阻斷HIF-1α蛋白的降解過(guò)程而使其表達(dá)升高。HBx蛋白為一種非結(jié)構(gòu)蛋白，可以通過(guò)折疊變形獲得二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而與目的蛋白結(jié)合［20］。需要特別指出的是，本研究用的HBx質(zhì)粒序列為野生型，近年來(lái)在肝癌組織中檢測(cè)到的HBx序列通常含有各種突變，是否HBx突變體具有同樣或者更強(qiáng)的結(jié)合pVHL的活性，值得進(jìn)一步研究［21］。

綜上所述，本研究在肝癌細(xì)胞水平上研究發(fā)現(xiàn)HBx可以通過(guò)直接結(jié)合pVHL，抑制HIF-1α蛋白的降解，從而增強(qiáng)HIF-1α的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展，并導(dǎo)致預(yù)后不良。因此，本研究揭示一個(gè)新的HBx致癌機(jī)制，豐富和完善HBx的功能，進(jìn)一步推動(dòng)肝癌發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制的研究。

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The role of hepatitis B virus X protein in regulation of hypoxia inducible factor-1α and the underlying mechanisms in hepatocellular carcinoma

LIU Liping1, YANG Shengli2, HE Wan3, SUN Fenglin1, BAO Shiyun1(1.Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, Shenzhen People’s Hospital, the Second Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen Guangdong 518020, China; 2.Department of General Surgery, Liyuan Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan Hubei 430077, China; 3.Department of Medical Oncology, Shenzhen People’s Hospital, the Second Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen Guangdong 518020, China)

BAO Shiyun E-mail: baomi94@163.com

Background and purpose:Hepatitis B virus X protein (HBx) and hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) play key roles in hepatocarcinogenesis and the development of hepatocellular carcinoma. Positive correlation on the expression of these 2 proteins in hepatocellular carcinoma tissues has been found, whereas the underlying mechanisms have not been fully elucidated. This study focused on the role of HBx in regulating HIF-1α and the underlying mechanisms in hepatocellular carcinoma cells.Methods:The expression plasmids were transfected into Huh7 cells with LipofectemineTM2000. Western blot analysis was applied to detect the expressions of HIF-1α and HIF-1β protein. The transcriptional activity of HIF-1α was detected by the commercial analysis kits. The mRNA levels of HIF-1α and its target genes, including vascular endothelial growth factor (VEGF) and multi-drug resistance gene1 (MDR1), were detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Immunoprecipitation analysis was applied to detect the interaction of HIF-1α, HBx and protein von Hippel-Lindau (pVHL).Results:Huh7 cells transfected with HBx plasmid led to sharp increase of HIF-1α protein and transcriptional activity, as well as the mRNA of VEGF and MDR1 (P<0.05). However, the mRNA level of HIF-1α was not obviously changed after HBx transfection (P>0.05). Meanwhile, HBx also significantly impaired the function of pVHL in mediating the degradation of HIF-1α by ubiquitin hydrolase. This finding was further confirmed by the immunoprecipitation analysis, which showed that HBx could directly bind to pVHL, but not to HIF-1α.Conclusion:HBx may inhibit the inter-activation between pVHL and HIF-1α through directly binding to pVHL, and thus enhance the stability and transcriptional activity of HIF-1α.

Hepatocellular carcinoma; Hypoxia inducible factor-lα; Hepatitis B virus X protein; Protein von Hippel-Lindau

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.003

R735.7

A

1007-3639(2015)05-0333-06

2014-12-19

2015-02-16）

國(guó)家自然科學(xué)青年基金(81402041)。

鮑世韻 E-mail:baomi94@163.com