天香丹對動脈粥樣硬化穢濁痰阻證ApoE-/-小鼠的實驗研究*

馬文慧 安冬青

（新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011）

·研究報告·

天香丹對動脈粥樣硬化穢濁痰阻證ApoE-/-小鼠的實驗研究*

馬文慧 安冬青△

（新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011）

目的觀察天香丹對動脈粥樣硬化（AS）穢濁痰阻證ApoE-/-小鼠血脂水平、主動脈內(nèi)皮細胞的影響，探討其抗AS穢濁痰阻證的機制。方法將12只ApoE-/-小鼠正常對照組以普通飼料喂養(yǎng)，48只ApoE-/-小鼠以人工氣候箱模擬新疆寒燥環(huán)境，高脂飼料喂養(yǎng)12周建立AS穢濁痰阻證模型。造模成功后隨機分為天香丹組、阿托伐他汀組、荷丹片組、模型組，灌胃12周后處死，摘眼球取血測定血脂含量，取主動脈電鏡觀察病理學改變。結(jié)果與正常對照組比較，模型組小鼠血清TC、LDL-C含量上升，與模型組比較，天香丹組小鼠的TC、LDL-C含量下降，TG、HDL-C含量無顯著差異，透射電鏡觀察顯示天香丹組主動脈的內(nèi)皮細胞病變程度明顯輕于模型組。結(jié)論天香丹可有效降低AS穢濁痰阻證ApoE-/-小鼠TC、LDL-C含量，對動脈粥樣硬化形成有抑制作用。

動脈粥樣硬化 天香丹 穢濁痰阻證 血脂水平 內(nèi)皮細胞

動脈粥樣硬化（AS）是一種多種復雜因素作用于血管壁導致內(nèi)皮損傷后的一系列進展性病理變化過程，是造成缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)。天香丹具有補氣養(yǎng)血、活血化瘀和止血功能，有良好的耐缺氧、抗疲勞、抗老化和改善微循環(huán)等多方面作用。多年來一直在臨床中用于心腦血管疾病的治療［1］。本實驗在高脂飼料喂養(yǎng)和利用人工氣候箱模擬新疆寒燥環(huán)境建立AS穢濁痰阻證模型［2］基礎(chǔ)上研究天香丹對模型小鼠血脂水平、主動脈內(nèi)皮細胞的影響，為將此制劑用于臨床防治AS及相關(guān)疾病提供科學依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級ApoE-/-小鼠60只，雄性，8周齡，體質(zhì)量（18±2）g，均購自北京大學醫(yī)學部動物實驗室［動物質(zhì)量合格許可證號：SCXK（京）2011-0012］，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學動物實驗中心。

1.2 藥物 天香丹顆粒（新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院制劑室制備，批號：新藥制字ZO4000820）。阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，批號：03171 lk）。荷丹片（南昌濟順制藥有限公司，批號：20091210）。

1.3 儀器及試劑 202-2AB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；BIC400人工氣候箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），LEICA DM 2500光學顯微鏡（德國），膽固醇（美國AMRESCO公司），豬膽鹽（上海藍季科技發(fā)展有限公司），血脂四項試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司），JEM-100CX透射電鏡（日立公司）。

1.4 模型制備 12只ApoE-/-小鼠為空白對照組以普通飼料喂養(yǎng)，48只ApoE-/-小鼠以高脂飼料喂養(yǎng)和利用人工氣候箱模擬新疆寒燥環(huán)境建立AS穢濁痰阻證模型，高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料72.5%、豬油10%、蔗糖10%、豬膽鹽0.2%、膽固醇2%、丙硫氧嘧啶0.12%、蛋黃5%、21金維他0.1%。人工氣候箱系統(tǒng)溫度設(shè)定為（6±2）℃，相對濕度控制在25%～32.8%。喂養(yǎng)12周后，隨機從正常組抽取2只、造模組抽取8只ApoE-/-小鼠，進行主動脈組織標本檢查。造模組小鼠生物表征見行動遲緩，抑郁狀態(tài)，進食較少，舌質(zhì)多見暗紅或暗紫色，病理檢查見大量粥樣斑塊形成，管腔明顯狹窄，可見少量泡沫細胞，大量膽固醇結(jié)晶形成，證實AS穢濁痰阻證模型已制備成功。

1.5 分組及給藥 將40只ApoE-/-造模小鼠隨機分為天香丹組［2.7g/（kg·d）］、阿托伐他汀組［6.1mg/（kg·d）］、荷丹片組［0.67g/（kg·d）］、模型組。藥物干預組劑量均根據(jù)成人臨床常規(guī)用量等效換算為動物實驗用量［3］，藥物溶于蒸餾水，灌胃給藥，每日1次，繼續(xù)喂養(yǎng)12周。每周按體質(zhì)量調(diào)整藥物用量。正常對照組、模型組均給予蒸餾水0.2 mL/d?？瞻讓φ战M予普通飼料喂養(yǎng)，置于室溫（20～24℃、相對濕度40%～70%）；各組小鼠均自由飲水飲食，不限制活動。

1.6 標本采集與檢測 于灌胃12周末小鼠空腹12 h后依次進行以下操作：（1）將小鼠摘眼球取血0.8 mL置于EP管中，4℃，3500 r/min離心15 min，分離血清，-20℃保存用于血清學檢測，避免反復凍融。用半自動生化分析儀采用酶比色法檢測血清三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）。（2）分離主動脈瓣至髂腎動脈分支動脈組織，剪取長約1 mm主動脈弓，3%戊二醛前固定，0.2 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，1%四氧化餓固定2 h，0.2 mol/L磷酸緩沖液再沖洗3次，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制成超薄組織切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液染色，置于銅網(wǎng)上，在JEM-100CX透射電子顯微鏡下60～80 kV加速電壓，6000～20000放大倍率，觀察主動脈內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)變化，選取典型視野拍照用。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用LSD法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 天香丹對AS穢濁痰阻證ApoE-/-小鼠血脂水平的影響 見表1。由表1可見，與正常對照組比較，模型組小鼠的血清TC、LDL-C、HDL-C含量上升 （P＜0.01），與模型組比較，各用藥組血清TC、LDL-C含量下降（P＜0.01），TG、HDL-C含量無顯著影響。

表1 各組動脈粥樣硬化穢濁痰阻證ApoE-/-小鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組動脈粥樣硬化穢濁痰阻證ApoE-/-小鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別 n正常對照組 8模型組 8天香丹組 8 T C T G L D L -C H D L -C 1 1 . 8 7 ± 1 . 7 8 1 . 6 4 ± 0 . 1 9 5 . 0 9 ± 1 . 0 9 2 . 0 3 ± 0 . 8 6 3 6 . 6 6 ± 1 . 9 1*1 . 2 6 ± 0 . 1 9 3 3 . 0 8 ± 1 . 6 1*7 . 6 4 ± 0 . 9 8*3 2 . 0 4 ± 0 . 9 9△1 . 4 6 ± 0 . 1 6 1 8 . 7 6 ± 1 . 4 4△8 . 5 4 ± 1 . 3 5阿托伐他汀組 8 3 1 . 6 7 ± 2 . 1 9△1 . 6 0 ± 0 . 1 5 1 9 . 1 2 ± 2 . 3 9△8 . 3 9 ± 1 . 1 3荷丹片組 8 3 1 . 3 5 ± 0 . 7 1△1 . 2 3 ± 0 . 2 2 1 8 . 6 3 ± 1 . 7 2△8 . 8 5 ± 0 . 5 6

2.2 透射電鏡觀察 見圖1。（1）正常對照組：內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)改變正常，內(nèi)皮細胞為單層扁平細胞，連續(xù)性好，胞膜平整，胞漿均勻，緊貼內(nèi)彈性膜，內(nèi)皮細胞線粒體略腫脹，內(nèi)彈性膜連續(xù)，厚度均勻；中膜平滑肌排列整齊，平滑肌細胞微絲豐富。（2）模型組：鏡下內(nèi)皮細胞萎縮，腫脹，隆起，脫落，壞死。內(nèi)彈力膜破壞，呈乳頭狀增生，斑塊附近可見大量紅細胞；中膜平滑肌排列不整齊，形狀變多角形，可見較多泡沫細胞，色質(zhì)增多，脂滴增加，動脈中膜可見大量膠原纖維增生。（3）天香丹組：內(nèi)皮細胞略腫脹，結(jié)構(gòu)尚完整，內(nèi)彈力膜完全暴露，內(nèi)彈力膜完整，連接尚緊密；中膜呈纖維性增多，泡沫細胞增多，胞漿內(nèi)肌絲豐富，胞漿內(nèi)脂滴明顯減少，膽固醇結(jié)晶少見，結(jié)構(gòu)排列紊亂。（4）阿托伐他汀組：內(nèi)皮細胞略腫脹，基質(zhì)密度降低，管腔內(nèi)可見斑塊，斑塊內(nèi)可見膽固醇結(jié)晶，紅細胞聚集，斑塊內(nèi)可見紅細胞，纖維樣包裹形成；中膜平滑肌細胞排列基本整齊，呈多角形，平滑肌細胞腔質(zhì)角豐富，細胞器較豐富，彈力膜基本完整，內(nèi)膜下層增厚，可見少量泡沫細胞。胞漿內(nèi)可見脂滴，但膽固醇結(jié)晶少。（5）荷丹片組：內(nèi)皮細胞破壞、消失，內(nèi)膜可見巨大斑塊黏附于上，斑塊內(nèi)結(jié)晶樣結(jié)構(gòu)，結(jié)晶體泡沫細胞，纖維素樣聚集；中膜平滑肌數(shù)目減少，平滑肌細胞可見較多脂滴，平滑肌周圍可見膠原纖維增生，彈力膜排列紊亂。

3 討 論

流行病學調(diào)查顯示，降低血脂會減少冠心病的發(fā)病率。血脂升高可能增加脂核體積而加重斑塊不穩(wěn)定性的重要因素。因此，調(diào)節(jié)血脂水平是控制AS病變進展的措施之一。血管內(nèi)皮細胞層不僅是血液與組織間的屏障，而且是十分活躍的代謝及內(nèi)分泌器官，VEC結(jié)構(gòu)和功能的改變在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起十分重要的作用。近年來，Ross提出的“損傷反應”學說認為，VEC的損傷和功能失調(diào)是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)［4］。高脂血癥致AS的機制主要有：促使氧自由基產(chǎn)生，加速低密度脂蛋白（LDL）氧化及對內(nèi)皮細胞的損傷，導致內(nèi)皮細胞調(diào)亡或壞死［5］促進黏附分子表達，使血中單棱細胞更多地黏附于內(nèi)皮表面，向內(nèi)皮下游走［6］及促進泡沫細胞形成［7］，同時脂質(zhì)叉可在內(nèi)皮下沉積，而啟動AS過程［8］。動脈內(nèi)膜受損的形態(tài)學直接表現(xiàn)是內(nèi)皮細胞形態(tài)的改變。許多體內(nèi)外實驗證實，內(nèi)皮損傷時，內(nèi)皮細胞可釋放一些生長因子．引起復雜的生物學效應，最終導致動脈壁平滑肌細胞（SMC）增殖。管壁內(nèi)過量脂質(zhì)不易被清除，并被SMC、單接細胞吞噬，形成泡沫細胞［9］。

圖1 各組血管內(nèi)皮組織結(jié)構(gòu)（1500倍）

新疆地處我國西北部，少數(shù)民族聚集，氣候干燥寒冷，居民多食喜羊肉，奶制品等肥甘厚膩之品。多食肥甘易傷脾胃，運化失常，脾虛濕盛，燥傷津液，煉液成痰；痰邪凝結(jié)成塊，壅滯脈絡；寒邪入侵，氣機閉塞，則血運不暢，瘀血內(nèi)生，演變成以脾虛為本，痰瘀濕濁為標的穢濁痰阻證［10］。ApoE基因缺陷小鼠由于ApoE基因敲除后，造成血漿含膽固醇豐富的殘粒清除受阻，可出現(xiàn)高膽固醇血癥，并自發(fā)地形成纖維斑塊和復合斑塊，是進行AS發(fā)病機制和防治研究可靠的動物模型。實驗結(jié)果可見，與正常對照組比較，模型組小鼠血清TC、LDL-C含量上升，與模型組比較，各用藥組小鼠的TC、LDL-C含量下降，TG、HDL-C含量無顯著影響。透射電鏡顯示正常對照組內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)改變正常，內(nèi)皮細胞為單層扁平細胞，連續(xù)性好，胞膜平整，胞漿均勻，緊貼內(nèi)彈性膜，內(nèi)皮細胞線粒體略腫脹，內(nèi)彈性膜連續(xù)，厚度均勻。中膜平滑肌排列整齊，平滑肌細胞微絲豐富。模型組鏡下內(nèi)皮細胞脫落，壞死。內(nèi)彈力膜破壞，呈乳頭狀增生，斑塊附近可見大量紅細胞。中膜平滑肌排列不整齊，形狀變多角形，可見較多泡沫細胞，色質(zhì)增多，脂滴增加，動脈中膜可見大量膠原纖維增生。各用藥組主動脈的內(nèi)皮細胞病變程度明顯輕于模型組。

本實驗用藥后，從調(diào)節(jié)血脂、主動脈內(nèi)皮細胞完整性形態(tài)學方面顯示出天香丹對AS穢濁痰阻證ApoE-/ -小鼠動脈粥樣硬化形成有明顯的抑制作用，為將此制劑用于臨床防治AS及相關(guān)疾病提供了科學依據(jù)。

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Experimental Study of Tianxiang Dan on ApoE-/-mice with Atherosclerosis Huizhuo Tanzu Syndrome

MA Wenhui，AN Dongqing. College of traditional Chinese medicine，Xinjiang Medical University，Xinjiang，U-rumqi，830011，China

Objective：To observe the effect and the meachanism of Tianxiang Dan on atherosclerosis of Huizhuo Tanzu syndrome of ApoE-/-mice serum lipid levels and aortic endothelial cells.Methods：12 ApoE-/-mice in the normal control group，normal diet，48 ApoE-/-mice by feeding with high fat diet and the use of artificial climate box to simulate Xinjiang dry and cold environment and fed for 12 weeks to establish As Huizhuo Tanzhu syndrome model，the rats were randomly divided into Tianxiang Dan group，atorvastatin statins group，traditional Chinese medicine control group，model group.Intragastric administration for 12 weeks.The eyeball blood was collected to determine the content of lipid，the pathological changes were observed in aorta electron microscope.Results：Compared with the normal control group，model group mice increased serum TC and LDL levels.Compared with the model group，TC and LDL-C decreased in Tianxiang Dan group mice，TG，HDL content had no significant effect.TEM showed Tianxiang Dan group aortic endothelial cell lesion were significantly lighter than that of model group.Conclusion：Tianxiang Dan，effectively reducing AS Huizhuo Tanzhu syndrome mice of ApoE-/-TC and LDL-C，can inhibit the formation of atherosclerosis.

Atherosclerosis；Tianxiang Dan；Huizhuo Tanzu syndrome；Blood lipids；Endothelial cells

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0377-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.001

2014-12-23）

國家自然科學基金資助課題（81160428）

△通信作者（電子郵箱：andongqing@sina.cn）