藍(lán)莓葉總黃酮的體外抗炎功效評(píng)價(jià)

趙 丹，蘇 寧，楊 麗，鄭洪艷，霍 彤，王昌濤,*

藍(lán)莓葉總黃酮的體外抗炎功效評(píng)價(jià)

趙 丹1，蘇 寧2，楊 麗2，鄭洪艷2，霍 彤1，王昌濤1,*

（1.北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京 100048；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

目的：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)方法從分子水平對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮的抗炎功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法：建立人永生化表皮細(xì)胞HaCaT與藍(lán)莓葉總黃酮的共培養(yǎng)體系，利用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)（0、15、30、60、120 min）白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon-inducible prot ein-10，IP-10）等炎癥細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)情況，觀察藍(lán)莓葉總黃酮的添加對(duì)這些基因表達(dá)的影響，并探討藍(lán)莓葉總黃酮在分子水平上的抗炎機(jī)理。結(jié)果：藍(lán)莓葉總黃酮的添加能夠提高抗炎因子IL-6、CXCR-2基因的表達(dá)量（P＜0.05），降低促炎因子IL-8、IP-10基因的表達(dá)量（P＜0.05），對(duì)CXCR-1基因的表達(dá)呈復(fù)雜型調(diào)節(jié)。結(jié)論：藍(lán)莓葉總黃酮通過(guò)對(duì)炎癥相關(guān)因子表達(dá)量產(chǎn)生影響，從而減弱促炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)抗炎癥反應(yīng)，最終發(fā)揮抗炎功效。

藍(lán)莓葉總黃酮；炎癥因子；反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；抗炎

由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所存在的倫理問(wèn)題以及國(guó)際上對(duì)動(dòng)物福利的日益關(guān)注，發(fā)展新的體外實(shí)驗(yàn)方法用以減少、優(yōu)化和替代（reduction, refinement, replacement，3R理論）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高以及重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物替代實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域發(fā)揮了日益重要的作用。此技術(shù)不僅避免了PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果和非特異性擴(kuò)增問(wèn)題，同時(shí)還能夠?qū)?biāo)本模板進(jìn)行精確定量[1-2]。

皮膚在受到外界藥物刺激后會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)。 在這個(gè)過(guò)程中，白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon-inducible protein-10，IP-10）等炎癥因子和趨化因子的相關(guān)基因表達(dá)會(huì)受到影響。IL-6能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能活性；IL-8是巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子，與其受體CXCR-1和CXCR-2結(jié)合而對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞趨化作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[3-5]。

本實(shí)驗(yàn)利用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)在人類永生化表皮細(xì)胞HaCaT培養(yǎng)體系中藍(lán)莓葉總黃酮的添加對(duì)這些細(xì)胞因子表達(dá)量的影響，從而進(jìn)一步對(duì)這些細(xì)胞因子的表達(dá)與皮膚炎癥反應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

HaCaT細(xì)胞，購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司。

DMEM低糖培養(yǎng)基、二甲基亞砜 德國(guó)Sigma公司；胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗（100×） 美國(guó)Corning公司。

1.2儀器與設(shè)備

WJ-80A-ⅡCO2培養(yǎng)箱 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、GeneAmp PCR System 9700美國(guó)ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Enduro水平電泳儀 美國(guó)Labnet公司；3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、1-14微型離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；SW-CJ-1D超凈工作臺(tái) 上海啟前電子科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶板、細(xì)胞凍存管 美國(guó)Corning/Costar公司。1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理

從-80℃冰箱中取出待用凍存的HaCaT細(xì)胞，迅速置于37℃水浴中解凍，在1～2 min內(nèi)輕微振動(dòng)使其融化。1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，在沉淀中加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）輕柔清洗兩次，加入200μL0.25%胰酶后放入CO2培養(yǎng)箱中消化5 min，放到顯微鏡下觀察，當(dāng)確認(rèn)細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落后，加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)液終止消化，800 r/min離心10 min，棄去上清液，加入4 mL培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以5×105個(gè)/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。

將消化后的HaCaT細(xì)胞以2×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，以60μg/mL質(zhì)量濃度藍(lán)莓葉總黃酮處理細(xì)胞0、15、30、60、120 min。

1.3.2細(xì)胞總RNA提取與檢測(cè)

待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%時(shí)，冰浴條件下，依次加入1 mL Trizol、0.2 mL氯仿，手搖振蕩2 min；4℃、8 000 r/min離心15 min，取上層水相，加入等體積異丙醇（約700μL），振蕩，靜置15 min；12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，向沉淀中加入1 mL 70%乙醇洗滌，8 000 r/min離心10 min；重復(fù)進(jìn)行1次乙醇洗滌；室溫條件下干燥15 min，加入40μL經(jīng)焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理的ddH2O，溶解10 min后于-80℃保存[6-7]。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA：將樣品和Marker加至凝膠上樣孔，180 V電壓電泳10 min。

1.3.3 cDNA第一鏈合成

使用TINAGEN FastQuantRTKit（含gDNase）FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組）進(jìn)行cDNA第一條鏈合成反應(yīng)。

1.3.4反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

1.3.4.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中發(fā)布的IL-6、IL-8、IP-10等基因的序列，通過(guò)Primer Express軟件設(shè)計(jì)特異性引物，同時(shí)設(shè)計(jì)管家基因β-actin的特異性引物，各基因的引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.4.2 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

以cDNA為模板，按照表2配制RT-qPCR反應(yīng)體系（使用前，在1 mL PrimeScriptRTEnzyme MIX中加入40μL的ROX Reference Dye），用ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)足到20μL，分析IL-6、IL-8、IP-10等基因的表達(dá)量。

表2 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系Table2 Real time fluorescence quantitative reverse transcription PCRTable2 Real time f reaction system stem

2 結(jié)果與分析

2.1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)

圖1為HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)貼壁前后形態(tài)比較，貼壁前HaCaT細(xì)胞為規(guī)則的圓球體狀，透明飽滿，且可隨培養(yǎng)液流動(dòng)。當(dāng)培養(yǎng)2～4 h以后，HaCaT細(xì)胞開始呈現(xiàn)出片層狀態(tài)貼壁生長(zhǎng)，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，其形態(tài)會(huì)因其所處培養(yǎng)空間大小的具體情況不同而變化；另一方面，隨著培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和HaCaT細(xì)胞自身生長(zhǎng)過(guò)程中代謝物的產(chǎn)生，培養(yǎng)液的顏色（隨pH值變化）和細(xì)胞中內(nèi)容物的顏色也與貼壁前的HaCaT細(xì)胞有了顯著的差別。這就決定了一定時(shí)間內(nèi)需要根據(jù)培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)板中HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)的具體情況，而定期換新鮮培養(yǎng)液或者進(jìn)行傳代培養(yǎng)，才能保證HaCaT細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)貼壁前（a）后（b）的形態(tài)（20×）Fig.1 HaCaT cells before (a) and after (b) attached culture (20 ×)

HaCaT細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求相對(duì)其他動(dòng)物細(xì)胞較為寬泛。HaCaT細(xì)胞增殖速率快，培養(yǎng)2～4 h即可貼壁，36 h左右需要進(jìn)行傳代。細(xì)胞快速地增殖會(huì)引起培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)被大量消耗，限制了細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)。因此，在考察藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞的影響時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)中選取培養(yǎng)時(shí)間分別為0、15、30、60、90、120 min，在以上6個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)添加藍(lán)莓葉總黃酮的HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行考察。

2.2 HaCaT細(xì)胞總RNA的提取

圖2 HaCaT細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of total RNA from HaCaT cells

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的HaCaT細(xì)胞RNA進(jìn)行完整性檢測(cè)。如圖2所示，28S rRNA與18S rRNA帶型清晰。另經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，所提取HaCaT細(xì)胞RNA的A260nm/A280nm介于1.8～2.0之間，RNA質(zhì)量高，完整性好，適于反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究[8]。

嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，以拉斐爾前派畫家之名而為人所熟知的羅塞蒂的拉斐爾前派創(chuàng)作期，至此已經(jīng)結(jié)束了。人們應(yīng)該看到，在拉斐爾前派那原本就模糊不清的理想幻滅之后，羅塞蒂繪畫中的逃亡意識(shí)開始明確：他在相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間里都使用古老的水彩作畫，并專注于但丁與比阿特麗絲等中世紀(jì)題材。

2.3 RT-qPCR炎癥因子特異性引物的檢測(cè)

利用設(shè)計(jì)的β-actin、IL-6和IL-8的引物對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，得到條帶單一的、片段大小與預(yù)期目的條帶大小一致的特異性引物，可進(jìn)行下一步RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)。

圖3 炎癥因子IL-6、IL-8特異性引物檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products with specific primers for β-actin, IL-6 and IL-8

2.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以HaCaT細(xì)胞為研究對(duì)象，考慮到其炎癥因子相關(guān)基因表達(dá)量變化的時(shí)間大多在2 h以內(nèi)[9]，并且綜合HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)情況，本實(shí)驗(yàn)選擇2 h以內(nèi)作為藍(lán)莓葉總黃酮處理HaCaT細(xì)胞的考察時(shí)間。

2.4.1藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞炎癥因子類基因表達(dá)的影響

2.4.1.1藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響

圖4 藍(lán)莓葉總黃酮處理不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞IL--66表達(dá)量的影響Fig.4 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on IL-6 expression

2.4.1.2藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-8表達(dá)的影響

圖5 藍(lán)莓葉總黃酮處理不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞IL--88表達(dá)量的影響Fig.5 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on IL-8 expression

藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-8表達(dá)量的影響如圖5所示，培養(yǎng)時(shí)間在15 min內(nèi)，HaCaT細(xì)胞IL-8表達(dá)量迅速下降，并在30 min內(nèi)保持緩慢下降的趨勢(shì)，在30～90 min內(nèi)又緩慢上升，但遠(yuǎn)小于空白組，而在90～120 min的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，IL-8表達(dá)量又有下降趨勢(shì)。整體來(lái)看，藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)IL-8基因表達(dá)的影響主要體現(xiàn)在培養(yǎng)0～15 min內(nèi)迅速抑制其表達(dá)，并在120 min的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)總體保持抑制其表達(dá)的作用。對(duì)不同時(shí)間段IL-8表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，培養(yǎng)至15、30 min時(shí)，HaCaT細(xì)胞IL-8表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），而培養(yǎng)至60～120 min時(shí)，IL-8表達(dá)量稍有回升，但仍顯著低于空白組（P＜0.05），這表明藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-8的表達(dá)具有抑制作用。IL-8在許多炎癥中具有聚集和激活T淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，局部產(chǎn)生的IL-8可以直接作用于表皮細(xì)胞，促進(jìn)慢性炎癥的發(fā)展[11]。IL-8表達(dá)量的升高會(huì)使大量中性粒細(xì)胞向炎癥區(qū)域聚集，釋放炎癥介質(zhì)而加重炎癥反應(yīng)[12-13]。藍(lán)莓葉總黃酮抑制了IL-8的表達(dá)，從而間接地抑制了炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

2.4.2藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞趨化因子相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.2.1藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCR-1和CXCR-2表達(dá)的影響

CXCR-1和CXCR-2是CXCR家族中的兩個(gè)重要成員，屬G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。CXCR-1和CXCR-2會(huì)表達(dá)在正常的人內(nèi)皮細(xì)胞表面，在急性炎癥反應(yīng)過(guò)程中，趨化因子能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子[14]。

圖6 藍(lán)莓葉總黃酮處理不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCR--11表達(dá)量的影響Fig.6 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on CXCR-1 expression

如圖6所示，添加藍(lán)莓葉總黃酮后，HaCaT細(xì)胞CXCR-1的表達(dá)量在培養(yǎng)15 min內(nèi)有明顯升高的趨勢(shì)，隨后的培養(yǎng)過(guò)程中，CXCR-1的表達(dá)量被間隔性地促進(jìn)和抑制，但總體水平都是高于空白組。對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間段HaCaT細(xì)胞CXCR-1表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，在培養(yǎng)的120 min內(nèi)，HaCaT細(xì)胞CXCR-1表達(dá)量的變化均不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCR-1的表達(dá)有一定促進(jìn)作用，但在促進(jìn)和抑制間存在一定的動(dòng)態(tài)平衡。

圖7 藍(lán)莓葉總黃酮處理不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCR--22表達(dá)量的影響Fig.7 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on CXCR-2 expression

如圖7所示，添加藍(lán)莓葉總黃酮后，HaCaT細(xì)胞CXCR-2的表達(dá)量在培養(yǎng)15 min內(nèi)有平緩的升高，在隨后培養(yǎng)的15～90 min內(nèi)，保持在較高的水平，而在培養(yǎng)的90～120 min內(nèi)，CXCR-2的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCR-2的表達(dá)是起促進(jìn)作用的。

2.4.2.2藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞IP-10表達(dá)的影響

圖8 藍(lán)莓葉總黃酮處理不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞IP-10表達(dá)量的影響Fig.8 Influence of treatment time by blueberry leaf extracts on IP-10 expression

如圖8所示，添加藍(lán)莓葉總黃酮后，HaCaT細(xì)胞IP-10表達(dá)量在培養(yǎng)15 min內(nèi)迅速下降，并且在90 min的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)保持在一個(gè)相當(dāng)?shù)偷乃健ｋm然在培養(yǎng)至90～120 min內(nèi)，HaCaT細(xì)胞IP-10表達(dá)量有一定的升高，但是與空白組相比仍是受到抑制的。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，培養(yǎng)至15、30 min時(shí)，HaCaT細(xì)胞IP-10表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而培養(yǎng)至60、90 min時(shí)，IP-10表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），到培養(yǎng)120 min時(shí)，IP-10表達(dá)量稍有回升，但仍顯著低于空白組（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)IP-10基因的表達(dá)具有抑制作用。

3 結(jié) 論

炎癥因子（IL-6、IL-8）和趨化因子（CXCR-1和CXCR-2、IP-10）是反映炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，在機(jī)體抗感染、抑病毒過(guò)程中起重要作用[15-16]。本實(shí)驗(yàn)將藍(lán)莓葉總黃酮與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)特定時(shí)間后，利用RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)炎癥因子和趨化因子的表達(dá)情況。結(jié)果表明，藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)IL-6和CXCR-2基因的表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)的作用，二者的表達(dá)量顯著增加。其中，IL-6通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)花生四烯酸的代謝而起到抗炎作用，CXCR-2通過(guò)與配體IL-8結(jié)合，啟動(dòng)中性粒細(xì)胞趨化反應(yīng)，募集中性粒細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)，對(duì)入侵的病原體發(fā)揮吞噬殺傷和清除作用。IL-8和IP-10基因的表達(dá)受到了明顯抑制，表達(dá)量大幅度降低，進(jìn)而抑制了炎癥的發(fā)生和發(fā)展。IP-10及其受體CXCR-3具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞能力，可促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌，作為趨化因子介導(dǎo)Thl型炎癥反應(yīng)[17-18]，藍(lán)莓葉總黃酮的添加抑制了HaCaT細(xì)胞中IP-10的表達(dá)，從而降低了炎癥反應(yīng)發(fā)生的概率。而藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)趨化因子CXCR-1的表達(dá)則呈現(xiàn)出復(fù)雜型調(diào)節(jié)的作用，表現(xiàn)為間歇性地促進(jìn)和抑制，因此，藍(lán)莓葉總黃酮具體的抗炎作用效果還有待研究。

綜合來(lái)看，在炎癥反應(yīng)中有諸多的炎癥因子和趨化因子參與到其中，這些因子之間相互作用，聯(lián)系緊密，網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)復(fù)雜多樣，所以其表達(dá)量的變化必然會(huì)相互影響[19-21]。整體來(lái)看，藍(lán)莓葉總黃酮的添加會(huì)促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)，抑制促炎因子的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗炎作用。但是藍(lán)莓葉總黃酮的具體抗炎機(jī)理到目前為止還不是很清楚，有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)利用RT-qPCR法對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮的抗炎功效進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，為保健品或藥食同源物質(zhì)的體外抗炎評(píng)價(jià)提供了新思路。

[1] GERMOLEC D R, YOSHIDA T, GAIDO K, et al. Arsenic induces overexpression of growth factors in human keratinocytes[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 1996, 141(1)∶ 308-318.

[2] WEISFELNER M E, GOTTLIEB A B. The role of apoptosis in human epidermal keratinocytes[J]. Journal of Drugs in Dermatology, 2003, 2(4)∶ 385-391.

[3] 魏晶, 李偉, 邵萬(wàn)平, 等. CXCR1/CXCR2拮抗劑G31P抗中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥作用研究[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2010(5)∶483-486.

[4] GRAS D, TIERS L, VACHIER I, et al. Regulation of CXCR/IL-8 in human airway epithelial cells[J]. International Archives of Allergy and Immunology, 2009, 152(2)∶ 140-150.

[5] HASHIZUME M, HIGUCHI Y, UCHIYAMA Y, et al. IL-6 plays an essential role in neutrophilia under inflammation[J]. Cytokine, 2011, 54(1)∶ 92-99.

[6] 蔣艷玲, 趙明, 梁功平, 等. 1,25-二羥維生素D3對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性及基因組DNA和增殖相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化水平的影響[J]. 中華皮膚科雜志, 2013, 46(12)∶ 885-888.

[7] 楊井, 陶娟, 李延, 等. 缺氧對(duì)HaCaT細(xì)胞HIF-1α, GLUT-1表達(dá)的影響及與細(xì)胞增殖的關(guān)系[J]. 中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志, 2009, 23(10)∶621-623.

[8] 湯三妹, 楊娟, 周秋蓮, 等. 獼猴桃RNA提取與RT-PCR[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2006(5)∶ 67-71.

[9] 吳德全. IL-15調(diào)控HaCaT細(xì)胞增殖及分化的研究[D]. 合肥∶ 安徽醫(yī)科大學(xué), 2012∶ 14-36.

[10] TCHERAKIAN C, RIVAUD E, CATHERINOT E, et al. Pulmonary arterial hypertension related to HIV∶ is inflammation related to IL-6 the cornerstone?[J]. Revue de Pneumologie Clinique, 2011, 67(4)∶250-257.

[11] 許樹長(zhǎng), 陳瑩, 王鋒, 等. IL-8及CXCR-1在反流性食管炎患者食管黏膜中的表達(dá)及意義[J]. 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)∶ 醫(yī)學(xué)版, 2007, 28(5)∶ 51-54.

[12] FITZGERALD R C, ONWUEGBUSI B A, BAJAJ-ELLIOTT M, et al. Diversity in the oesophageal phenotypic response to gastrooesophageal reflux∶ immunological determinants[J]. Gut, 2002, 50(4)∶451-459.

[13] ISOMOTO H, WANG A, MIZUTA Y, et al. Elevated levels of chemokines in esophageal mucosa of patients with reflux esophagitis[J]. The American Journal of Gastroenterology, 2003, 98(3)∶ 551-556.

[14] AKCAY A, NGUYEN Q, EDELSTEIN C L. Mediators of inflammation in acute kidney injury[J]. Mediators of Inflammation, 2009. doi∶ 10.1155/2009/137072.

[15] 張如峰, 楊桂文, 安利國(guó). 趨化因子及其受體在炎癥中作用的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際免疫學(xué)雜志, 2012, 35(3)∶ 191-196.

[16] 邢艷玲. IP-10對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠細(xì)胞因子表達(dá)影響的研究[D].天津∶ 天津醫(yī)科大學(xué), 2009∶ 15-31.

[17] FUENTE M, MIQUEL J. An update of the oxidation-inflammation theory of aging∶ the involvement of the immune system in oxiinflamm-aging [J]. Current Pharmaceutical Design, 2009, 15(26)∶3003-3026.

[18] 夏世金, 沈自尹, 董競(jìng)成. 老年大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸炎性衰老相關(guān)基因表達(dá)特征[J]. 老年醫(yī)學(xué)與保健, 2009, 15(1)∶ 7-9.

[19] 鄭梅竹. 羅布麻葉總黃酮抗抑郁作用及其機(jī)制研究[D]. 長(zhǎng)春∶ 吉林大學(xué), 2011∶ 40-106.

[20] SASAKI M, IKEDA H, SATO Y, et al. Proinflammatory cytokineinduced cellular senescence of biliary epithelial cells is mediated via oxidative stress and activation of ATM pathway∶ a culture study[J]. Free Radical Research, 2008, 42(7)∶ 625-632.

[21] BARTEK J, HODNY Z, LUKAS J. Cytokine loops driving senescence[J]. Nature Cell Biology, 2008, 10(8)∶ 887-889.

In vitro Anti-inflammatory Effect of Total Flavonoids from Blueberry Leaves

ZHAO Dan1, SU Ning2, YANG Li2, ZHENG Hongyan2, HUO Tong1, WANG Changtao1,*
(1. School of Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China)

Purpose∶ To evaluate thein vitroanti-inflammatory potential of total flavonoids from blueberry leaves. Methods∶a co-culture system of HaCaT cell and flavonoids were constructed. To examine the effect of flavonoids on the expression of inflammatory cytokines including interleukin 6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), and interferon induced protein 10 (IP-10), realtime reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the expression of the related genes after co-culture for different periods of time(0, 15, 30, 60, and 120 min). The anti-inflammatory mechanism of flavonoids from blueberry leaves was analyzed at the molecular level. Results∶ The total flavonoids from blueberry leaves significantly enhanced the expression of anti-inflammatory cytokines (IL-6andCXCR-2) (P＜ 0.05) and significantly inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines (IL-8,IP-10) (P＜ 0.05) to achieve the anti-inflammatory activity. Chemotactic factor receptorCXCR-1was regulated complicatedly. Conclusions∶ The total flavonoids from blueberry leaves could decrease inflammation by regulating the function of several gene loci via several steps.

total flavonoids from blueberry leaves; inflammatory cytokines; real-time reverse transcription PCR; anti-inflammatory

R966

1002-6630（2015）17-0231-05

10.7506/spkx1002-6630-201517043

2014-11-05

國(guó)家質(zhì)檢總局質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201310132；201410019）

趙丹（1988—），女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：zhaodanustb@126.com

*通信作者：王昌濤（1975—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锕πС煞珠_發(fā)應(yīng)用。E-mail：wangct@th.btbu.edu.cn