三唑酮中間體片酚含量分析方法研究

陳 悅 劉 勇 張 平

（四川省危險(xiǎn)化學(xué)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川成都，610031）

引言

1－（4－氯苯氧基）－3，3－二甲基－2－丁酮作為合成農(nóng)藥殺菌劑三唑酮的中間體，俗稱片酚（以下簡(jiǎn)稱片酚）。國(guó)內(nèi)尚無(wú)統(tǒng)一的片酚含量分析方法標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)農(nóng)藥生產(chǎn)的質(zhì)量控制水平也存在較大差異。由于該物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)不太穩(wěn)定，高溫條件下容易分解，不能夠滿足氣相色譜法、分光光度法等試驗(yàn)條件，選擇高效液相色譜法，是因?yàn)樗哂袘?yīng)用范圍廣，分離度高，分離速度快，檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。高效液相色譜法中方法的選擇，主要是色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)，流動(dòng)相，柱溫及溶劑等的選擇。就以上幾方面的選擇作了大量的工作，得到大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并通過(guò)其精密度測(cè)定和回收率試驗(yàn)，證明此方法可行，從而找到片酚的最佳檢測(cè)方法。

經(jīng)科技查新，目前雖有采用高效液相色譜法檢測(cè)工業(yè)用片酚的含量的相關(guān)報(bào)導(dǎo)，但從其色譜條件來(lái)看，基本上采用的是氣相色譜法進(jìn)行分析，無(wú)論是穩(wěn)定性、分離效果還是準(zhǔn)確性都不夠理想，也未能在生產(chǎn)企業(yè)中推廣，更未形成技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。另外，也有采用離子對(duì)色譜法的報(bào)導(dǎo)，但因其在企業(yè)中應(yīng)用還不夠普及等問(wèn)題，故也存在推廣的問(wèn)題。

本項(xiàng)目主要從色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)，流動(dòng)相，柱溫及溶劑等的優(yōu)化選擇，作了大量的工作，得到最佳實(shí)驗(yàn)條件，并通過(guò)精密度測(cè)定和回收率試驗(yàn)，證明此方法的可靠性，確定了同時(shí)具有科學(xué)性和推廣意義的工業(yè)用片酚的高效液相色譜檢測(cè)方法并編制了地方標(biāo)準(zhǔn)草案。

1 實(shí)驗(yàn)條件及方法篩選

1.1 高效液相色譜法條件的選擇

1.1.1 色譜柱的選擇

在液相色譜分析方法中，反相柱的適用范圍比較大，適用于分離極性比較小的物質(zhì)，而正相柱一般分離光學(xué)異構(gòu)體和反相柱子不能分離的極性比較大的物質(zhì)。根據(jù)工業(yè)用片酚的非極性特性，我們擬采用反相柱進(jìn)行分離。在反相柱的選擇上，通常用到的固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠，相對(duì)于八烷基硅烷鍵合硅膠作固定相，十八烷基硅烷鍵合硅膠的碳鏈更長(zhǎng)，作固定相分離效果更好。故本方法在色譜柱的選擇上是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，柱長(zhǎng)25cm，柱內(nèi)徑4.6mm。

所以最終對(duì)色譜柱的選擇是：250mm×4.6mm（i.d）Agilent，5μm C18為填充物的不銹鋼柱。

圖1、圖2為比較C18柱和C8柱的色譜分離圖。相比之下，C18柱較C8柱分離效果更好，理論塔板數(shù)也更高。如圖1和圖2。

1.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)是高效液相色譜分析的重要條件。在波長(zhǎng)的選擇上采用兩種方法雙管齊下，先使用紫外掃描儀進(jìn)行紫外掃描，找到最大吸收波長(zhǎng)；再具體通過(guò)改變液相色譜儀的紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)，找到最大吸收波長(zhǎng)。具體而言，從210～300nm的檢測(cè)波長(zhǎng)中，逐級(jí)篩選，反復(fù)驗(yàn)證，縮小范圍，最終確認(rèn)波長(zhǎng)為227nm。在227nm波長(zhǎng)下，檢測(cè)工業(yè)用片酚靈敏度大，分析時(shí)所需的樣品量較小，可減少對(duì)色譜柱的污染，并且波長(zhǎng)的微小波動(dòng)不影響測(cè)定結(jié)果，因此，本標(biāo)準(zhǔn)方法選擇227nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在此波長(zhǎng)下，雜質(zhì)峰干擾小，線性范圍寬。如圖3、圖4和圖5。

圖1 C8柱（Plates：2289）分離色譜圖

圖2 C18柱（Plates：7269）分離色譜圖

圖3 λ＝220nm色譜圖

1.1.3 流動(dòng)相的選擇

圖4 λ＝227nm色譜圖

圖5 λ＝260nm色譜圖

在色譜柱已經(jīng)選擇好的情況下，流動(dòng)相的選擇就應(yīng)遵循其原則。因?yàn)樯V柱是用十八烷基硅烷鍵合硅膠作為固定相，它是一個(gè)弱極性鍵合固定相，那流動(dòng)相的極性就應(yīng)該大于固定相，這樣達(dá)到改善樣品中不同組分分離度的目的。筆者用乙腈＋水、甲醇＋水和甲醇＋乙腈＋水作比較，發(fā)現(xiàn)前后三種方法的峰面積響應(yīng)值雖然差別不大，以甲醇＋水為流動(dòng)相的理論塔板數(shù)較后兩者較低。以乙腈＋水和甲醇＋乙腈＋水作為流動(dòng)相峰面積差異不大，但后者的峰高更高，峰形更窄，峰的對(duì)稱性更好，理論塔板數(shù)更高，故確定在流動(dòng)相中加入一定量的甲醇。因甲醇在色譜柱中的黏度比乙腈大，而色譜柱要求保持低黏度來(lái)保證柱效，還要盡量不改變吸附劑的含水量，也就是不改變柱效，因而在三者的比例上，筆者經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，反復(fù)論證，最終確定流動(dòng)相條件為甲醇＋乙腈＋水＝35＋55＋10（V/V）。如圖6、圖7和圖8。

圖6 甲醇＋水＝85＋15（V/V）色譜圖

1.1.4 柱溫的選擇

圖7 甲醇＋乙腈＋水＝55＋15＋30（V/V）色譜圖

圖8 甲醇＋乙腈＋水＝35＋55＋10（V/V）色譜圖

溫度對(duì)C18柱的分離性能有顯著影響。我們的實(shí)驗(yàn)條件一定要保證在C18柱的工作溫度范圍內(nèi)，超出上限85℃或低于下限35℃都將對(duì)色譜柱造成損傷。柱溫的升高保留時(shí)間將會(huì)縮短，同時(shí)柱壓會(huì)隨之降低，升高溫度可減少固定相中慢傳質(zhì)過(guò)程所引起的譜帶展寬效應(yīng)，從而提高分離的效率。另外，升高溫度還能減小流動(dòng)相的粘度，使溶劑分子更容易滲入樹脂內(nèi)部，從而達(dá)到提高分辨率的目的。綜合上述因素考慮，最終確定溫度選定在40℃。

1.1.5 溶劑的選擇

片酚易溶于一些醇類，腈類，醚類，難溶于水。故筆者選擇了三種不同溶劑進(jìn)行比較：甲醇，乙腈，流動(dòng)相。從峰的面積，峰高，理論塔板數(shù)，對(duì)稱性等多方面考慮。綜合上述因素考慮，最終確定溶劑用乙腈。

1.1.6 色譜條件

綜合上述條件，工業(yè)用片酚分析方法條件是：

色譜柱：250mm×4.6mm（i.d）Agilent十八烷基硅烷鍵合不銹鋼硅膠柱；過(guò)濾器：濾膜孔徑約0.45μm；微量進(jìn)樣器：100μL；定量進(jìn)樣管：20μL流動(dòng)相：甲醇＋乙腈＋水＝35＋55＋10（V/V）；流速：1.5mL/min柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：20μL檢測(cè)波長(zhǎng)：227nm。

1.2 方法精密度試驗(yàn)

稱取標(biāo)品0.2克（精確至0.0002g）于50.00ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，吸取標(biāo)液1.00ml于50ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度。

分別稱取含工業(yè)用片酚0.2g的試樣（精確至0.0002g），置于1＃、2＃、3＃、4＃、5＃、6＃50mL容量瓶中，乙腈稀釋至刻度。吸取樣品溶液1.00ml于50ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度。按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定操作條件測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 工業(yè)用片酚精密度試驗(yàn)結(jié)果

從表1可以看出，本方法對(duì)工業(yè)用片酚測(cè)定的變異系數(shù)為0.27%，對(duì)工業(yè)用片酚有良好的精密度。

1.3 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱取數(shù)個(gè)已知含量的工業(yè)用片酚分別加入一定量的片酚標(biāo)準(zhǔn)品，按本方法測(cè)定其中的工業(yè)用片酚總質(zhì)量并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，本方法中工業(yè)用片酚平均回收率為99.92%，回收率在99.06%～101.33%之間，具有良好的的準(zhǔn)確度。

1.4 方法的線性關(guān)系試驗(yàn)

在一定質(zhì)量范圍內(nèi)，按照濃度遞增的順序配制數(shù)個(gè)樣品，配制6個(gè)不同質(zhì)量比片酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，然后以峰面積為橫坐標(biāo)，以片酚質(zhì)量縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，由圖1可以看出，工業(yè)用片酚的線性關(guān)系良好，分析方法可行，方法線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和圖9。

表2 工業(yè)用片酚回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 線性范圍的測(cè)定

從表3和圖9可以看出，當(dāng)工業(yè)用片酚的質(zhì)量濃度在0.0005～0.01mg/mL之間（進(jìn)樣體積10 μL），與相應(yīng)的峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9999，完全可以滿足定量分析要求。

圖9 工業(yè)用片酚峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系圖

2 結(jié)論

本文討論了用高效液相色譜法對(duì)工業(yè)用片酚進(jìn)行分離的方法，同時(shí)為工業(yè)用片酚的檢測(cè)提供了方法，并以此為依據(jù)制定了工業(yè)用片酚的地方標(biāo)準(zhǔn)。從試驗(yàn)結(jié)果看，在選定的液相色譜條件下，用本方法測(cè)定工業(yè)用片酚的分離和重現(xiàn)性都較好。該方法選用的液相色譜條件和參數(shù)都是可行的，方法精密度和準(zhǔn)確度都能滿足生產(chǎn)控制的要求，可作為工業(yè)用片酚的有效檢驗(yàn)方法，具有非常重要的意義。

［1］慕衛(wèi).戊唑醇、丙環(huán)唑和三唑酮的GC和 HPLC分析方法［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，2005，26（7）：1－3.

［2］秦金平.大口徑毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定三唑酮原藥［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（26）：11190－11191.

［3］王險(xiǎn).三唑酮原藥中主要雜質(zhì)的 GC－MS定性研究［J］.農(nóng)藥，2004，43（5）：212－213.