活血通脈顆粒對頸動脈粥樣硬化家兔ICAM-1、IL-6表達的影響*

謝 健童曉云沈 超李 曉石安華陳文玲劉 濤和春芳王雅莉趙 淳

（1.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021；2.云南中醫(yī)學院，云南昆明 650500）

·研究報告·

活血通脈顆粒對頸動脈粥樣硬化家兔ICAM-1、IL-6表達的影響*

謝 健1童曉云2沈 超2李 曉1石安華2陳文玲2劉 濤1和春芳1王雅莉1趙 淳1

（1.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021；2.云南中醫(yī)學院，云南昆明 650500）

目的探討活血通脈顆粒干預兔頸動脈粥樣硬化（CAS）形成的作用機制。方法75只新西蘭白兔，隨機抽取10只為正常組，其余65只采用高脂飼料喂養(yǎng)建立CAS模型。造模成功后將其隨機分為模型組、自然消退組、活血通脈顆粒低、中、高劑量組、辛伐他汀組6組，每組7只。分別于實驗第11周、第16周取頸動脈組織行HE染色以觀察病理變化；ELISA法檢測細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、白介素-6（IL-6）表達水平；熒光定量PCR檢測ICAM-1 mRNA表達。結果與自然消退組比較，活血通脈顆粒中、高劑量組和辛伐他汀組ICAM-1、IL-6水平明顯下降（P＜0.05），與活血通脈顆粒低劑量組比較，活血通脈顆粒高劑量組、辛伐他汀組明顯下降（P＜0.05）；與自然消退組比較，各治療組ICAM-1 mRNA表達明顯下降（P＜0.05）。結論活血通脈顆粒可能通過抑制ICAM-1、IL-6表達水平從而干預家兔動脈粥樣硬化的形成。

活血通脈顆粒 頸動脈粥樣硬化 ICAM-1 IL-6 兔

頸動脈粥樣硬化（CAS）是以頸部血管平滑肌細胞增多和脂質(zhì)在CAS斑塊沉積為特點，危害人類健康最嚴重的疾病之一。CAS造成的急性腦血管病具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高及復發(fā)率高等特點［1-2］。本研究觀察活血通脈顆粒對CAS兔模型細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、白介素-6（IL-6）表達水平的影響，為活血通脈顆粒干預CAS形成提供依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔75只，雌雄不限，（2000±500）g，清潔級，購于昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，合格證號：SCXK（滇）2011-0004。通風及自然光照下飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度18～25℃，濕度45～60℃。

1.2 藥物與試劑 活血通脈顆粒：由紅景天、虎杖、三七粉、水蛭、茯苓、隔山消等組成，每包15 g，由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心配制。辛伐他汀，商品名舒降之，規(guī)格40 mg/片，由默沙東制藥有限公司生產(chǎn) （產(chǎn)品批號K005133）。純化膽固醇，由安徽天啟公司提供（批號20140316），蛋黃粉，由同和生物公司提供 （批號20130305），兔IL-6 ELISA檢測試劑盒、兔ICAM-1檢測試劑盒，均為卡爾文生物科技有限公司Biocalvin系列 ELISA試劑盒。Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑，貨號DRR047A，SYBR Premix EX TaqTM 試劑，貨號 DRR041A，Takara RNAiso Plus Reagent試劑，貨號D9108，Easy dilution試劑，貨號D9160，DEPC Free H2O試劑貨號D358，以上試劑購于大連寶生物公司。DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司），Sunrise-basic Tecan酶標儀（瑞士Tecan公司），移液槍：Thermo labsystems，規(guī)格：20～200 μL，ABI2720 PCR儀（美國ABI），GenequantⅡ分光光度計（美國Pharmacia），ABI7500熒光定量PCR儀（美國ABI）。

1.3 模型制備 兔適應性喂養(yǎng)1周后，隨機抽取10只為正常組，飼養(yǎng)基礎飼料，65只飼養(yǎng)高脂飼料（78%基礎飼料中加入7%豬油，14%蛋黃粉，1%膽固醇）。連續(xù)飼養(yǎng)11周后抽取兩只家兔處死，取頸動脈血管在光鏡下觀察血管外膜組織病理變化。鏡下顯示動脈內(nèi)膜粗糙、顯著增厚，部分出現(xiàn)纖維脂肪性病變和局部粥樣化病灶，大量脂質(zhì)顆粒沉積，并伴有大量泡沫樣細胞，內(nèi)皮細胞排列紊亂、不規(guī)則，伴有大量平滑肌細胞移行至內(nèi)膜下增生，提示造模成功［3］。最終獲得成功模型兔35只。

1.4 分組與給藥 將模型兔隨機分為自然消退組、活血通脈顆粒低、中、高劑量組、辛伐他汀組5組，每組7只，基礎飼料飼養(yǎng)5周，每日灌胃1次，均自由飲水。根據(jù)臨床用藥劑量，常用實驗動物及人的體表面積比例［4］（劑量換算用），每1 kg體質(zhì)量的實驗兔每天給予1.87 mg辛伐他汀，蒸餾水溶解混勻后灌胃。自然消退組予等體積蒸餾水灌胃?；钛}顆粒低（生藥5.5 g/kg，相當于人的臨床劑量的2倍）、中（生藥11 g/kg，相當于人的臨床劑量的4倍）、高劑量組（生藥22 g/kg，相當于人的臨床劑量的8倍）予相應劑量藥物。連續(xù)灌胃5周。

1.5 檢測指標

1.5.1 頸動脈標本病理觀察 分別取于實驗第11周、第16周，取家兔頸動脈組織，將其浸入10%中性緩沖甲醛液固定，用水將未與組織結合的固定液及沉淀物洗滌，之后脫水、透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋切片，在實驗兔的頸總動脈取相同的切面，切片厚5 μm，HE染色。光鏡下觀察組織的病理改變。

1.5.2 ELISA法檢測ICAM-1、IL-6 取家兔血清4℃冷凍離心，3000 r/min離心10 min，提取上清液，設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL。樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；空白孔不加。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶 （HRP）標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.5.3 熒光定量PCR方法檢測ICAM-1 mRNA表達取組織塊100 mg與研缽體中，加入液氮研磨成粉末，移入玻璃勻漿器中，加入1 mL Trizol液進行勻漿處理。采取苯酚-氯仿法提取總RNA。進行cDNA的合成，逆轉(zhuǎn)錄反應體系。引物制備用GAPDH作為內(nèi)參照，序列如下：rICAM-1上游引物5′-TGCTCCGCCTTCCACC AG-3′，下游引物5′-TGGCACCACGCAGTCCTC-3′，rGAPDH上游引物5′-AGAGCACCAGAGGAGGACG-3′，下游引物5′-TGGGATGGAAACTGTGAAGAG-3′。實時熒光定量PCR反應體系如下：SYBR Green PCR master mix 12.5 μL；正向和反向引物各0.5 μL；蒸餾水9.5 μL；cDNA 1 μL混合均勻。每個基因設5個梯度標準品及陰性對照，待測樣品兩次重復反應。反應條件為：95℃30 s變性，95℃5 s，60℃31 s，28～34個循環(huán)。反應完畢，數(shù)據(jù)采用ABI7500 SDS Software分析，用公式2-△△Ct方法進行相對定量。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，多樣本組間比較（M）用單因素方差法。數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，假定方差齊時，用兩兩比較LSD法，方差不齊時，Dunnett′s T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 CAS模型的建立 喂養(yǎng)11周后，正常組頸動脈內(nèi)膜完整、較薄，平滑肌及平滑肌細胞排列整齊，無動脈粥樣硬化斑塊和泡沫細胞。模型組內(nèi)膜明顯增厚，伴有大量泡沫細胞堆積，細胞排列不規(guī)則，細胞大小、形態(tài)差異大。提示造模成功（見圖1）。

2.2 家兔ELISA檢測結果 給藥5周后，活血通脈顆粒中、高劑量組和辛伐他汀組與自然消退組相比兔血清ICAM-1和IL-6水平降低（P＜0.05），活血通脈顆粒高劑量組及辛伐他汀組ICAM-1的表達水平低于活血通脈顆粒低劑量組（P＜0.05）；活血通脈顆粒中、高劑量組及辛伐他汀組IL-6的表達水平低于活血通脈顆粒低劑量組（P＜0.05）。

圖1 兩組頸動脈HE染色（200倍）

表1 各組家兔血清中ICAM-1和IL-6水平比較（±s）

表1 各組家兔血清中ICAM-1和IL-6水平比較（±s）

與活血通脈顆粒低劑量組比較，*P＜0.05；與自然消退組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n I C A M -1（n g / m L）I L -6（p g / m L）正常組 1 0 7 4 . 5 4 ± 2 . 8 4 4 3 . 2 4 ± 2 . 4 7模型組 6 3 6 2 . 8 4 ± 1 0 . 5 3 1 9 9 . 8 0 ± 8 . 5 2自然消退組 7 3 0 4 . 9 8 ± 5 . 5 7 1 7 3 . 0 9 ± 7 . 7 5活血通脈顆粒低劑量組 7 2 8 3 . 8 7 ± 8 . 7 9 1 6 3 . 7 1 ± 9 . 2 4活血通脈顆粒中劑量組 7 2 5 7 . 6 1 ± 9 . 8 2△1 4 8 . 3 9 ± 6 . 0 3*△活血通脈顆粒高劑量組 7 2 3 2 . 9 7 ± 6 . 2 1*△1 2 3 . 8 9 ± 5 . 9 5*△辛伐他汀組 7 2 2 0 . 2 6 ± 5 . 3 5*△1 1 2 . 1 1 ± 4 . 8 5*△

2.3 家兔頸動脈ICAM-1 mRNA表達 正常組兔頸動脈組織中ICAM-1mRNA相對含量為（3.19±0.24）%，模型組為 （22.47±2.52）%，自然消退組為 （19.47± 1.81）%，活血通脈顆粒低劑量組為（14.38±0.76）%，活血通脈顆粒中劑量組為（10.23±0.59）%，活血通脈顆粒高劑量組為（8.69±0.43）%，辛伐他汀組為（7.17± 0.4）%，與自然消退組比較，各組均有顯著差異 （P＜0.05）。

3 討 論

研究表明，炎癥反應貫穿于AS起始、進展及斑塊破裂血栓形成的全過程，是不穩(wěn)定斑塊發(fā)生破裂的中心環(huán)節(jié)［5］。炎癥反應的激活可致斑塊不穩(wěn)定甚至破裂，血小板聚集及血栓形成，進而觸發(fā)急性不良事件。因此，通過抑制炎癥反應來延緩AS的發(fā)生發(fā)展，特別是穩(wěn)定斑塊，防止破裂，已經(jīng)成為該領域的重要研究方向。ICAM-1是內(nèi)皮細胞活化標志之一。在內(nèi)皮功能損傷情況下，大量炎性介質(zhì)、細胞因子等能誘導ICAM-1蛋白及mRNA的表達，參與T細胞反應、促進單核細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，最終促進或加劇AS等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展［6］。IL-6是介導炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)的促炎細胞因子，可通過誘導血小板源性生長因子（PDGF）促進血管平滑肌增殖，從而加快AS進程。ICAM-1在AS病變早期主要促使單核細胞向內(nèi)皮黏附、遷移，而單核細胞、T淋巴細胞與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生黏附，代表AS早期炎癥的開始。在AS進展期ICAM-1主要促進已遷入病灶的單核細胞滾動、T淋巴細胞激活，并增加其他細胞間的相互作用。IL-6水平升高可能標志炎癥狀態(tài)的存在。ICAM-1在中性粒細胞遷移和內(nèi)皮細胞黏附致AS過程中起重要作用，在血管內(nèi)皮細胞表達最強。ICAM-1的激活參與多種相關因子的釋放和表達，從而加快AS的進程。有研究表明頸動脈斑塊的高血壓患者血清IL-6顯著高于無斑塊患者，提示炎癥反應可能在CAS病變發(fā)展過程中起著更為重要的作用［7］。

中醫(yī)學認為CAS其本虛涉及心、肝、脾、肺、腎諸臟虛損，標實是指瘀血、痰濁、水濕阻滯脈道，而標實又是形成本病的關鍵。因此，“血瘀痰濁”之病機貫穿于CAS發(fā)病的整個過程，祛痰降濁、健脾益氣、活血化瘀之法乃是治療的關鍵。活血通脈顆粒由紅景天、虎杖、三七、水蛭、茯苓、隔山消等組成，為趙淳教授經(jīng)驗方。其功效為活血通脈、解毒祛痰，臨床療效確切。

從研究結果發(fā)現(xiàn)，活血通脈顆粒中、高劑量組ICAM-1和IL-6的表達水平低于自然消退組，家兔頸動脈組織中ICAM-1 mRNA的相對含量中活血通脈顆粒組低于自然消退組，說明活血通脈顆粒能有效地降低細胞因子ICAM-1、IL-6相對含量，提示活血通脈顆?？赡芡ㄟ^抑制AS血管壁ICAM-1活性、下調(diào)IL-6的表達從而干預CAS進程。這為臨床上應用活血通脈顆粒防治CAS提供了新的理論依據(jù)。

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Effect of the Huoxue Tongmai Granule on ICAM-1 and IL-6 of Arotid Atherosclerosis Rabbit

XIE Jian1，TONG Xiaoyun2，SHEN Chao2，et al. 1 Yunnan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine，The First Affiliated Hospital of Yunnan University of TCM，Yunnan，Kunming 650021，China；2 Yunan University of TCM，Yunnan，Kunming 650500，China

Objective：To invigorate the mechanism of Huoxue Tongmai Granule intervention the rabbit with carotid atherosclerosis（CAS）.Methods：In the 75 New Zealand white rabbit，randomly selected 10 for the normal group，the remaining 65 rabbits were established by the high-fat feed carotid atherosclerosis model.After 11 weeks，the models were randomly divided into the model group，the natural healing group，the Huoxue Tongmai Granule low，medium and high dose group，simvastatin group with 7 rabbits in each group.11 weeks experiment respectively，and week 16 carotid line organization HE staining was used to observe the carotid artery tissue pathological changes.Meanwhile，ELISA method for detection of ICAM-1 and IL-6 expression were dectected by the ELISA method.ICAM-1 mRNA expression was observed by the fluorescence quantitative PCR detection.Results：Compared with the natural healing group，ICAM-1 and IL-6 expression was decreased obviously in the Huoxue Tongmai Granule middle and high dose group（P＜0.05）.Compared with Huoxue Tongmai Granule lowdose group，the high-dose group and the simvastatin group were significantly decreased（P＜0.05）.Compared with the natural healing group，the mRNA expression of ICAM-1 was significantly decreased in the treatment group（P＜0.05）.Conclusion：Huoxue Tongmai Granule could inhibit ICAM-1and IL-6 expression level for the intervention of the formation of atherosclerosis.

Huoxue Tongmai Granule；Carotid atherosclerosis；ICAM-1；IL-6；Rabbit

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0396-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.007

2014-12-23）

云南省自然科學基金資助項目（2011FZ264）；國家中醫(yī)藥管理局“名老中醫(yī)藥專家工作室”建設項目