CCL18通過(guò)與Nir1結(jié)合促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的研究

陳萍萍，田紅艷，李洪利，史立宏，任甜甜，翟麗敏，張寶剛

1.濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊261053；

2.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，山東 濰坊261053；

3. 濰坊醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊261053

CCL18通過(guò)與Nir1結(jié)合促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的研究

陳萍萍1，田紅艷1，李洪利2，史立宏3，任甜甜1，翟麗敏1，張寶剛

1.濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊261053；

2.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，山東 濰坊261053；

3. 濰坊醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊261053

背景與目的：Nir1是CCL18的跨膜受體，CCL18能與之特異性結(jié)合而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，但其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用尚不清楚。該文旨探討Nir1在膠質(zhì)瘤侵襲中的作用及分子機(jī)制。方法：應(yīng)用蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)Nir1在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)；利用siRNA技術(shù)抑制U251細(xì)胞中Nir1的表達(dá)；采用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Nir1蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)染前后U251細(xì)胞中Akt磷酸化的情況；使用體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力；采用F-actin聚合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)F-actin的聚合能力。結(jié)果：Nir1在各膠質(zhì)瘤細(xì)胞中均呈高表達(dá)；小RNA干擾技術(shù)沉默Nir1基因后，U251細(xì)胞中Nir1的蛋白表達(dá)量明顯下降，侵襲并穿透Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)目明顯比對(duì)照組少(P=0.00)；在CCL18刺激后細(xì)胞內(nèi)的F-actin聚合量比對(duì)照組減少；Akt磷酸化試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞在CCL18的刺激下Akt更易發(fā)生磷酸化，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞無(wú)論是否存在CCL18，Akt磷酸化都受到抑制。結(jié)論：在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在Nir1蛋白高表達(dá)，通過(guò)與細(xì)胞膜上CCL18特異性結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的F-actin聚合和Akt的磷酸化進(jìn)而調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。

膠質(zhì)瘤；Nir1；Akt；侵襲；siRNA

1.2.6 Akt磷酸化能力的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)設(shè)為2組：SiNir1/U251細(xì)胞和SCR/ U251細(xì)胞不接受CCL18刺激為一組，另一組為SiNir1/U251細(xì)胞和SCR/U251細(xì)胞用10 ng/mL的CCL18刺激5 min后，用冷PBS終止反應(yīng)，裂解提取蛋白做Western blot實(shí)驗(yàn)，將所得結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，定量數(shù)據(jù)采用χ±s。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nir1蛋白的表達(dá)

U251、LN-229和U87細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)待其長(zhǎng)至90%滿時(shí)，裂解提取蛋白做Western blot實(shí)驗(yàn)?；叶葤呙杞Y(jié)果顯示，Nir1在U251、LN-229和U87細(xì)胞系中均有表達(dá)(圖1)。

圖1 U251、LN-229和U87細(xì)胞中Nir1的表達(dá)Fig. 1 The expression of Nir1 in U251, LN-229 and U87 cells

2.2 siNir1/U251細(xì)胞和SCR/U251細(xì)胞中Nir1蛋白的表達(dá)

用小RNA干擾技術(shù)沉默Nir1后，siNir1/ U251細(xì)胞中Nir1蛋白的表達(dá)下降(圖2)，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

圖2 siNir1/U251細(xì)胞和SCR/U251細(xì)胞中Nir1的表達(dá)Fig. 2 The expression of Nir1 in the siNir1/U251 and SCR/U251 cells

2.3 體外侵襲實(shí)驗(yàn)

在高倍鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野的siNir1/ U251和SCR/U251穿透Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)分別為(16.33±2.26)和(44.47±2.03)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，siNir1/U251穿透Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)目與SCR/U251穿透Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)目相比明顯減少。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=35.89，P=0.000，圖3)。

圖3 Nir1對(duì)U251細(xì)胞侵襲力的影響Fig. 3 The influence of Nir1 on the invasion of U251cells

2.4 F-actin聚合實(shí)驗(yàn)

F-actin聚合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在CCL18刺激后的15 s到2 min內(nèi)，siNir1/U251細(xì)胞內(nèi)發(fā)生肌動(dòng)蛋白聚合量比SCR/U251細(xì)胞明顯減少(圖4)。

圖4 細(xì)胞在CCL18刺激后不同時(shí)間的F-actin聚合量Fig. 4 Time course of relative F-actin content in cells after the stimulation of CCL18

2.5 Akt磷酸化能力的檢測(cè)

為了研究Nir1蛋白表達(dá)降低影響F-actin聚合量的分子機(jī)制，本研究對(duì)2組細(xì)胞中Akt的磷酸化的能力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，在SCR/U251細(xì)胞組中，在CCL18的刺激下更易發(fā)生A k t的磷酸化，但在Nir1表達(dá)降低的U251細(xì)胞組中無(wú)論是否有C C L 1 8的刺激，A k t磷酸化均受抑制(圖5)。這表明在U251細(xì)胞中Nir1與CCL18特異性的結(jié)合增強(qiáng)了Akt磷酸化的能力，而降低U251細(xì)胞中Nir1的表達(dá)導(dǎo)致Akt磷酸化減少。

圖5 Western blot檢測(cè)CCL18刺激后Akt的磷酸化結(jié)果Fig. 5 Western blot analysis of the phosphorylation of Akt stimulated by CCL18

3 討 論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中惡性程度極高的腫瘤，因其易侵襲周圍正常的腦組織，導(dǎo)致手術(shù)難以完全切除。盡管現(xiàn)代診療技術(shù)已有了較高的發(fā)展，但膠質(zhì)瘤患者的平均生存期仍然不超過(guò)15個(gè)月［10］。近幾年發(fā)現(xiàn)，趨化因子不僅與炎性反應(yīng)、免疫、血管生成以及器官的發(fā)育相關(guān)，而且許多趨化因子與其相應(yīng)的受體結(jié)合參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程［11］。然而，Nir1和CCL18對(duì)膠質(zhì)瘤的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，Nir1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，并且應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)降低了Nir1在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察到Nir1表達(dá)降低的U251細(xì)胞，其侵襲遷移能力明顯降低。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力與細(xì)胞的侵襲能力密切相關(guān)，而F-actin聚合是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵［16］。有文獻(xiàn)［9］報(bào)道，Akt2的沉默可以減少F-actin聚合從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力降低。為了明確膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞在Nir1被抑制后運(yùn)動(dòng)能力的降低是否與F-actin聚合有關(guān)，本研究進(jìn)行了F-actin聚合實(shí)驗(yàn)和Akt磷酸化能力的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，Nir1被抑制后，U251細(xì)胞的F-actin聚合明顯減少，這是引起U251細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力降低的重要原因之一。而膠質(zhì)瘤細(xì)胞Akt磷酸化能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在CCL18刺激下U251細(xì)胞更易發(fā)生Akt磷酸化；且在Nir1表達(dá)下降的U251細(xì)胞中無(wú)論是否存在CCL18，Akt磷酸化均受抑制，這說(shuō)明U251細(xì)胞中Nir1與CCL18特異性的結(jié)合增強(qiáng)了Akt磷酸化的能力。Akt作為PI3K/Akt信號(hào)通路的組成部分，已被廣泛關(guān)注，同時(shí)本課題組前期研究證明，Akt在膠質(zhì)瘤的侵襲中有重要作用［17］。本研究結(jié)果顯示，Nir1表達(dá)降低后導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Akt的磷酸化和F-actin聚合量的減少是膠質(zhì)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力減弱的重要原因。

綜上所述，Nir1作為CCL18的受體在調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力方面起著重要的作用。應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)降低U251細(xì)胞中Nir1的表達(dá)，細(xì)胞的侵襲能力明顯降低，并且這種調(diào)控可能是通過(guò)調(diào)控F-actin聚合和Akt的磷酸化實(shí)現(xiàn)的。更多與Nir1作用有關(guān)的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究，這也將為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。

［1］ STEWART L A. Chemotherapy in adult high-grade glioma: a systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 randomised trials ［J］. Lancet, 2002, 359(9311): 1011-1018.

［2］ LEV S, HERNANDEZ J, MARTINEZ R, et al. Identification of a novel family of targets of PYK2 related to drosophila retinal degeneration B (rdgB) protein ［J］. Mol Cell Biol, 1999, 19(3): 2278-2288.

［3］ CHEN P, LI K, LIANG Y, et al. High NUAK1 expression correlates with poor prognosis and involved in NSCLC cells migration and invasion ［J］. Exp Lung Res, 2013, 39(1): 9-17.

［4］ ZHANG B, YIN C, LI H, et al. Nir1 promotes invasion of breast cancer cells by binding to chemokine (C-C motif) ligand 18 through the PI3K/Akt/GSK3β/Snail signalling pathway ［J］. Eur J Cancer, 2013, 49(18): 3900-3913.

［5］ SCHRAUFSTATTER I U, ZHAO M, KHALDOYANIDI S K, et al. The chemokine CCL18 causes maturation of cultured monocytes to macrophages in the M2 spectrum ［J］. Immunology, 2012, 135(4): 287-298.

［6］ CHANG C Y, LEE Y H, LEU S J, et al. CC-chemokine ligand 18/pulmonary activation-regulated chemokine expression in the CNS with special reference to traumatic brain injuries and neoplastic disorders ［J］. Neuroscience, 2010, 165(4): 1233-1243.

［7］ 孫 磊, 劉雨清, 李小龍, 等. Gab2-Akt-ARK5通路在膠質(zhì)瘤侵襲中的研究［J］. 中國(guó)腫瘤臨床, 2014, 24(9): 551-554.

［8］ 陳為一, 李小龍, 齊岳亮, 等. PTTG1影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲力機(jī)制的研究［J］. 中國(guó)癌癥雜志, 2014, 24(5): 329-332.

［9］ 張寶剛, 谷 峰, 李文良, 等. 小RNA干擾Akt2對(duì)U87惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響［J］. 解剖學(xué)報(bào), 2009, 40(5): 691-695.

［10］ TOKER A, YOELI-LERNER M. Akt signaling and cancer: surviving but not moving on ［J］. Cancer Res, 2006, 66(8): 3963-3966.

［11］ 歐周羅. 趨化因子與乳腺癌［J］. 中國(guó)癌癥雜志, 2013, 23(8): 618-623, 636.

［12］ ISLAM S A, LING M F, LEUNG J, et al. Identification of human CCR8 as a CCL18 receptor ［J］. J Exp Med, 2013, 210(10): 1889-1898.

［13］ MENG F, LI W, LI C, et al.CCL18 promotes epithelialmesenchymal transition, invasion and migration of pancreatic cancer cells in pancreatic ductal adenocarcinoma［J］. Int J Oncol, 2015, 46(3): 1109-1120.

［14］ LI H Y, CUI X Y, WU W, et al. Pyk2 and Src mediate signaling to CCL18-induced breast cancer metastasis ［J］. J Cell Biochem, 2014, 115(3): 596-603.

［15］ CHEN J, YAO Y, GONG C, et al. CCL18 from tumorassociated macrophages promotes breast cancer metastasis via PITPNM3 ［J］. Cancer Cell, 2011, 19(4): 541-555.

［16］ MOUNEIMNE G, DESMARAIS V, SIDANI M, et al. Spatial and temporal control of cofilin activity is required for directional sensing during chemotaxis ［J］. Curr Biol, 2006, 16(22): 2193-2205.

［17］ ZHANG B, GU F, SHE C, et al. Reduction of Akt2 inhibits migration and invasion of glioma cells［J］. Int J Cancer, 2009, 125(3): 585-595．

Nir1 promotes invasion of glioma cells by binding to chemokine (C-C motif) ligand 18

CHEN Pingping1, TIAN Hongyan1, LI Hongli2, SHI Lihong3, REN Tiantian1, ZHAI Limin1, ZHANG Baogang1(1. Department of Pathology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China; 2. Medicine Research Center, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China; 3. Research Center of Pharmacology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China)

ZHANG Baogang E-mail: zbg111@ hotmail.com

Background and purpose:Nir1 is a transmembrane receptor for chemokine (C-C motif) ligand 18. CCL18 specifically binds to Nir1 at the cellular membrane of breast cancer cells to exert its invasion and metastasis. However, the specific mechanism of Nir1 is not clear in glioma. This study probed the effect and mechanism of Nir1 in the invasion of glioma cells.Methods:Western blot was used to detect the expression of Nir1 in glioma cells. siRNA plasmid was used to transfect U251 cells. Western blot was used to analyze the expression of Nir1 and protein phosphorylation of Akt in the cells transfected by Nir1 plasmid. In vitro Matrigel invasion assay was used to detect the invasive ability in the cells that were transfected. F-actin polymerization assay was used to detect F-actin recognition ability in cells.Results:The expression of Nir1 was higher in all glioma cells. After transfection, the invasion of siNir1/ U251 was obviously decreased than the SCR/U251, F-actin content was reduced compared to the control group. Akt phosphorylation experiment result showed that the protein phosphorylation of Akt was enhanced in control group cells CCL18 following stimulation. However, the existence of CCL18 would affect the phosphorylation of Akt in siNir1/膠質(zhì)瘤是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有侵襲性高、手術(shù)完整性切除困難、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)［1］。因此，研究膠質(zhì)瘤侵襲的分子機(jī)制對(duì)治療該疾病有重要的意義。Nir1(PYK2 N-terminal domain-interacting receptor 1)也被命名為PITPNM3，亦被命名為非典型趨化因子受體6(ACKR6)，是CC族趨化因子配基18(CCL18)的跨膜受體，已在人類乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)表達(dá)［2-3］，有研究［4］證明，CCL18是通過(guò)與乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上Nir1的特異性結(jié)合而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。體內(nèi)的CCL18主要由M2表型的巨噬細(xì)胞分泌［5］，而腦內(nèi)的CCL18主要是由來(lái)源于血液?jiǎn)魏司奘杉?xì)胞系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的［6］。在膠質(zhì)瘤中Nir1與CCL18的關(guān)系及其對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Nir1的蛋白表達(dá)情況，用小RNA干擾技術(shù)降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nir1蛋白的表達(dá)，并且體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到Nir1蛋白表達(dá)降低后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲力降低。為了探討Nir1影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力的分子機(jī)制，本研究采用F-actin聚合實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染前后U251細(xì)胞F-actin的聚合能力和Akt磷酸化的情況進(jìn)行了檢測(cè)。1 材料和方法1.1 主要試劑U87、U251和LN-229細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection，ATCC)細(xì)胞庫(kù)，山羊抗人多克隆Nir1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，CCL18購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，鬼筆環(huán)肽購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，一抗Akt、p-Akt購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胰蛋白酶、彩色預(yù)染蛋白和D0018質(zhì)粒中量抽提試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司，Transwell小室、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將U87、U251和LN-229細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640/F10培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Nir1 siRNAs由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建。當(dāng)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)密度達(dá)到85%時(shí)，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染具有一段亂碼序列的質(zhì)粒和具有目標(biāo)片段5’-GGGAGAAGUGGCUUCGUAATT-3’的質(zhì)粒，將細(xì)胞分為對(duì)照組SCR/ U251和實(shí)驗(yàn)組siNir1/U251。轉(zhuǎn)染步驟參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)。1.2.3 Western blot檢測(cè)對(duì)siNir1/U251細(xì)胞和SCR/U251細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，裂解提取蛋白。制備凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加一抗Nir1、Akt和pAkt(濃度均為1∶1 000)于4 ℃溫育過(guò)夜，TBST洗膜后，結(jié)合二抗溫育后暗室內(nèi)曝光顯影，具體操作參照孫磊等［7］文獻(xiàn)。1.2.4 體外侵襲能力的檢測(cè)按文獻(xiàn)［8］操作，把細(xì)胞懸液加入到Transwell小室內(nèi)，同時(shí)加入10 ng/mL的CCL18，下室內(nèi)加入20%的胎牛血清，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將結(jié)果置于400倍顯微鏡下觀察，5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)Transwell小室下室面的細(xì)胞數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1.2.5 肌動(dòng)蛋白聚合實(shí)驗(yàn)按文獻(xiàn)［9］操作，細(xì)胞鋪6孔板內(nèi)，細(xì)胞用U251.Conclusion:Nir1 is high expression in glioma cells, and Nir1 binding to chemokine CCL18 promotes glioma cells invasion and metastasis through regulation the phosphorylation of Akt and F-actin polymerization .

Glioma; Nir1; Akt; Invasion; siRNA10 ng/mL的CCL18分別刺激15和30 s，1、2和5 min后固定，F(xiàn)-actin特異性熒光染料鬼筆環(huán)肽染色，清洗細(xì)胞，用甲醇萃取90 min，用熒光分光光度計(jì)對(duì)萃取物內(nèi)熒光染料的相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)。F-actin相對(duì)含量用下列公式計(jì)算：刺激時(shí)間F-actin值/未刺激F-actin值=刺激時(shí)間熒光值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.12.001

R739.41

A

1007-3639(2015)12-0921-05

2014-11-05

2015-01-18）

國(guó)家自然科學(xué)基金(81072068)；山東省中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(博士基金)(2010BSB14050)；濰坊醫(yī)學(xué)院青年科技創(chuàng)新基金(K11QC1002)；濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院青年創(chuàng)新基金(K12QC1002)。

張寶剛 E-mail:zbg111@hotmail.com