搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊HO-1和HSP70表達的影響

周凌云宮麗鴻張 湜白光彪倪小鷗

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

·研究報告·

搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊HO-1和HSP70表達的影響

周凌云1宮麗鴻2△張 湜1白光彪1倪小鷗1

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

目的觀察搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化（AS）不穩(wěn)定斑塊HO-1和HSP70的影響。方法將造模成功的ApoE基因敲除小鼠，分別給予阿托伐他汀鈣以及低劑量、中劑量、高劑量穩(wěn)斑湯干預(yù)，模型組和空白對照組采用生理鹽水灌胃。給藥13周后，采用免疫組化和RT-PCR技術(shù)檢測HO-1和HSP70的表達水平。結(jié)果與空白對照組相比，模型組HO-1和HSP70陽性表達量明顯減?。≒＜0.01）；與模型組相比，西藥組及穩(wěn)斑湯各劑量組均能增加HO-1和HSP70陽性表達量（P＜0.05或P＜0.01）；與西藥組相比，中藥高劑量組增加HO-1和HSP70陽性表達量無差異（P＞0.05）。結(jié)論搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯可能通過影響HO-1和HSP70的表達而干預(yù)AS斑塊形成及破裂。

搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方 ApoE基因敲除小鼠 AS 不穩(wěn)定斑塊 HO-1 HSP70

急性冠脈綜合征（ACS）為冠狀動脈粥樣硬化（AS）斑塊由穩(wěn)定性斑塊至易損性斑塊、不穩(wěn)定斑塊破裂、血栓形成而產(chǎn)生的，動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的破裂是引起急性心臟事件的原因。因此穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊為防治急性冠脈綜合征的關(guān)鍵一環(huán)。血紅素氧化酶（HO）是血紅素代謝的起始酶和限速酶，降解血紅素產(chǎn)生等摩爾的膽紅素、CO和游離鐵，心臟表達HO-1具有改善缺血/再灌注損傷心功能和抗細胞凋亡作用［1］。有研究表明血清高水平HSP70和AS中膜厚度減少及降低冠心病危險性相關(guān)［2］，增加血管壁HSP70的表達，從而減少受傷后內(nèi)膜厚度，提示血管壁HSP70的表達對血管壁起保護作用。本實驗以ApoE基因敲除小鼠為實驗對象，通過高脂飼養(yǎng)造出AS不穩(wěn)定斑塊模型，并予搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯干預(yù)，檢測斑塊中的HO-1和HSP70的陽性表達，以研究其在斑塊形成及破裂中的作用，從而為臨床應(yīng)用提供既有效、又安全的穩(wěn)定斑塊中藥復(fù)方提供理論依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡ApoE基因缺陷鼠 （系C57BL/6 J，70只，北京大學(xué)實驗動物中心美國Jackson實驗室引進并培育成功，雌雄各半，SPF級，體質(zhì)量18～20 g。

1.2 藥物 穩(wěn)斑湯組成為全蝎5 g，蜈蚣2條，地龍15 g，陳皮15 g，法半夏15 g，白術(shù)15 g，水蛭15 g。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局提供，加工制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液備用。

1.3 試劑與儀器 HO-1，HSP70一抗及相對應(yīng)二抗（北京博奧森生物科技有限公司）。SP試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。DAB顯色試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。兩步法RT-PCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.4 模型制備 ApoE基因缺陷鼠以含脂肪21%、膽固醇0.15%的高脂飼料（60Coγ滅菌照射處理）喂養(yǎng)13周后，隨機處死4只，取腹主動脈根部，HE染色觀察基礎(chǔ)AS硬化硬度，確定造模成功。

1.5 分組與給藥 將造模成功的ApoE基因敲除小鼠60只隨機分為5組，模型對照組、穩(wěn)斑湯低劑量組、穩(wěn)斑湯中劑量組、穩(wěn)斑湯高劑量組及西藥組，每組12只。正常C57BL/6J小鼠12只設(shè)為空白對照組，給予正常飼料喂養(yǎng)。根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質(zhì)量折算系數(shù)9.0折算成小鼠用量。穩(wěn)斑湯低劑量組給予穩(wěn)斑湯61.75 g/（kg·d）、穩(wěn)斑湯中劑量組給予穩(wěn)斑湯123.5 g/（kg·d）、穩(wěn)斑湯高劑量組給予穩(wěn)斑湯247 g/（kg·d），西藥組給予阿托伐他汀鈣0.27 mg/（kg·d），模型組、空白對照組給予生理鹽水0.3 mL/d，均灌胃給藥13周，每日1次。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 取材前夜禁食，經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢采血，離心分離血清，-80℃凍存用作測定血清HO-1和HSP70水平。處死全部小鼠，無菌條件下取出心臟及主動脈，心臟10%甲醛固定，主動脈放在凍存管內(nèi)液氮驟冷保存。

1.6.1 免疫組織化學(xué)檢測 采用SP法，常規(guī)滴加一抗、二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，用有計數(shù)格的目鏡，高倍視野下計數(shù)浸潤于內(nèi)膜的單核細胞數(shù)，每個標(biāo)本計數(shù)5個視野，取其平均值，即為該標(biāo)本單核細胞浸潤數(shù)值。以染色系數(shù)統(tǒng)計HSP70、HO-1免疫組化染色結(jié)果。

1.6.2 實時定量RT-PCR檢測 先提取總RNA，然后取4 μL總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶及隨機引物等反應(yīng)物混合配成20 μL體系，42℃ 15 min，95℃2 min反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，分別對小鼠HSP70、HO-1的表達進行測定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。組間比較用t檢驗，多組均數(shù)比較用方差分析，不同指標(biāo)間用直線相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠HO-1表達水平比較 HO-1陽性表達主要分布在血管內(nèi)皮細胞（EC）、泡沫細胞及血管平滑肌細胞（VSMC）內(nèi)，其中棕褐色顆粒的細胞為陽性表達的細胞?？瞻讓φ战M陽性細胞主要表達于內(nèi)膜，HO-1表達在EC內(nèi)。模型組HO-1表達明顯降低，偶見弱陽性表達；中藥中、高劑量組及西藥組表達升高，廣泛表達于EC、VSMC及斑塊的泡沫細胞內(nèi)。見圖1。各組小鼠腹主動脈組織中HO-1表達水平見表1和圖2。結(jié)果表明，各給藥組與模型組比較，均能提高斑塊內(nèi)HO-1的陽性表達（P＜0.01）。

表1 各組小鼠腹主動脈組織中HO-1蛋白、HO-1 mRNA表達水平比較（±s）

表1 各組小鼠腹主動脈組織中HO-1蛋白、HO-1 mRNA表達水平比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n H O -1 H O -1 m R N A空白對照組 1 0 0 . 2 6 5 ± 0 . 0 0 9 0 . 2 7 0 ± 0 . 0 2 4模型對照組 1 0 0 . 1 9 9 ± 0 . 0 1 1*0 . 2 2 7 ± 0 . 0 2 2*中藥低劑量組 1 0 0 . 2 8 3 ± 0 . 0 0 9△△0 . 2 9 0 ± 0 . 0 3 7△△中藥中劑量組 1 0 0 . 3 1 0 ± 0 . 0 1 0△△0 . 3 1 8 ± 0 . 0 2 9△△中藥高劑量組 1 0 0 . 3 1 7 ± 0 . 0 1 2△△0 . 3 6 7 ± 0 . 0 4 1△△西藥組 1 0 0 . 3 1 5 ± 0 . 0 0 8△△0 . 3 8 5 ± 0 . 0 3 3△△

圖1 各組小鼠腹主動脈組織（DAB顯色，100倍）

圖2 各組小鼠腹主動脈組織中HO-1 mRNA表達電泳圖

2.2 各組小鼠HSP70表達水平比較 見圖3。各組小鼠腹主動脈組織中HSP70主要分布于細胞漿中，陽性表達產(chǎn)物呈棕褐色顆粒，粥樣硬化斑塊中主要分布于纖維帽的平滑肌細胞胞漿中?？瞻讓φ战M小鼠動脈內(nèi)膜細胞胞漿內(nèi)可見大量陽性表達顆粒，模型組小鼠動脈組織切片中陽性表達物明顯減少，各治療組表達水平高于模型組。Apo E基因敲除小鼠的RT-PCR結(jié)果表明，各給藥組與模型組相比，均能提高各組小鼠腹主動脈組織中HSP70的陽性表達水平 （P＜0.05或P＜0.01）。見表2和圖4。

圖3 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70表達（DAB顯色，400倍）

3 討 論

表2 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70蛋白、HSP70 mRNA表達水平比較（±s）

表2 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70蛋白、HSP70 mRNA表達水平比較（±s）

組別 n H S P 7 0 H S P 7 0 m R N A空白對照組 1 0 0 . 2 0 1 ± 0 . 0 1 3 0 . 2 9 1 ± 0 . 0 3 0模型對照組 1 0 0 . 1 6 9 ± 0 . 0 0 9*0 . 2 3 3 ± 0 . 0 2 8*中藥低劑量組 1 0 0 . 2 1 0 ± 0 . 0 1 1*0 . 2 8 5 ± 0 . 0 2 8△△中藥中劑量組 1 0 0 . 2 1 9 ± 0 . 0 1 4△0 . 3 4 3 ± 0 . 0 2 0△△中藥高劑量組 1 0 0 . 2 4 6 ± 0 . 0 0 6△△0 . 3 8 2 ± 0 . 0 1 2△△西藥組 1 0 0 . 2 4 2 ± 0 . 0 1 5△△0 . 4 1 3 ± 0 . 0 2 1△△

圖4 小鼠腹主動脈組織中HSP70 mRNA表達電泳圖

冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成是一個由多種因素參與的漫長復(fù)雜的過程，其發(fā)病機制尚不明晰，炎性反應(yīng)在不穩(wěn)定斑塊形成及破裂中起著重要作用。本實驗研究結(jié)果顯示，經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)后，主動脈根部AS斑塊呈現(xiàn)不穩(wěn)定斑塊的病理形態(tài)學(xué)特征。近年研究表明［3］，HO-1具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，對心血管系統(tǒng)具有重要的保護作用。熱休克蛋白（HSP）是一種進化上高度保守的細胞應(yīng)激蛋白，具有抗原性，被免疫系統(tǒng)視為外源分子，從而觸發(fā)自身免疫反應(yīng)，在原核與真核生物中均有表達。HSP-70是其中重要的活性成分，被誘導(dǎo)生成后，產(chǎn)生非特異性保護作用。Nonaka等［4］通過觀察在HSP70轉(zhuǎn)基因鼠離體心臟缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，HSP70轉(zhuǎn)基因鼠心臟收縮功能顯著改善，實驗小鼠細胞損傷較對照組輕，梗死范圍也較對照組縮小，進而對心肌產(chǎn)生保護作用。中醫(yī)認為，痰濁由津液凝聚而成，津血同源，都因水谷精微化生。長期恣食肥甘厚味易生痰濁而成為痰濁形成的外因。痰濁一旦形成上犯于胸，致胸陽痹阻，又可壅滯脈道，使氣血不能暢行，致心脈痹阻而成胸痹?！毒霸廊珪贰疤碉嫛闭J為“果使脾強胃健，如少壯者流，則水谷隨食隨化，皆成氣血，焉得留而為痰”。張仲景論胸痹之脈為陽微陰弦，浮取而微，系胸中陽氣虛衰，沉取而弦乃陰寒之邪內(nèi)盛，痰涎水飲壅阻，邪正博結(jié)，形成胸中阻塞而痛。本實驗選用復(fù)方穩(wěn)斑湯，方中全蝎、蜈蚣息風(fēng)止痙、解毒散結(jié)，蜈蚣兼能通絡(luò)止痛；地龍清熱息風(fēng)、平喘通絡(luò)止痙，共為君藥。陳皮、半夏、白術(shù)合用，既能燥濕化痰又可寬胸理氣、消痞散結(jié)，為臣藥。水蛭為蟲類活血藥、破血逐瘀，為佐藥。合方共奏搜風(fēng)祛瘀通絡(luò)之功效。風(fēng)為百病之長，其性善行而數(shù)變；痰為百病之祟。風(fēng)藥善于宣暢氣機疏通血絡(luò)，消除瘀滯，尤其蟲類風(fēng)藥更以行走攻竄見長，善疏通經(jīng)絡(luò)壅滯，開啟孔竅閉塞，故能通利心絡(luò)，開通心竅，善止痹痛。近年來，隨著“痰邪致病”理論的深入認識，痰瘀互結(jié)被認為是冠心病的重要病機［5-6］。沈紹功［7］認為，冠心病的治療應(yīng)從活血化瘀、補氣活血向補氣祛痰、痰瘀同治進行轉(zhuǎn)變，提出痰濁虛證宜補氣祛痰，痰濁實證宜痰瘀同治。

本實驗研究結(jié)果表明搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯能有效干預(yù)AS斑塊的形成及破裂，其可能通過調(diào)節(jié)HO-1和HSP70的表達發(fā)揮作用。

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［3］ William Durante．Heine oxygenase-1 in growth control and its clinical application to vascular disease［J］．Journal of Cellular Physiology，2003，195（6）：373-382．

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［7］ 沈紹功.診治冠心病的新思路［J］.中國中醫(yī)急癥，1999，8（2）：51.

Study of Compound Soufeng Qutan Fang on Expression of Unstable Plaque HO-1 and HSP70 in ApoE Gene Knock-out Rats with Atherosclerosis

ZHOU Lingyun1，GONG Lihong2，ZHANG Shi1，et al. 1 Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110000，China；2 The First Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110000，China

Objective：To observe the effect of Compound Soufeng Qutan Fang on unstable plaque HO-1 and HSP70 in ApoE gene knockout rats with atherosclerosis.Methods：The successful model of the ApoE-gene knockout rats were given low dose，medium-dose，high-dose Chinese herbal compound and western medicine for a month.At the same time，the model group was fed by normal saline for one month.After treatment for 13 weeks，levels including HO-1 and HSP70 were detected by immunohistochemistry and RT-PCR technique.Results：Compared with the blank group，the HO-1 and HSP70 expression levels in the model group were reduced（P＜0.01）.Compared with the model group，these expressions were increased in the western medicine group and the Wenban Tang group（P＜0.01 or P＜0.05）.There were no statistical differences in the HO-1 and HSP70 expressions between the western medicine group and the Wenban Tang high-dose group（P＞0.05）.Conclusion：Compound Soufeng Qutan wenban Tang may stabilize plaques by regulating the expression of inflammatory factors and interfering the formation and rupture of AS plaque，which provides a new idea to prevent AS.

Compound Soufeng Qutan Fang；ApoE gene knockout rats；AS；Unstable plaque；HO-1；TLR4

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0387-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.004

2014-10-19）

中國博士后面上項目（20110491540）；遼寧省百千萬人才項目（2011921022）

△通信作者（電子郵箱：857190356@qq.com）