無水乙醇萃取聯(lián)合氧化鋁柱層析制備高純磷脂酰膽堿

宋范范，張康逸,*，張薇薇，何夢影

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所,河南 鄭州 450003；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭 州 450002)

無水乙醇萃取聯(lián)合氧化鋁柱層析制備高純磷脂酰膽堿

宋范范1，張康逸1,*，張薇薇2，何夢影1

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所,河南 鄭州 450003；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭 州 450002)

以大豆粉末磷脂為原料，采用無水乙醇萃取和氧化鋁柱色譜相結(jié)合的技術(shù)， 研究了高純度磷脂酰膽堿的制備方法。乙醇萃取后磷脂酰 膽堿的純度為62.00%，得率為31.94%。主要考察了柱層析過程中的固定相、洗脫液濃度、上樣量、料液比及洗脫液流速對分離效果的影響。結(jié)果表明:當(dāng)固定相為100～200 目三氧化二鋁、洗脫液為90%乙醇、上樣量為1 g/30 g、料液比為1∶12（g/mL）、 洗脫液流速為3.0 mL/min時(shí)，磷脂酰膽堿的純度可達(dá)到94.52%，回收率為83.71%。該研究結(jié)果為進(jìn)一步探討工業(yè)化制備磷脂酰膽堿的研究提供了技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支撐。

磷脂酰膽堿；柱色譜；氧化鋁；粉末磷脂

磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）俗稱卵磷脂，它是目前世界上公認(rèn)的最具有生物活性的磷脂，已被 廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健、化妝品、飼料等行業(yè)中[1-5]。但是，如何提高PC的純度問題一直制約著PC的應(yīng)用。大豆PC的純化方法主要分為溶劑萃取[6-8]、無機(jī)鹽沉淀[9]、超臨界CO2技術(shù)[10-12]、膜分離法[13]和柱層析法[14-15]等。溶劑萃取法溶劑用量和損耗過大，且存在毒性會對環(huán)境造成污染；無機(jī)鹽沉淀法雖然可以提高PC的純度，但會導(dǎo)致產(chǎn)品中無機(jī)鹽的殘 留量增加；超臨界技術(shù)雖具有綠 色無污染和產(chǎn)品純度高的優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備費(fèi)用過高，動力消耗大，不利于工業(yè)化生產(chǎn)[16]。綜合多種純化工藝，柱層析法在純化PC的工藝中效果最理想，故近年來很多磷脂工作者開始著力研究柱層析法純化PC的工藝[17]。

曹棟[18]考察了幾種不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液對氧化鋁柱層析制備高純度PC的影響，該研究未對柱層析過程中的影響因素進(jìn)行考察。郭勇等[19]采用無水乙醇浸提和氧化鋁層析柱結(jié)合法可從粉末磷脂中分離純化出純度達(dá)到90%的PC，其最佳工藝條件為浸提次數(shù)1 次，溶劑倍數(shù)4 倍，浸提溫度20 ℃，攪拌時(shí)間15 min，但實(shí)驗(yàn)也沒有深入研究固定相、上樣量、洗脫液流速及上樣濃度對提取效果的影響。張穎穎等[20]以大豆?jié)饪s磷脂為原料，用混合溶劑（正己烷-異丙醇-水）為流動相，研究了硅膠柱中PC的純化效果，當(dāng)固定相為100～200 目粗孔2號硅膠，正己烷-異丙醇-水（1∶1∶0.16，V/V），上載量0.086g PC/g硅膠時(shí)，產(chǎn)品中PC的純度可達(dá)到85%。但混合流動相的使用給溶劑的回收利用帶來了困難，使得這一方法很難應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。陳慧等[21]比較了中性氧化鋁和中性硅膠作為固定相時(shí)的分離效果，考察了原料濃度對純化效果的影響，未對其他因素的影響做出研究。王成濤[22]將冷凍結(jié)晶純化法得到的粗PC通過柱層析進(jìn)行純化分離得到高純度PC（≥90%），對影響PC純度的因素也進(jìn)行了考察，但未對產(chǎn)品與其他組分的分離效果進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合無水乙醇萃取和柱色譜技術(shù)對PC的分離純化進(jìn)行了研究，該萃取柱層析聯(lián)用的制備方法可降低直接使用粉末磷脂為原料進(jìn)行柱層析純化的負(fù)擔(dān)，并提高純化效果。通過綠色溶劑無水乙醇對粉末磷脂進(jìn)行萃取制備粗PC，然后使用柱層析對其進(jìn)行純化，并考察柱層析過程中的固定相、洗脫液濃度、上樣量、料液比及洗脫液流速對PC分離效果的影響。通過本研究的開展，以期為PC的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆粉末磷脂（純度≥96%，PC30%、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)25%、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)25%、溶血磷脂酰膽堿(lyso-phosphatidylcholine,LPC)0.5% 天津市博帥工貿(mào)有限公司；無水乙醇（分析純） 煙臺雙雙化工有限公司；甲醇（色譜純） 美國honeywell公司；氧化鋁（100～200 目） 上海五四化學(xué)試劑有限公司；硅膠（100～200 目） 青島海洋化工；層析柱（Φ15 mm×50 cm） 鄭州興華玻璃儀器廠。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；DHL-B電腦數(shù)顯定時(shí)恒流泵 上海滬西分析儀器廠；自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；SY-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 粗PC的制備

以大豆粉末磷脂為原料，在溶劑為無水乙醇、 溫度20 ℃、時(shí)間15 min、料液比1∶4（g/mL）的條件下進(jìn)行萃取，離心上清液并濃縮得到粗PC。

1.3.2 層析柱的制備

將活化過的氧化鋁加入無水乙醇制成漿狀,裝柱,洗滌,平衡。

1.3.3 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器條件

色譜柱型號:A g i l e n t Z O R B A X R X-S I L（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫:35℃；流速: 1.0 mL/min；流動相:A:甲醇，B:甲醇-水（8∶1，V/ V）；進(jìn)樣量5 μL。流動相:溶劑A（甲醇-水8∶1，V/ V），溶劑B（甲醇），流速1.0 mL/min；洗脫梯度: 0～10.0 min，60%～40% A；10.0～20.0 min，40% A；20.0～20.1 min，40%～60% A；20.1～25 min，60% A。

圖8 為總氮的分析結(jié)果，由圖8可以看出降雨開始時(shí)總氮為0.8mg/L，為Ⅲ類水體；降雨開始4小時(shí)后污染物濃度達(dá)到峰值1.4mg/L，為Ⅳ類水體；降雨開始6小時(shí)后，由于稀釋作用，基本恢復(fù)為Ⅲ類水體。之后隨著第二次降雨峰值的出現(xiàn)，水質(zhì)有一定的惡化?？傮w而言，降雨徑流對總氮的影響較小，一天中超過Ⅲ類水質(zhì)時(shí)間約為6小時(shí)，降雨徑流對總氮的濃度變化存在一定影響，但在可接受范圍內(nèi)。

單因素試驗(yàn):以自制粗PC為原料進(jìn)行柱層析，無水乙醇為洗脫液、上樣量0.5 g/30 g、料液比1∶12（g/mL）、洗脫液流速3.0 mL/min。固定其他條件，分別考察固定相（硅膠、氧化鋁）、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)（100%、95%、90%、85%、80%乙醇）、上樣量（0.5、1、2、4 g/30 g）、料液比（1∶16、1∶14、1∶12、1∶8（g/mL）、洗脫液流速（2.5、3.0、3.5、4.0 mL/min）對分離效果的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗PC的制備

圖1 原料粉末磷脂(A)與粗PC(B)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of soybean lecithin powder (A) and purified PC (B)

由于磷脂中各組分的結(jié)構(gòu)存在差異，故各種組分在同一種溶劑中的溶解度也會不同。PC在乙醇中的溶解度相對較大，而PI和PE的溶解度相對較低，因此采用乙醇萃取法可對PC進(jìn)行純化，得到純度相對較高的PC。從圖1可以看出，通過乙醇萃取，PC的純度可從26.13%提高到62.00%，提取率為31.94%。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 固定相對分離效果的影響

由于PC的分子質(zhì)量在600～700 D左右，分子體積比較大，故孔容較大的固定相對PC的分離效果會比較好[20]。且相關(guān)文獻(xiàn)指出氧化鋁對PI和PE的吸附性較強(qiáng)，用乙醇溶液難以洗脫[23]。故本研究考察了100～200 目的氧化鋁和硅膠為固定相時(shí)的分離效果。由圖2可知:氧化鋁做為固定相時(shí)，PC的洗脫譜帶分布較窄，且最初流出的洗脫溶液中PC的含量較高；而 采用硅膠做固定相時(shí)，PC的洗脫譜帶分布很寬，收集液中PC含量較少，且分離時(shí)間較長，不利于PC的收集。因此，本實(shí)驗(yàn)確定氧化鋁為最適固定相。

圖2 不同固定相下PC的洗脫曲線Fig.2 Elution curves of PC on different stationary phases

2.2.2 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對分離效果的影響

圖3 不同洗脫劑下的洗脫曲線Fig.3 Elution curves with different ethanol concentrations

由圖3可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，PC和PI的分離效果越來越好，體積分?jǐn)?shù)低于90%時(shí)，PC和PI的流出時(shí)間較早，二者分離效果不好，無水乙醇作為洗脫劑時(shí)，PC和PI的流出曲線拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重，不利于PC的收集和純化。當(dāng)采用90%的乙醇為洗脫劑時(shí)，PC和PI得到了較好地分離，且洗脫液中PC的含量較高，后續(xù)濃縮的PC樣品純度較高。這說明不同體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑下，被分離組分和固定相之間的作用力不同。隨著洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的降低，固定相氧化鋁對PC和PI的吸附作用降低，PC和PI的流出速度越快，流出時(shí)間越早。這可能是由于含水量較高時(shí)，洗脫劑與被分離組分的作用力要明顯大于固定相與被分離組分之間的作用力。因此，若要得到較高純度的PC，必須在適當(dāng)條件下將PC和PI的流出時(shí)間錯開。綜上所述:選用90%乙醇為最佳的洗脫劑。

2.2.3 上樣量對分離效果的影響

上樣量的多少對層析效果的好壞有很大的影響。一定條件下，洗脫劑、固定相和被分離樣品之間吸附作用存在平衡。若上樣量過小，一部分樣品會被固定相吸附，難以解吸下來，使樣品得率下降；若上樣量過大，會造成樣品出峰過早，不利于樣品各組分間的分離。

圖4 不同上樣量的洗脫曲線Fig.4 Elution curves with different loading amounts

由圖4可知，隨著上樣量的增加，PI和PC的流出曲線重疊現(xiàn)象比較嚴(yán)重，PC的分離效果逐漸變差，這一現(xiàn)象與秦孝敏的研究結(jié)果一致[24]。當(dāng)上樣量為0.5 g/30 g時(shí)，PI和 PC可以 得到明顯分離，但洗脫液中PC含量偏低；上樣量為2 g/30 g和4 g/30 g時(shí)，洗脫液中PC含量高，但PI和PC未被分開；上樣量為1 g/30 g時(shí)，PI和PC分離效果好，且所分離的PC含量高。綜上所述: 選用1 g/30 g為最佳上樣量。

2.2.4 料液比對分離效果的影響

圖5 不同料液比的洗脫曲線Fig.5 Elution curves with different loading concentrations

由圖5可知，不同料液比對PC的流出時(shí)間和洗脫譜帶的影響不大。當(dāng)料液比為1∶8（g/mL）時(shí)，洗脫液中PC含量 較低，這可能是因?yàn)樵摑舛葪l件下部分PC被氧化鋁固定相吸附，導(dǎo)致收集液中PC含量下降。為了便于后續(xù)濃縮和回收洗脫液，選用1∶12（g/mL）為最適料液比。

2.2.5 洗脫液流速對分離效果的影響

在利用柱層析分離樣品時(shí)，洗脫液流速應(yīng)低于被分離組分與固定相間的吸附解吸速度，而高于洗脫液在層析柱中的自然沉降速度。如果流速過大，被分離組分不能及時(shí)被固定相吸附就提前流出，這會導(dǎo)致所收集的組分純度下降；如果流速過小，會使被分離組分與固定相的吸附時(shí)間延長而不利于收集。

圖6 不同洗脫液流速的洗脫曲線Fig.6 Elution curves with differe nt flow rates

由圖6可以看出，隨著洗脫液流速的升高，PC的流出時(shí)間逐漸提前，即PC的保留時(shí)間縮短。然而，PC的響應(yīng)值和純度隨著流速的升高開始下降，這可能是由于流速較高時(shí)其他組分在層析柱中的保留時(shí)間相對縮短而過早流出造成。在流速為3.0 mL/min時(shí)，PC的響應(yīng)值較高且流出時(shí)間較早。故為了保證柱層析分離的效率，必須控制相對合適的洗脫流速。本實(shí)驗(yàn)選擇3.0 mL/min為最佳洗脫液流速。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用無水乙醇萃取和氧化鋁柱色譜相結(jié)合的技術(shù)，研究了高純度PC的制備方法。與他人[18,21]的分析法相比，本實(shí)驗(yàn) 采用的洗脫曲線能清晰表示出PC的洗脫效果，且萃取柱層析聯(lián)用的制備方法降低了直接以粉末磷脂為原料進(jìn)行柱層析純化的負(fù)擔(dān)，洗脫液經(jīng)檢測只含有PI和PC，分離效果明顯。然而，洗脫液中并未檢測到PE，原因可能是PE被固定相氧化鋁吸附不易被洗脫出來，這一推測已列入后續(xù)研究計(jì)劃當(dāng)中。乙醇萃取后PC的純度為62.00%，得率為31.94%。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)固定相為100～200 目氧化鋁、洗脫液為90%乙醇、上樣量為1 g/30 g、料液比為1∶12（g/mL）、洗脫液流速為3.0 mL/min時(shí)，PC的純度可達(dá)到94.52%，回收率為83.71%，該研究結(jié)果為進(jìn)一步工業(yè)化制備高純度PC提供了重要的數(shù)據(jù)參考。

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Preparation of Highly Purified Phosphatidylcholine by E thanol Extraction and Alumina Column Chromatography

SONG Fanfan1, ZHANG Kangyi1,*, ZHANG Weiwei2, HE Mengying1
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450003, China; 2. School of Food and Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China)

Phosphatidylcholine (PC) was purified from soybean lecithin powder by ethanol extraction and aluminum column chromatography. After the extraction, the purity and yield of PC were 62.00% and 31.94%, respectively. The influence of important chromatographic parameters such as stationary phase, ethanol concentration, loading am ount, solid-to-liquid ratio, and elution flow rate on separation effic iency was in vestigated. Highly p urified PC with a purity of 94.52% and a yield of 83.71% was obtained under the optimized conditions: alumina powder (100-200 mesh) as the stationary phase, elution with 90% ethanol at a flow rate of 3.0 mL/min, loading amount of 1 g/30 g, and solid-to-liquid ratio of 1:12 (g/mL). This study will hopefully provide technical support and data for industrial production of PC.

phosphatidylcholine; column chromatography; aluminum; soybean lecithin powder

TS229

A

10.7506/spkx1002-6 630-201510002

2014-07-23

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31301502)；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技基金項(xiàng)目(2013YQ25)

宋范范(1988—),女,碩士,主要從事脂質(zhì)科學(xué)研究。E-mail：1122yang@163.com

*通信作者：張康逸(1981—),男,副研究員,博士,主要從事脂質(zhì)科學(xué)研究。E-mail：kangyiz@163.com