3 種抗氧化 劑對(duì)硅酸鈉脅迫下粉紅單端孢（Trichothecium roseum）孢子生存能力的保護(hù)作用比較研究

趙冠華，牛黎莉*，羅榮濤，段偉鵬，張 蓉，畢 陽(yáng)，張盛貴

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

3 種抗氧化 劑對(duì)硅酸鈉脅迫下粉紅單端孢（Trichothecium roseum）孢子生存能力的保護(hù)作用比較研究

趙冠華，牛黎莉*，羅榮濤，段偉鵬，張 蓉，畢 陽(yáng)，張盛貴

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

本實(shí)驗(yàn)研究了抗壞血酸（VC）、還原性谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和半胱氨酸（cysteine，Cys）3 種抗氧化劑分別作為預(yù)防劑和治療劑對(duì)硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液脅迫下粉紅單端孢（Trichothecium roseum）孢子存活力的保護(hù)作用。結(jié)果表明，3 種抗氧化劑均能使硅酸鈉脅迫下孢子的生存能力部分恢復(fù)，而使對(duì)應(yīng)pH值脅迫下孢子的生存能力80%恢復(fù)；3 種抗氧化劑中VC的保護(hù)效果要優(yōu)于GSH和Cys；3 種抗氧化劑作為預(yù)防劑的效果要優(yōu)于其治療效果。

抗氧化劑；硅酸鈉；生存能力

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是重要的果蔬采后病原物，可引起蘋果的霉心病[1]、甜瓜的粉霉病[2-3]、芒果的果腐病[4]以及其他多種果蔬的采后病害[5]。此外，該病原物還能產(chǎn)生對(duì)人和動(dòng)物有害的單端孢霉烯毒素[6-7]。目 前，對(duì)由T. roseum引起病害的控制主要采用異菌脲、嘧菌酯等化學(xué)合成的殺真菌劑[4]，但長(zhǎng)期使用不僅存在藥物殘留危害、污染環(huán)境、而且會(huì)增加病原物的抗藥性[8]。因此，亟需尋找新的、更為安全有效的控制方法。

據(jù)報(bào)道，硅酸鈉對(duì)多種采后病原物具有廣譜的抑菌活性，可抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)[9-13]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，硅酸鈉引起的細(xì)胞質(zhì)膜損傷可能與其誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生的過(guò)量活性氧（reactive oxygen spieces，ROS）有關(guān)。同樣，Qin Guozheng等[14]發(fā)現(xiàn)，用硼酸鹽處理擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）后，菌體內(nèi)有大量ROS積累，并促進(jìn)了蛋白質(zhì)的羰基化。用硼酸鹽處理的灰葡萄孢（Botrytis cinerea），發(fā)現(xiàn)菌絲細(xì)胞膜損傷，并伴有大量的內(nèi)容物滲漏。氯化鋁和焦亞硫酸鈉等鹽類能引起對(duì)鹽敏感真菌的細(xì)胞膜丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）含量和膜脂飽和程度的提高，使得膜脂過(guò)氧化[15]。外源抗氧化物VC和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）能使ROS脅迫條件下的菌體P. expansum中ROS保持正常的生理穩(wěn)態(tài)，并能修復(fù)由ROS引起的細(xì)胞損傷。但是，對(duì)硅酸鈉脅迫下外源抗氧化劑對(duì)孢子生存力保護(hù)效果的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用100 mmol/L硅酸鈉溶液和對(duì)應(yīng)pH值溶液處理T. roseum孢子，研究3種抗氧化劑對(duì)脅迫條件下孢子存活率的保護(hù)效果與處理時(shí)間的關(guān)系；以及不同添加方式對(duì)孢子的保護(hù)效果進(jìn)行比較；探討3種抗氧化劑對(duì)硅酸鈉脅迫下T. roseum孢子生存力的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

T. roseum為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后生物實(shí)驗(yàn)室保存。

NaOH 天津市大茂化學(xué)試劑廠；硅酸鈉、吐溫-80、抗壞血酸（VC）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、半胱氨酸（cysteine，Cys）、葡萄糖 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）、熒光染料 美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO） 美國(guó)Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Olympus BX61熒光顯微鏡 奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；振蕩培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；XH-B旋渦混合器 江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子的收集

取28℃條件下培養(yǎng)10 d的T. roseum平板，加入含體積分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫-80的無(wú)菌水，用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子，然后轉(zhuǎn)入50 mL三角瓶中，在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15 s，再用4層無(wú)菌紗布過(guò) 濾，濾液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)算出孢子懸浮液的濃度后，最后稀釋孢子懸浮液的濃度為1×106孢子/mL。

1.3.2 孢子生存能力的測(cè)定

參照Angelova等[16]的方法并修改，藥劑處理時(shí)，孢子懸浮液的濃度控制在約106孢子/mL左右，藥劑處理后，稀釋成104孢子/mL，吸取100 μL的孢子懸浮液，進(jìn)行凃板，平板為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基。每個(gè)處理5 個(gè)平板，在恒溫28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，記錄每個(gè)平板菌落形成數(shù)（CFU），求平均值。

1.3.3 硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液處理后孢子中內(nèi)源ROS的觀察

配制100 mmol/L的硅酸鈉溶液，用pH計(jì)測(cè)定硅酸鈉溶液在28 ℃條件下pH值為12.60，然后用10 mol/L的NaOH溶液調(diào)蒸餾水的pH值為12.60，得對(duì)應(yīng)pH值溶液，121 ℃條件滅菌20 min后，待用。取上述孢子懸浮液2 mL，8 000×g離心10 min，棄上清，分別用無(wú)菌水、滅菌后的硅酸鈉溶液以及對(duì)應(yīng)的pH值溶液各2 mL加入孢子中，28 ℃、150 r/min搖床中處理3 h，8 000×g離心5 min，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌3 次，用500 μL的PBS重懸細(xì)胞。T. roseum孢子內(nèi)源ROS的測(cè)定參照Qin Guozheng等[17]的方法并修改，每個(gè)離心管中添加熒光染料DCFH-DA（溶解在DMSO中，母液濃度為0.01 mol/L），使其終濃度為10 μmol/L，在28 ℃條件下孵育1 h后，真菌孢子在8 000×g離心5 min，并用PBS洗滌3 次。然后用熒光顯微鏡在激發(fā)光為藍(lán)色光下觀察發(fā)熒光的孢子數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.4 硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液對(duì)孢子存活率的影響

參照Avis等[18]的方法并修改，取上述孢子懸浮液2 mL，8 000×g離心10 min，棄上清，分別用無(wú)菌水、滅菌后的100 mmol/L的硅酸鈉溶液以及對(duì)應(yīng)的pH值為12.60的溶液各2 mL加入孢子中，28 ℃、150 r/min搖床中處理不同的時(shí)間（0、30 min、1 h、3 h、6 h、9 h），隨后進(jìn)行孢子存活率的測(cè)定。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.5 外源抗氧化劑作為預(yù)防劑對(duì)孢子存活率的保護(hù)

在上述無(wú)菌水、滅菌后的硅酸鈉、滅菌后的對(duì)應(yīng)pH值處理液中分別加 入3 種外源抗氧化劑VC、GSH和Cys，使抗氧化劑的終濃度達(dá)到100 μmol/L，待用。取上述孢子懸浮液2 mL，8 000×g離心10 min，棄上清，分別加入2 mL加了抗氧化劑的各溶液，28 ℃，150 r/min搖床中處理不同的時(shí)間（0、30 min、1 h、3 h、6 h、9 h），參照1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行孢子保護(hù)率的測(cè)定。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.6 外源抗氧化劑作為治療劑對(duì)孢子存活率的保護(hù)

同上述1.3.4節(jié)的方法處理孢子后，稀釋成104孢子/mL后，吸取100 μL涂布于分別含有100 μmol/L抗氧化劑（VC、GSH、Cys）的PDA培養(yǎng)基中，參照1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行孢子保護(hù)率的測(cè)定。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

全部數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液處理對(duì)孢子中ROS含量的影響

圖1 硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液對(duì)T. rosseeuumm分生孢子ROS的影響Fig.1 Effects of sodium silicate and corresponding pH on the production of reactive oxygen species in T. roseum spores

由圖1可知，與對(duì)照組相比，100 mmol/L硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液處理3 h后，孢子中內(nèi)源ROS含量均有所增加，且硅酸鈉處理后，發(fā)熒光的孢子的比率顯著高于對(duì)照和對(duì)應(yīng)pH值溶液處理。因此，認(rèn)為硅酸鈉引起T. roseum氧化脅迫要比對(duì)應(yīng)pH值溶液處理引起的氧化脅迫更嚴(yán)重。

2.2 硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液對(duì)孢子存活率的影響

圖2 硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液對(duì)T. roseum分生孢子處理不同的時(shí)間后對(duì)其存活率的影響Fig.2 Effects of sodium silicate and corresponding pH on spore viability of T. roseum

由圖2可知，100 mmol/L硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液處理對(duì)孢子存活均有抑制作用，但是硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液處理之間存在差異。當(dāng)處理時(shí)間在1 h以內(nèi)時(shí)，各處理對(duì)孢子的存活率影響變化不大；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子存活率顯著降低，且硅酸鈉處理顯著低于對(duì)照和對(duì)應(yīng)pH值溶液處理。在整個(gè)處理期間，對(duì)照組的孢子存活率保持穩(wěn)定。當(dāng)處理時(shí)間為9 h時(shí)，硅酸鈉處理的孢子的存活率僅為對(duì)照的5.9%，是對(duì)應(yīng)pH值溶液處理的12.8%。

2.3 3 種抗氧化劑作為預(yù)防劑對(duì)孢子保護(hù)率的影響

圖3 3 種外源抗氧 化劑對(duì)硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH處理的T. roseum孢子保護(hù)率的影響Fig.3 Effects of three exogenous antioxidants as protective agents on spore viability of T. roseum treated with sodium silicate and corresponding pH

由圖3可知，VC、GSH、Cys作為預(yù)防劑均能增加硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液處理的孢子的存活率，但存在差異。當(dāng)處理時(shí)間小于1 h時(shí)，3 種抗氧化劑對(duì)孢子的保護(hù)率的影響變化較小，這可能是由于藥劑短時(shí)間處理，對(duì)孢子的存活率影響變化也是較小的；當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)1 h時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其保護(hù)效果非常顯著。其中VC的保護(hù)效果最好，其次為GSH，最后為Cys。當(dāng)處理9 h時(shí)，抗氧化劑VC能使36%的孢子免受硅酸鈉的破壞，能使48%的孢子免受pH值溶液處理的破壞（圖3A）；GSH對(duì)其保護(hù)率分別為32%和40%（圖3B）；Cys分別為29%和38%（圖3C）。

2.4 3 種抗氧化劑作為治療劑對(duì)孢子治療率的影響

由圖4可知，3 種抗氧化劑VC、GSH和Cys對(duì)孢子的治療率均有顯著改善，但存在差異。當(dāng)處理時(shí)間低于1 h時(shí)，3 種抗氧化劑對(duì)孢子的治療率的影響變化較小；當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)1 h時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其治療效果非常顯著。VC的治療效果最好，GSH和Cys的治療效果相差不大。處理9 h時(shí)，抗氧化劑VC能挽救11%的孢子免受硅酸鈉的破壞，挽救28%的孢子免受對(duì)應(yīng)pH值溶液的破壞（圖4A）。抗氧化劑GSH的治療率分別為9.9%和25.6%（圖4B），Cys分別為9.3%和20.6%（圖4C）。

圖4 3 種外源抗氧化劑對(duì)硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH處理的T. roseum孢子治療率的 影響Fig.4 Effect of three exogenous antioxidants as therapeutic agents on spore viability of T. roseum treated with sodium silicate and corresponding pH

2.5 兩種不同添加抗氧化劑方式對(duì)提高孢子存活率的比較

圖5 抗氧化劑不同添加方式對(duì)硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液脅迫下的T. roseum seum分生孢子存活率的影響Fig.5 Comparative effects of three antioxidants as protective or therapeutic agents on spore viability of T. roseum treated with sodium silicate and corresponding pH

由圖5可知，兩種不同添加抗氧化劑方式對(duì)硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液脅迫下的孢子的存活率均有顯著影響，但之間存在差異。與硅酸鈉脅迫下的孢子相比，抗氧化劑能使pH值溶液脅迫下的孢子保持較高的存活率；而且將抗氧化劑作為預(yù)防劑的效果優(yōu)于治療劑。處理9 h后，VC（圖5A）、GSH（圖5B）和Cys（圖5C）作為預(yù)防劑時(shí)，硅酸鈉脅迫下的孢子的存活率分別為41.8%、37.8%和34.8%，而對(duì)應(yīng)pH值溶液脅迫下的孢子的存活率分別達(dá)到93.4%、85.4%和83.4%；作為治療劑時(shí)，硅酸鈉脅迫下的孢子的存活率分別為16.8%、15.7%和15.1%，而對(duì)應(yīng)pH值溶液脅迫下的孢子的存活率分別達(dá)到83.1%、82.1%和80%。但是，硅酸鈉處理的孢子，不管是何種添加方式，對(duì)其存活率只有部分的改善，最高也只能達(dá)到41.8%；而對(duì)應(yīng)pH值溶液處理，外源抗氧化劑能使T. roseum孢子存活率最低保持在80%的水平。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 mmol/L硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液處理的孢子中ROS含量明顯升高，且硅酸鈉引起的孢子的氧化脅迫要比對(duì)應(yīng)pH值溶液嚴(yán)重。同時(shí)硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液均使孢子的存活率顯著下降，但硅酸鈉的影響明顯高于對(duì)應(yīng)pH值溶液。外源抗氧化劑對(duì)硅酸鈉脅迫下的孢子的生存能力的保護(hù)效果要弱于對(duì)應(yīng)pH值溶液?？寡趸瘎┑奶砑臃绞?，預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。且3 種抗氧化劑，VC的效果要優(yōu)于GSH，GSH要優(yōu)于Cys。

在正常的生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)的ROS處于不斷產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡中，ROS不僅作為重要的信號(hào)分子參與細(xì)胞發(fā)育、分化和衰老等過(guò)程[19-21]。而且參與環(huán)境脅迫因子誘導(dǎo)的生理響應(yīng)過(guò)程，引起殺菌劑對(duì)菌體的毒害[22]，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[23]。活性氧的作用具有兩面性，當(dāng)其處于低濃度條件下往往作為信號(hào)分子參與細(xì)胞的生理調(diào)控，但濃度過(guò)高或長(zhǎng)時(shí)間在胞內(nèi)滯留，氧代謝失調(diào)，氧自由基動(dòng)態(tài)平衡被破壞，核酸、蛋白、脂質(zhì)和糖類等受到氧化并喪失正常的功能，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能可能會(huì)受到損傷甚至并出現(xiàn)死亡[24]。對(duì)微生物而言，都進(jìn)化成氧化脅迫響應(yīng)（oxidative stress response，OSR）機(jī)制來(lái)清除胞內(nèi)逐漸升高的ROS。而其中GSH、植物螯合肽、VC、多胺、黃酮類、生物堿和類胡蘿卜素等物質(zhì)是主要的氧化脅迫防御系統(tǒng)[20]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VC、GSH和Cys均能減輕硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液對(duì)分生孢子的損傷；而且無(wú)論是作為保護(hù)劑還是治療劑，VC的效果要優(yōu)于GSH和Cys，這可能和抗氧化劑的作用機(jī)理有關(guān)。VC作為抗氧化劑能通過(guò)一系列氧化還原反應(yīng)來(lái)直接清除H2O2[25]。而GSH和Cys是一種普遍存在的含硫醇還原劑，它可以通過(guò)還原細(xì)胞內(nèi)二硫鍵來(lái)保持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，保護(hù)例如外源性化學(xué)物質(zhì) 和重金屬等對(duì)細(xì)胞大分子的損傷[24]。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)外源抗氧化劑對(duì)硅酸鈉脅迫和對(duì)應(yīng)pH值溶液脅迫下的分生孢子的損傷均具有減輕作用，但是減輕程度，對(duì)應(yīng)pH值溶液要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于硅酸鈉。Liu Jia等[9]認(rèn)為硅酸鈉的抗真菌活性，與硅酸鈉的堿性直接相關(guān)。但是本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與100 mmol/L硅酸鈉溶液堿性相同的NaOH溶液脅迫下的孢子，添加抗氧化劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)其保護(hù)效果要遠(yuǎn)高于硅酸鈉脅迫的孢子。因此，推測(cè)硅酸鈉的抑菌效果可能與其堿性有一定的關(guān)系外，最主要可能和硅酸根離子直接相關(guān)。

抗氧化劑的添加方式，對(duì)孢子生存力的保護(hù)存在差異，這可能是由于作為預(yù)防劑時(shí)，對(duì)孢子產(chǎn)生的ROS能及時(shí)清除，能保護(hù)細(xì)胞膜或一 些蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)免受ROS的損傷，從而提高孢子的生存力；作為治療劑時(shí)，孢子已產(chǎn)生的ROS使細(xì)胞質(zhì)膜受損或已使蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)氧化損傷而發(fā)生不可逆變化，對(duì)其治療效果有限。因此，其預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。

綜上所述，外源抗氧化劑VC、GSH和Cys對(duì)硅酸鈉和對(duì)應(yīng)pH值溶液脅迫下的分生孢子的存活能力均具有一定的保護(hù)作用，預(yù)防效果優(yōu)于治療效果，而且VC的效果要優(yōu)于GSH和Cys；對(duì)硅酸鈉脅迫下的孢子的存活力只能部分恢復(fù)，而能使對(duì)應(yīng)pH值脅迫下的孢子的生存力80%恢復(fù)；因此，硅酸鈉對(duì)T. roseum的抑制效果除了與其改變環(huán)境pH值外，更多地涉及硅酸根離子的影響。至于硅酸根離子是如何影響菌體自身產(chǎn)生和清除ROS，以及抗氧化劑如何參與ROS的清除尚有待進(jìn)一步研究。

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Comparison of Protective Effects of Three Antioxidants on Spore Viability of Trichothecium roseum under Sodium Silicate Stress

ZHAO Guanhua, NIU Lili*, LUO Rongtao, DUAN Weipeng, ZHANG Rong, BI Yang, ZHANG Shenggui
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The protective effects of three antioxidants on spores ofTrichothecium roseumunder sodium silicate and corresponding pH stress were studied by comparing the spore viability. The results showed that all the investigated antioxidants enabled the sodium silicate-stressed spor es to restore partially their viability. Moreover, the viability of 80% spores under corresponding pH stress was restored. VC had better protective effect onTrichothecium roseumspores than GSH and Cys. The preventive effect of the three antioxidants was better than their therapeutic effect.

antioxidants; sodium silicate; spore viability

TS255.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201517036

2014-11-24

2013年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310733019）

趙冠華（1990—），男，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：lookgo@qq.com

*通信作者：牛黎莉（1979—），女，講師，博士研究生，研究方向?yàn)椴珊蠓栏捅ｕr。E-mail：niull@gsau.edu.cn