Let-7a/g/i在骨肉瘤細胞中靶向調控Aurora-B表達

Let-7a/g/i在骨肉瘤細胞中靶向調控Aurora-B表達

周云飛，劉家明，陳宣銀，朱糧博，龍新華，周 揚，張志宏，劉志禮南昌大學第一附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330006

背景與目的：微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有重要調控作用的非編碼小分子RNA，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。該研究探討可能在骨肉瘤細胞中調控Aurora-B激酶表達的miRNA，并為進一步探討Aurora-B在骨肉瘤細胞惡性表型中的作用及調控機制奠定基礎。方法：采用生物信息學預測軟件(http://www.targetscan.org)以及熒光海腎素實驗探討可能靶向調控Aurora-B的miRNA；實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)和蛋白[質]印跡法(Western blot)進一步驗證骨肉瘤細胞系U2-OS和HOS細胞中調控Aurora-B表達的miRNA。結果：生物信息學預測和熒光海腎素實驗顯示，Aurora-B基因可能是let-7a/b/c/d/e/f/g/i的靶基因；RTFQ-PCR和Western blot檢測結果顯示，上調let-7a/g/ i的U2-OS和HOS細胞中Aurora-B mRNA和蛋白的表達水平顯著低于陰性對照組(陰性質粒轉染細胞)；但是上調let-7b/c/d/e/f的U2-OS和HOS細胞中Aurora-B mRNA和蛋白的表達水平和陰性質粒轉染細胞比較差異無統(tǒng)計學意義。結論：Let-7a/g/i可能負向調控Aurora-B在骨肉瘤細胞中的表達。

骨肉瘤；Let-7；Aurora-B

本研究的前期研究發(fā)現Aurora-B在骨肉瘤細胞中過度表達并且與肺部轉移呈正相關，抑制Aurora-B能顯著抑制骨肉瘤細胞遷移侵襲［1-3］。但是，Aurora-B在骨肉瘤中過度表達調控機制尚不清楚。本研究通過生物信息學預測、熒光海腎素實驗、實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)和蛋白[質]印跡法(Western blot)檢測Let-7a/g/i在骨肉瘤細胞中靶向調控Aurora-B基因表達，為進一步研究Aurora-B在骨肉瘤侵襲轉移中的作用及調控機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞株

人源骨肉瘤細胞系U2-OS和HOS細胞株，購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEN/F12 1∶1培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司，轉染質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司，胎牛血清、cDNA第一鏈合成試劑盒及RTFQ-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，Transwell侵襲小室購自美國Corning公司，基質膠購自美國BD公司，Western blot上樣蛋白Marker和PVDF膜購自美國Formentas公司，一抗(兔抗人Aurora-B IgG，1∶5 000，鼠抗人β-actin IgG，1∶5 000)購自美國Santa Cruz公司，二抗(羊抗兔IgG和兔抗鼠IgG，1∶5 000)購自北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物信息學預測

采用靶基因在線預測軟件(http://www. targetscan.org)對指定基因Aurora-B進行預測(表1)。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

U2-OS和HOS細胞分別用含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫、CO2體積分數為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

表1 Aurora-B基因序列及突變后序列Tab. 1 Nucleotide sequences of Aurora-B gene before and after mutation

1.3.3 轉染

按照LipofectamineTM2000說明書提供的步驟進行。轉染前1 d以(3×105～4×105)個/mL細胞懸液接種6孔板，每孔總體積為2 mL。當細胞達50%融合時轉染。在轉染前用無抗菌藥物、不含血清的OPTI-MEM(購自美國Gibco公司)培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 h。取10 μL Mimics、5 μL LipofectamineTM2000(6孔板每孔的量)，用OPTIMEM培養(yǎng)基分別稀釋至250 μL，后者室溫溫育5 min，然后將兩者混合均勻，室溫溫育20 min，然后逐滴加入培養(yǎng)板孔中，邊滴加邊“十”字晃動培養(yǎng)板，混合均勻。常規(guī)培養(yǎng)48 h后做表達檢測(轉染后6 h換含抗菌藥物和血清的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng))。

1.3.4 熒光海腎素實驗

轉染48 h后，將6孔板從培養(yǎng)箱中取出，小心吸去細胞培養(yǎng)上清液，PBS洗滌2次，將細胞用細胞裂解液裂解后，取5 μL細胞裂解液與螢火蟲熒光素酶緩沖液及底物5 μL(按Promega雙熒光報告系統(tǒng)測量試劑盒說明書操作)混勻測量熒光強度，然后加入熒光海腎素酶反應緩沖液及腔腸素底物5 μL，混勻再次測得熒光海腎素酶活性。將每個樣品按照螢火蟲熒光素酶活性進行均一化處理，比較熒光海腎素酶活性。

1.3.5 RTFQ-PCR檢測

轉染48 h 后收集各組細胞，用TRIzol法分別提取總RNA。將提取的RNA進行逆轉錄反應：16 ℃變性30 min，42 ℃延伸30 min，85 ℃終延伸10 min。結束后立即將cDNA產物取出，快速置于冰上冷卻，后續(xù)所有步驟均在冰上進行。將cDNA產物稀釋3～4倍，然后混勻并從中吸取2 μL(20 μL體系)做為模板，剩余產物存放于-20 ℃。RTFQ-PCR反應在ABI7500 RTFQPCR反應儀上進行，反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性12 s，62 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)；95 ℃終延伸15 s。在進行RTFQ-PCR定量時制作標準曲線，反應結束后確認擴增曲線和融解曲線等。不同時間重復6次實驗。

1.3.6 Western blot檢測蛋白表達

轉染后48 h收集各組細胞，RIPA裂解，提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗室溫溫育2 h，TBST洗膜3次，加入二抗室溫溫育1 h，TBST洗膜3次，4℃過夜，ECL顯影觀察轉染質粒對靶基因蛋白的影響。不同時間重復6次實驗。

1.4 統(tǒng)計學處理

表2 引物信息Tab. 2 Primer information

2 結 果

2.1 生物信息學預測

為探討可能調控Aurora-B基因的miRNA分子，本研究采用靶基因在線預測軟件(http:// www.targetscan.org)對指定基因Aurora-B進行預測。結果顯示，Aurora-B可能是let-7a/b/c/d/e/f/ g/i、miR-98、miR-4458以及miR-4500的靶基因(圖1)。

2.2 Aurora-B基因可能是Let-7家族成員Let-7a/b/c/d/e/f/g/i的靶基因

熒光海腎素實驗對let-7家族進行預測分析結果顯示，let-7a/b/c/d/e/f/g/i突變型中的熒光海腎素酶活性相對于野生型顯著增高(圖2)。

2.3 let-7a/g/i負向調控Aurora-B基因在骨肉瘤細胞中表達

為驗證let-7a/b/c/d/e/f/g/i是否負向調控Aurora-B基因在骨肉瘤細胞中的表達，我們分別采用let-7a/b/c/d/e/f/g/i mimics轉染骨肉瘤細胞系U2-OS和HOS細胞，RTFQ-PCR檢測細胞中l(wèi)et-7a/b/c/d/e/f/g/i及Aurora-B mRNA的表達；Western blot檢測Aurora-B相關蛋白的表達。與陰性對照組相比，let-7a/g/i表達上調的細胞中Aurora-B mRNA及蛋白表達水平顯著降低；結果顯示，在骨肉瘤細胞中，let-7a/g/i表達上調可以抑制Aurora-B的表達(圖3～5)。

圖1 靶基因在線預測結果(http://www.targetscan.org)Fig. 1 The result of the bioinformatics prediction (http://www.targetscan.org)

圖2 熒光海腎素實驗結果顯示Aurora-B可能是let-7a/b/c/d/e/f/g/i的靶基因Fig. 2 The result of Luciferase assays showed that Aurora-B may be the target gene of let-7a/b/c/d/e/f/g/i

圖3 RTFQ-PCR檢測結果顯示轉染mimics細胞中l(wèi)et-7a/b/c/d/e/f/g/i的表達量顯著高于未轉染細胞Fig. 3 The result of RTFQ-PCR showed that the expression level of let-7a/b/c/d/e/f/g/i in U2-OS and HOS cells transfected with mimics was significantly higher compared to the control group

圖4 上調let-7a/b/c/d/e/f/g/i后U2-OS和HOS細胞中Aurora-B mRNA水平Fig. 4 The relative Aurora-B mRNA level in let-7a/b/c/d/e/f/g/i up-regulated U2-OS and HOS cells

圖5 Western blot檢測let-7a/g/i表達上調后Aurora-B蛋白在骨肉瘤細胞系U2-OS及HOS中的表達水平Fig. 5 The expression of Aurora-B in let-7a/g/i up-regulated U2-OS and HOS cells by Western blot

3 討 論

骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的一種惡性骨腫瘤，大約占惡性骨腫瘤的35%［4］。隨著新輔助化療藥物的出現，骨肉瘤患者生存時間顯著延長，但是近幾十年來全球骨肉瘤的5年總生存率仍然徘徊不前［5］，其根本原因在于骨肉瘤患者在臨床確診時，80%的患者已經發(fā)生肺轉移［6］。而肺轉移是骨肉瘤患者最主要的死亡原因。因此，深入研究骨肉瘤侵襲轉移發(fā)生、發(fā)展的分子機制對提高骨肉瘤轉移的療效具有特殊意義。

有研究［7-8］表明，Aurora激酶家族成員參與細胞有絲分裂中的多個過程，包括著絲粒的復制、雙極紡錘體的形成等，其家族成員中的Aurora-B激酶位于染色體17p13.1，是一類負責調控細胞有絲分裂的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它在有絲分裂的過程中起著調節(jié)染色體濃縮、雙極定向和分離、調節(jié)細胞質分裂的作用。Aurora-B的過表達會在有絲分裂的過程中產生多處缺陷，包括失去著絲點附著微管和未經過分裂后期及細胞質分裂就完成有絲分裂、細胞染色體數目加倍、再經過多輪復制染色體發(fā)生隨機丟失和產生非整倍染色體、進而導致癌變的可能等。由于Aurora-B激酶的生物學功能注定了其原癌基因的角色，故已引起研究者的重視。Aurora-B在多種惡性腫瘤中呈高表達狀態(tài)，如肝癌［9］、多發(fā)性骨髓瘤［10］及肺癌［11-12］等，這都意味著Aurora-B可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系，被認為扮演著原癌基因的角色［13］。本研究的前期研究發(fā)現，Aurora-B在骨肉瘤組織中過度表達，并且可能與肺部轉移呈正相關，而抑制Aurora-B在骨肉瘤細胞中的表達能誘導細胞凋亡、抑制增殖及遷移、侵襲［14］。

近年microRNA的發(fā)現為研究腫瘤轉移的基因表達調控機制提供了新的視角。在真核生物中，除了反義RNA在翻譯水平的調節(jié)作用以及RNA干擾(RNA interference，RNAi)機制在轉錄后水平通過降解特異mRNA阻遏基因表達外，microRNA在基因調控中同樣也起著重要作用。microRNA具有調節(jié)細胞分化、增殖、死亡(主要是凋亡)、發(fā)育和代謝等功能。這些生物學效應是通過調控信號分子(如細胞因子、生長因子及轉錄因子等)的表達而實現。近年來，大量研究證實，microRNA不僅參與腫瘤的發(fā)生、增殖及凋亡，并且對腫瘤的轉移具有調節(jié)作用［15-17］。至今為止，已發(fā)現超過1 000種人類microRNA，據推測它們可能調控著人類基因組內1/3以上基因的表達，尋找microRNA分子及其靶基因的研究已成為基因調控研究領域的重要分支和熱點。近期的研究顯示，let-7的表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關［17-18］。本研究采用生物信息學預測及熒光海腎素實驗分析發(fā)現，Aurora-B基因很可能是let-7a/b/c/d/e/f/g/i的靶基因。為探討在骨肉瘤細胞中Aurora-B基因是否受let-7a/b/c/d/e/f/g/i的調控，本研究采用let-7家族成員mimics轉染骨肉瘤細胞系U2-OS細胞和HOS細胞，經RTFQ-PCR和Western blot檢測結果顯示，Aurora-B在let-7a/g/i表達上調細胞中的表達水平顯著低于其在陰性對照細胞中的表達，但是，在let-7d/b/c/e表達上調的細胞中Aurora-B表達水平無明顯下調(與陰性對照細胞組比)，這提示let-7a/g/i能負向調控Aurora-B在骨肉瘤細胞中的表達。

總之，本研究結果提示let-7a/g/i可以負向調控Aurora-B在骨肉瘤細胞中的表達，這為進一步研究Aurora-B在骨肉瘤侵襲轉移中的作用及調控機制提供了幫助。

［1］ 劉志禮, 尹慶水, 舒 勇, 等. Aurora-B, Ki-67在骨肉瘤中的表達及與遠處轉移的關系［J］. 解放軍醫(yī)學雜志, 2010, 36(10): 1092-1094.

［2］ 羅 ? 劉志禮, 舒 勇, 等. Aurora-B在骨肉瘤中的表達及與遠處轉移的關系［J］. 中國現代醫(yī)學雜志, 2011, 21(14): 1611-1619.

［3］ ZHU X P, LIU Z L, PENG A F, et al. Inhibition of Aurora-B suppresses osteosarcoma cell migration and invasion［J］. Exp Ther Med, 2014, 7(3): 560-564.

［4］ KIM S Y, HELMAN L J. Strategies to explore new approaches in the investigation and treatment of osteosarcoma［J］. Cancer Treat Res, 2009, 152(): 517-528.

［5］ NISWANDER L M, KIM S Y. Stratifying osteosarcoma: minimizing and maximizing therapy［J］. Curr Oncol Rep, 2010, 12(4): 266-270.

［6］ MUNAJAT I, ZULMI W, NORAZMAN M Z, et al. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma［J］. J Orthopaedic Surg (Hong Kong), 2008, 16(2): 182-185.

［7］ PRIGENT C, GILL R, TROWER M, et al. In silico cloning of a new protein kinase, Aik2, related to drosophila Aurora using the new tool: EST blast［J］. Silico Biol, 1999, 1(2): 123-128.

［8］ KATAYAMA H, OTA T, MORITA K, et al. Human AIM-1: cDNA cloning and reduced expression during endomitosis in megakaryocyte-lineage cells［J］. Gene, 1998, 224(1-2): 1-7.

［9］ YASEN M, MIZUSHIMA H, MOGUSHI K, et al. Expression of Aurora B and alternative variant forms in hepatocellular carcinoma and adjacent tissue［J］. Cancer Sci, 2009, 100 (3):472-480.

［10］ EVANS R P, NABER C, STEFFLER T, et al. The selective Aurora B kinase inhibitor AZD1152 is a potential new treatment for multiple myeloma［J］. Br J Haematol, 2008, 140(3): 295-302.

［11］ 付達華, 熊典虹, 劉志禮, 等. Aurora-B 激酶在肺腺癌組織中的表達及其臨床意義［J］. 南昌大學學報: 醫(yī)學版, 2010, 50(2): 31-34.

［12］ TAKESHITA M, KOGA T, TAKAYAMA K, et al. Aurora-B overexpression is correlated with aneuploidy and poor prognosis in non-small cell lung cancer［J］. Lung Cancer, 2013, 80(1): 85-90.

［13］ MERALDI P, HONDA R, NIGG E A. Aurora kinases link chromosome segregation and cell division to cancer susceptibility［J］. Curr Opin Genet Dev, 2004, 14(1): 29-36.

［14］ 劉志禮, 王 高, 舒 勇, 等. Aurora-B激酶特異性抑制劑AZD1152-HQPA對人骨肉瘤細胞株U2-OS細胞的抑制作用［J］. 南昌大學學報: 醫(yī)學版, 2010, 50(10): 30-36.

［15］ WANG W, DAI L X, ZHANG S, et al. Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by plasmid-based microRNA-7 inhibits human malignant gliomas growth and metastasis in vivo［J］. Neoplasma, 2013, 60(3): 274-283.

［16］ MAO J H, ZHOU R P, PENG A F, et al. MicroRNA-195 suppresses osteosarcoma cell invasion and migration in vitro by targeting VCP［J］. Oncol Lett, 2012, 4(5): 1125-1129.

［17］ LONG X H, MAO J H, PENG A F, et al. Tumor suppressive microRNA-424 inhibits osteosarcoma cell migration and invasion via targeting fatty acid synthase［J］. Exp Ther Med, 2013, 5(4): 1048-1052.

［18］ YANG W H, LAN H Y, TAI S K, et al. Repression of bone morphogenetic protein 4 by let-7i attenuates mesenchymal migration of head and neck cancer cells［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 29, 433(1): 24-30.

Let-7a/g/i targeted to Aurora-B in human osteosarcoma cells

ZHOU Yunfei, LIU Jiaming, CHEN Xuanyin, ZHU Liangbo, LONG Xinhua, ZHOU Yang, ZHANG Zhihong, LIU Zhili (Department of Orthopedics, the 1stHospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China)

LIU Zhili E-mail: zgm7977@163.com

Background and purpose:MicroRNA(miRNA) is a class of small non-coding RNA playing an important regulatory role in many tumors. This study investigated which miRNA might negatively regulate the expression of Aurora-B in osteosarcoma cells, and to lay the foundation for the further investigation of the effort and regulation of Aurora-B in osteosarcoma malignant phenotype.Methods:Bioinformatics prediction software (http:// www.targetscan.org) and luciferase assays were used to investigate which miRNA might target to modulate the Aurora-B. Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) and Western blot assay were used to further verify which miRNA could negative regulate the expression of Aurora-B gene.Results:Bioinformatics prediction showed let-7 family have the possibility to modulate the expression of Aurora-B; Luciferase assays showed that Aurora-B might be the target gene of let-7a/b/c/d/e/f/g/i; RTFQ-PCR and Western blot analysis testified that both the expression levels of Aurora-B mRNA and Aurora-B protein were significantly decreased in Let-7a/g/i up-regulated U2-OS and HOS cells, compared to the cells in the negative control group; but in Let-7b/c/d/e/f up-regulated U2-OS and HOS cells, the expression levels of Aurora-B mRNA and Aurora-B protein have no significant difference, compared to the cells in the negative control group.Conclusion:Let-7a/g/i may downregulate the expression of Aurora-B in human osteosarcoma cells.

Osteosarcoma; let-7; Aurora-B

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.12.008

R738.6

A

1007-3639(2015)12-0966-06

2014-07-09

2014-09-16）

劉志禮 E-mail:zgm7977@163.com