粉防己堿誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

張 靜，沈永青，仇 煒，穆衛(wèi)紅，孫東蘭，張艷華

1.石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，河北 石家莊 050011；

2.河北中醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河北 石家莊 050020；

3.石家莊市鹿泉區(qū)人民醫(yī)院外科，河北 石家莊 050020；

4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院泌尿外科，北京 100050

粉防己堿誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

張 靜1，沈永青2，仇 煒3，4，穆衛(wèi)紅1，孫東蘭1，張艷華1

1.石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，河北 石家莊 050011；

2.河北中醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河北 石家莊 050020；

3.石家莊市鹿泉區(qū)人民醫(yī)院外科，河北 石家莊 050020；

4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院泌尿外科，北京 100050

背景與目的：粉防己堿(tetrandrine，Tet)是一種天然化合物，其抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤作用尚不清楚。該研究擬檢測(cè)Tet對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用，并進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。方法：采用CCK-8法檢測(cè)Tet對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力的抑制作用；應(yīng)用Annexin V/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；在2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’, 7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)染色后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量；采用蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞Akt、p-Akt蛋白表達(dá)量。結(jié)果：Tet顯著抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力，Tet濃度為4、8、10和20 μmol/L處理細(xì)胞24 h時(shí)，WERI-Rb-1細(xì)胞抑制率分別為5.7%、25.0%、55.1%和84.9%，Y79細(xì)胞抑制率分別為2.4%、2.9%、23.8%和54.2% (P<0.01)；10 μmol/L Tet處理細(xì)胞12、24和48 h時(shí)，WERI-Rb-1細(xì)胞抑制率分別為6.0%、45.5%和74.7%，Y79細(xì)胞抑制率分別為2.9%、19.4%和43.3%(P<0.01)。Tet誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以10 μmol/L Tet處理細(xì)胞24和48 h時(shí)，WERI-Rb-1細(xì)胞凋亡率分別為(23.70±1.75)%和(34.83±3.15)%，Y79細(xì)胞凋亡率分別為(9.62±2.69)%和(14.97±1.50)%(P<0.01)，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK能夠顯著抑制Tet對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用(P<0.05)。10 μmol/L Tet作用細(xì)胞6及12 h后，細(xì)胞的ROS產(chǎn)生量較對(duì)照組明顯上升(P<0.01)，N-乙?；?L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)能夠抑制Tet誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS(P<0.01)，NAC抑制ROS后，細(xì)胞的凋亡率較單獨(dú)Tet作用組明顯下降(P<0.01)。Tet能夠抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路。結(jié)論：Tet誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，該作用機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)ROS升高、PI3K/Akt信號(hào)通路抑制有關(guān)。

粉防己堿；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；凋亡；反應(yīng)性活性氧；PI3K/Akt

粉防己堿(tetrandrine，Tet)是從千金藤屬防己科植物粉防己根部提取的一種天然雙芐基異喹啉類(lèi)化合物［1］。粉防己在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中具有悠久的應(yīng)用歷史，其被廣泛應(yīng)用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥、肺硅沉著病等疾病的治療中［2-4］。近年來(lái)，Tet由于其顯著的抗腫瘤作用而受到廣泛關(guān)注。已有研究表明，Tet不但具有良好的直接抗腫瘤作用，同時(shí)也具有顯著地逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的作用［5-7］。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的兒童惡性腫瘤之一，發(fā)病率為1∶21 000～1∶18 000［8］。雖然隨著治療方法的改進(jìn)，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療效果明顯改善，患兒的生存率顯著上升，但是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤作為一種嚴(yán)重致殘致死的疾病仍舊危害著許多兒童的健康。本研究通過(guò)探討Tet的抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的效果，初步闡明其作用機(jī)制，并為T(mén)et在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系WERI-Rb-1及Y79購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，Tet(純度≥90%)及N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，CCK-8購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司，Z-VAD-FMK購(gòu)自美國(guó)Enzo公司，Akt、p-Akt及GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，AnnexinⅤ/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，反應(yīng)性活性氧(reactive oxygen species，ROS)活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

WERI-Rb-1及Y79細(xì)胞均使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，過(guò)夜后依實(shí)驗(yàn)所需加入相應(yīng)濃度的藥物，給藥時(shí)間達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)定時(shí)間后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)溫育2 h，酶標(biāo)儀450 nm比色并記錄結(jié)果。

1.2.3 AnnexinⅤ/PI凋亡試驗(yàn)

將待檢測(cè)細(xì)胞常規(guī)離心收集，使用PBS洗滌2次后，輕柔加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入AnnexinⅤ和PI各5 μL，混勻后避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)

將待檢測(cè)細(xì)胞收集后使用細(xì)胞裂解液裂解，BCA法蛋白定量，加入上樣緩沖液后加熱變性，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后，一抗溫育過(guò)夜，次日TBST緩沖液洗膜后，二抗室溫溫育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光，拍照存檔，本研究所使用一抗封閉濃度均為1∶1 000。

1.2.5 ROS活性氧檢測(cè)

使用無(wú)血清培養(yǎng)基將二氯二氫熒光素一乙酰乙酸酯(2’, 7’-dichlorofluorescindiacetate，DCFH-DA)稀釋至終濃度10 μmol/L，待檢測(cè)細(xì)胞常規(guī)收集后懸浮于該稀釋液內(nèi)，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育20 min，每5 min顛倒混勻1次。檢測(cè)前使用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用χ±s表示，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Tet對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力的影響

對(duì)WERI-Rb-1及Y79細(xì)胞分別給予不同濃度(4、8、10和20 μmol/L)的Tet作用，24 h后使用CCK-8實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1A所示。Tet的抗腫瘤效果隨著給藥濃度的增加而不斷增強(qiáng)，在Tet濃度為4、8、10和20 μmol/L時(shí)，WERIRb-1細(xì)胞抑制率分別為5.7%、25.0%、55.1%和84.9%，Y79細(xì)胞抑制率分別為2.4%、2.9%、23.8%和54.2%；WERI-Rb-1及Y79細(xì)胞在藥物濃度分別為8及10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力開(kāi)始受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以10 μmol/L Tet處理WERI-Rb-1及Y79細(xì)胞，分別于12、24及48 h檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果表明Tet的抗腫瘤作用有明顯的時(shí)-效變化，WERI-Rb-1細(xì)胞抑制率分別為6.0%、45.5%和74.7%，Y79細(xì)胞抑制率分別為2.9%、19.4%和43.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1B)。

圖1 Tet對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力的影響Fig. 1 The anti-tumor effects of Tet on retinoblastoma cells

2.2 Tet對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響

為了研究Tet是否可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，本研究使用Annexin Ⅴ/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示在給予10 μmol/L Tet作用細(xì)胞24和48 h后，腫瘤細(xì)胞凋亡比率明顯上升，WERI-Rb-1細(xì)胞凋亡率由(3.45±0.83)%分別上升至(23.70±1.75)%和(34.83±3.15)%，Y79細(xì)胞凋亡率分別為(9.62±2.69)%和(14.97±1.50)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2A)。進(jìn)一步使用凋亡抑制劑Z-VAD-FMK進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在10 μmol/L Tet作用細(xì)胞24 h后，Z-VAD-FMK可以顯著抑制Tet對(duì)WERI-Rb-1及Y79細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用(P<0.05，圖2B、C)。該結(jié)果說(shuō)明Tet的抗腫瘤作用與其誘導(dǎo)凋亡作用有關(guān)。

2.3 Tet對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞ROS的影響

使用對(duì)Tet更為敏感的WERI-Rb-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)WERI-Rb-1細(xì)胞內(nèi)的ROS含量，在給予10 μmol/L Tet作用細(xì)胞6和12 h后，細(xì)胞的ROS產(chǎn)生量較對(duì)照組明顯上升，其平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組分別上升了(2.46±0.33)和(3.01±0.16)倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3A)。進(jìn)一步使用ROS清除劑NAC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明NAC能夠使Tet誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS顯著降低(P<0.01，圖3B)。為了說(shuō)明Tet引起的細(xì)胞ROS升高與凋亡之間的關(guān)系，本研究在給予細(xì)胞NAC后進(jìn)行了凋亡檢測(cè)。結(jié)果表明，在給予NAC抑制ROS后，細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)Tet作用組明顯下降(P<0.01，圖3C)，NAC能夠部分逆轉(zhuǎn)Tet的抗腫瘤作用。上述結(jié)果表明，Tet能夠引起ROS升高，且該作用與其介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

2.4 Tet對(duì)WERI-Rb-1細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的作用

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，在給予Tet 12 h后，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞p-Akt表達(dá)量呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)(圖4A)，說(shuō)明Tet能夠抑制WERI-Rb-1細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的活性。為了說(shuō)明該信號(hào)抑制作用與ROS產(chǎn)生之間的關(guān)系，本研究又使用了ROS清除劑NAC進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4B所示，在給予了NAC后，p-Akt的表達(dá)量較Tet單獨(dú)處理組明顯上升，ROS能夠抑制WERI-Rb-1細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路。

圖2 Tet對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響Fig. 2 The effects of Tet on apoptosis of retinoblastoma cells

圖3 Tet誘導(dǎo)ROS生成并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡Fig. 3 Tet induces cell apoptosis via ROS induction

圖4 Tet抑制WERI-Rb-1細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路Fig. 4 Tet inhibited the PI3K-Akt signal pathway of WERI-Rb-1 cells

3 討 論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是發(fā)病率最高的兒童眼內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，如果不接受治療，患兒通常會(huì)在1～2年內(nèi)死亡［9］。近年來(lái)，隨著治療技術(shù)的不斷提高，完全通過(guò)眼球摘除手術(shù)治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的方法已較少應(yīng)用。目前視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療原則是在保障患兒生命的前提下盡量保留患眼及殘存的視功能。所以在該病的治療中，保守治療起到了非常重要的作用。放療和化療是最常用的保守治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的方法，但是放療可能會(huì)造成嚴(yán)重的并發(fā)癥，化療又會(huì)誘導(dǎo)腫瘤耐藥從而導(dǎo)致治療失敗，如果能找到合適的保守治療的方法將極大提高患者的生存率。

我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥在腫瘤治療中具有非常廣闊的應(yīng)用前景。Tet是從中藥粉防己中提取的天然化合物，具有悠久的臨床應(yīng)用歷史。目前已知Tet對(duì)于多種腫瘤都具有良好的抗腫瘤作用［10-12］，該藥物可以激活膽囊癌和骨肉瘤細(xì)胞的Caspase-3蛋白從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡［13-14］，然而其是否具有抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的作用目前仍未見(jiàn)有研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，WERI-Rb-1及Y79細(xì)胞受到Tet處理后，細(xì)胞活性明顯下降，凋亡率明顯上升，Tet具有良好的抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的作用。ROS是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，在許多生理及病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其作用之一［15-16］。本研究表明Tet可以引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的增多，進(jìn)一步使用ROS清除劑NAC降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量后，細(xì)胞的凋亡率明顯下降，說(shuō)明Tet的誘導(dǎo)凋亡作用與ROS增多有關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)控機(jī)制，在細(xì)胞的增殖、凋亡和分化中發(fā)揮著重要的作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，Tet能夠顯著下調(diào)WERIRb-1細(xì)胞Akt的磷酸化水平，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路。有研究表明激活PI3K/Akt能夠?qū)е录?xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，而過(guò)多的ROS又能夠進(jìn)一步抑制PI3K/Akt通路［18-19］。為了探討Tet所引起的ROS產(chǎn)生與PI3K/Akt抑制之間的關(guān)系，我們使用了NAC進(jìn)行研究，結(jié)果表明Tet誘導(dǎo)了ROS的產(chǎn)生，過(guò)多的ROS又進(jìn)一步抑制了WERI-Rb-1細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路?？傊?，Tet一方面能夠通過(guò)誘導(dǎo)ROS直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，另一方面其誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS也能抑制細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究從體外水平驗(yàn)證了Tet的抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤作用，并初步闡明了其抗腫瘤的作用機(jī)制，Tet能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，從而豐富了Tet的抗腫瘤譜，拓寬了Tet的應(yīng)用，為T(mén)et的未來(lái)臨床使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Tetrandrine induces retinoblastoma cells apoptosis via ROS induction and PI3K/Akt inhibition

ZHANG Jing1, SHEN Yongqing2, QIU Wei3,4, MU Weihong1, SUN Donglan1, ZHANG Yanhua1(1. Prenatal Diagnosis Center, Fourth Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China; 2. College of Nursing, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, Hebei Province, China; 3. Department of Surgery, the People’s Hospital of Luquan District, Shijiazhuang 050200, Hebei Province, China; 4. Department of Urology, Beijing Friendship Hospital, Beijing 100050, China)

QIU Wei E-mail: qiuwei618@163.com

Background and purpose:Tetrandrine is a natural compound whose role in retinoblastoma remains unclear. This study investigated the effects of tetrandrine (Tet) on human retinoblastoma cells.Methods:CCK-8 assays were performed to analyze the effects of Tet on viability of retinoblastoma cells. The apoptosis rate was determined by Annexin V/PI assays. After staining with 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA), cellular reactive oxygen species (ROS) was measured by flow cytometry. Akt and p-Akt were detected by Western blot.Results:Tet inhibited cell viability of retinoblastoma cells. After treatment with Tet (4, 8, 10 and 20 μmol/L) for 24 h, cell viability inhibition rates of WERI-Rb-I were 5.7%, 25.0%, 55.1% and 84.9%, whereas inhibition rates of Y79 cells were 2.4%,2.9%, 23.8% and 54.2% (P<0.01). In cells treated with 10 μmol/L of Tet for 12, 24 and 48 h, cell viability inhibition rates of WERI-Rb-I were 6.0%, 45.5% and 74.7%, whereas inhibition rates of Y79 cells were 2.9%, 19.4% and 43.3% (P<0.01). Tet induced retinoblastoma cell apoptosis. After treatment with Tet (10 μmol/L) for 24 and 48 h, apoptosis rates of WERI-Rb-I were (23.70±1.75)% and (34.83±3.15)%, respectively, whereas apoptosis rates of Y79 cells were (9.62±2.69)% and (14.97±1.50)%, respectively (P<0.01). Apoptosis inhibitor Z-VAD-FMK attenuated Tet-induced cell death (P<0.05). ROS levels were indeed increased in cells treated with Tet (10 μmol/L) for 6 and 12 h (P<0.01), while N-Acetyl-L-cysteine (NAC) decreased Tet-induced ROS (P<0.01). After ROS was inhibited by NAC, apoptosis rate was decreased compared with the control (P<0.01). Further study indicated that Tet inhibited PI3K/Akt pathway in retinoblastoma cells.Conclusion:Tet induces cell apoptosis via increasing ROS synthesis and inhibiting PI3K/Akt pathway.

Tetrandrine; Retinoblastoma; Apoptosis; Reactive oxygen species; PI3K/Akt

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.12.006

R739.742

A

1007-3639(2015)12-0953-06

2015-05-09

2015-10-08）

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(編號(hào)：ZD20140032)。

仇 煒 E-mail:qiuwei618@163.com