阻斷TLR4信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞CT26裸鼠種植瘤生長(zhǎng)和凋亡的影響

何卉欣 蔣夢(mèng)萍 劉慧玲 江潔 尉秀清

阻斷TLR4信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞CT26裸鼠種植瘤生長(zhǎng)和凋亡的影響

何卉欣 蔣夢(mèng)萍 劉慧玲 江潔 尉秀清

目的研究阻斷Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26裸鼠種植瘤生長(zhǎng)和凋亡的影響。方法 建立結(jié)腸癌細(xì)胞CT26裸鼠種植瘤模型，12只鼠成瘤后隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，分別腹腔內(nèi)注射TLR4信號(hào)通路阻斷劑CLI-095（3 mg／kg）和相同公斤體積的二甲基亞砜（DMSO），并測(cè)定種植瘤的生長(zhǎng)曲線；種植瘤石蠟包埋切片作蘇木素-伊紅染色觀察病理組織學(xué)改變，TUNEL法檢測(cè)瘤組織凋亡情況，蛋白免疫印跡法檢測(cè)TLR4、cleaved caspase-3等蛋白表達(dá)。結(jié)果在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組瘤體體積為（2.39±0.32）cm3，對(duì)照組瘤體體積為（1.77±0.25）cm3，實(shí)驗(yàn)組瘤體顯著大于對(duì)照組（t＝3.817，P＝0.004）。實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞排列較致密，僅有局部壞死；對(duì)照組腫瘤細(xì)胞密度較低、排列散亂，壞死顯著。實(shí)驗(yàn)組癌組織凋亡指數(shù)為（9.86±2.80）%，明顯低于對(duì)照組的（22.57±4.93）%，t＝－7.091，P＜0.001。2組癌組織TLR4蛋白的表達(dá)無顯著差異，實(shí)驗(yàn)組cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照組。結(jié)論阻斷TLR4信號(hào)通路，可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26種植瘤細(xì)胞的凋亡，從而有利于腫瘤生長(zhǎng)。

結(jié)腸癌；TLR4；細(xì)胞凋亡；種植瘤

基礎(chǔ)研究論著

結(jié)腸癌是目前世界第三大常見惡性腫瘤，也是中國最常見的腫瘤及腫瘤相關(guān)死亡原因，但目前關(guān)于結(jié)腸癌的病因及其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了［1-2］。新近研究表明，先天性免疫在結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中起了非常重要的作用［3］。Toll樣受體4（TLR4）是一種非常重要的先天性免疫受體，其配體為外源性的脂多糖及內(nèi)源性的熱休克蛋白60等，不僅在免疫細(xì)胞上表達(dá)，近年來發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞上也有表達(dá)并表達(dá)上調(diào)，如結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、肝細(xì)胞等［4-7］。TLR4在結(jié)腸癌中的具體作用及作用機(jī)制仍未明確，本研究擬用TLR4信號(hào)通路阻斷劑CLI-095腹腔注射于小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26裸鼠種植瘤模型，觀察其對(duì)種植瘤的生長(zhǎng)和凋亡的影響，以期初步明確TLR4在結(jié)腸癌中的生物學(xué)作用，并探討其可能的作用機(jī)制［8］。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。

無特定病原體（SPF）級(jí)BALB／c Nude裸鼠12只，雄性，周齡5周，體質(zhì)量16～20 g，購自中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處理符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。

二、主要試劑

CLI-095（InvivoGen），蘇木素-伊紅染料（中杉金橋），TUNEL試劑盒（Recho），DMSO（Sigma），RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO），胎牛血清（GIBCO），0.025%胰蛋白酶（GIBCO），蛋白提取裂解液（EMD Millipore），蛋白質(zhì)定量試劑盒（GenStar），cleavedcaspase-3抗體（Abcam），TLR4抗體（Abcam），β-actin抗體（Abcam）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞傳代及培養(yǎng)

CT26于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，放于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，以0.025%的胰蛋白酶消化，含血清培養(yǎng)基停止消化，1∶3傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心取上清，并用無血清培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，制成2×106／ml的單細(xì)胞懸液。

2.成瘤小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?/p>

溫州方言的歷史面貌不見于或很少見于歷史文獻(xiàn)，甌越語方言語匯往往是歷史形成，世代口耳相傳，缺少書面文本，這也給語料收集、研究、匯錄增加了難度。盛教授為了寫這本書,通過大量的田野調(diào)查和文獻(xiàn)查詢，歷時(shí)近五年時(shí)間，比較全面地收集了甌越語成語、慣用語、歇后語、諺語等語匯。據(jù)粗略統(tǒng)計(jì)，全書共收集到甌語語匯4000多條，越語語匯3000多條。而這些材料是前人還沒有全面系統(tǒng)地收集、整理、研究過的，這為該書的寫作提供了豐富、翔實(shí)、可靠的語料。

小鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2組，每組6只。用一次性1 ml無菌注射器于每只小鼠右側(cè)腰部皮下接種0.2 ml CT26單細(xì)胞懸液，形成直徑約3 mm皮丘。待腫瘤出現(xiàn)肉眼可觀察后，隔天實(shí)驗(yàn)組腹腔注射3 mg／kg CLI-095（以DMSO為溶劑）［8］，對(duì)照組注射與實(shí)驗(yàn)組等公斤體積的DMSO溶液；同時(shí)觀察小鼠精神及飲食情況，測(cè)量2組小鼠腫瘤體積。計(jì)算腫瘤體積（v）的方法：v＝ab2／2 （a：腫瘤最大直徑，b：腫瘤最小直徑）。

3.標(biāo)本采集與處理

第21日，10%水合氯醛麻醉小鼠后并剝離種植瘤體。每組每個(gè)標(biāo)本取部分放入10%福爾馬林中固定制成石蠟標(biāo)本，其余保存于液氮中用于提取蛋白質(zhì)。

4.組織學(xué)分析及TUNEL檢測(cè)

病理標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，蘇木素-伊紅染色，觀察種植瘤生長(zhǎng)情況。按照Roche公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行TUNEL檢測(cè)，細(xì)胞核呈棕褐色為陽性染色。每張切片隨機(jī)選10個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)＝凋亡細(xì)胞數(shù)／腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%。

5.種植瘤蛋白提取及蛋白質(zhì)電泳

每組取約20 mg凍存的瘤組織，按蛋白質(zhì)提取裂解液說明書提取腫瘤組織總蛋白，并用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。分離蛋白并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜（PVDF膜）、封閉后，用相應(yīng)目的蛋白的抗體孵育，4℃冰箱搖床過夜，其中對(duì)總蛋白分別用抗TLR4、cleaved caspase-3、β-actin的一抗孵育。次日復(fù)溫30 min后，HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，暗房曝光。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用2組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、2組小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26種植瘤的觀察與比較

所有裸鼠接種后，均先后成瘤，成瘤率達(dá)100%，無自然死亡。成瘤期間，小鼠精神飲食可。肉眼見皮下種植瘤呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)硬，邊界清，表面可見豐富血管形成，不易推動(dòng)，向周圍浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。接種細(xì)胞第21日完整剝?nèi)》N植瘤，可見CLI-095實(shí)驗(yàn)組腫瘤的體積顯著大于對(duì)照組。接種腫瘤單細(xì)胞懸液第5日出現(xiàn)肉眼可見約為0.05 cm3種植瘤開始腹腔注射藥物，17 d以前2組小鼠種植瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第19日及第21日，實(shí)驗(yàn)組種植瘤體積分別為（1.74±0.35）cm3和（2.39±0.32）cm3，對(duì)照組種植瘤體積為（1.29 ±0.22）cm3和（1.77±0.25）cm3，實(shí)驗(yàn)組瘤體體積顯著高于對(duì)照組，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t第19日＝2.657，P＝0.03；t第21日＝3.817，P＝0.004），見圖1、2。

圖1 小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線

圖2 小鼠皮下種植瘤大體標(biāo)本

二、2組小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26種植瘤石蠟切片組織學(xué)情況及凋亡情況

蘇木素-伊紅染色可見2組鼠CT26結(jié)腸癌種植瘤細(xì)胞布滿視野，密集排列，無顯著腺體存在，癌細(xì)胞間有結(jié)締組織。腫瘤細(xì)胞異型性顯著，核大畸形、深染，胞質(zhì)少，大小不一，形狀不等，呈橢圓形，病理性核分裂像多見。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織壞死灶少，腫瘤細(xì)胞密度較高。TUNEL染色顯示凋亡信號(hào)散在于腫瘤組織。實(shí)驗(yàn)組凋亡指數(shù)為（9.86±2.80）%，顯著低于對(duì)照組的（22.57±4.93）%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－7.091，P＜0.001），實(shí)驗(yàn)組凋亡信號(hào)少呈淡褐色，對(duì)照組凋亡信號(hào)分布廣泛且呈深褐棕色（圖3）。

圖3 CT26結(jié)腸癌種植瘤石蠟切片組織學(xué)表現(xiàn)及凋亡情況（×200）

三、種植瘤組織中的TLR4及cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)

3組腫瘤組織蛋白免疫印跡法檢測(cè)，內(nèi)參照βactin為均一顯影的條帶，TLR4蛋白表達(dá)量無差異；實(shí)驗(yàn)組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低，這與TUNEL法檢測(cè)的結(jié)果趨勢(shì)相一致（圖4）。

圖4 結(jié)腸癌細(xì)胞CT26種植瘤相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)情況

討 論

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，各地流行病學(xué)資料顯示，結(jié)腸癌發(fā)病率及病死率均逐年上升。由于慢性炎癥是腫瘤一個(gè)非常重要的危險(xiǎn)因素，近年來研究發(fā)現(xiàn)，參與介導(dǎo)炎癥的TLR4可促進(jìn)炎癥相關(guān)結(jié)腸癌腫瘤發(fā)展；另一方面，促腫瘤細(xì)胞分泌炎癥因子逃避自然殺傷細(xì)胞核細(xì)胞毒性T細(xì)胞攻擊，進(jìn)而加強(qiáng)免疫逃逸作用［9-10］。但同時(shí)也有證據(jù)指出活化TLR4發(fā)揮著抗癌作用。在腫瘤發(fā)展中，TLR4促樹突狀細(xì)胞的成熟及自然殺傷細(xì)胞的活化，誘發(fā)或上調(diào)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤特異性免疫［11］。目前包括TLR4的配體內(nèi)毒素（LPS）以及另外2 種TLR4的激動(dòng)劑牛型結(jié)核桿菌卡介苗以及沙培林（OK-432）已被證明是治療結(jié)腸癌、胃癌和肺癌的有效藥物［12-15］。Eiró等［16］對(duì)104位結(jié)腸癌患者臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)TLR4的患者腫瘤復(fù)發(fā)率更低、生存期更長(zhǎng)。Li等［17］繁育轉(zhuǎn)基因APCMin／＋小鼠，其腸上皮細(xì)胞可持續(xù)表達(dá)活化TLR4，并發(fā)現(xiàn)此類轉(zhuǎn)基因小鼠較雜合小鼠自發(fā)腸道腫瘤率減少且腫瘤體積減小，誘導(dǎo)激活凋亡通路，抑制腫瘤的發(fā)展。以上研究表明，TLR4在腫瘤發(fā)展中的作用是非常復(fù)雜的，需要我們進(jìn)一步研究。

CLI-095是TLR4的特異性抑制劑，通過結(jié)合TLR4胞內(nèi)的Cys747位點(diǎn)從而阻斷TLR4信號(hào)通路，故本實(shí)驗(yàn)用CLI-095腹腔內(nèi)注射于CT26裸鼠種植瘤模型來探索體內(nèi)TLR4信號(hào)阻斷對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組瘤體顯著大于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組切片中，腫瘤細(xì)胞密度高成片排列，核大質(zhì)少，僅出現(xiàn)局部壞死；對(duì)照組切片中，腫瘤細(xì)胞密度較低、排列散亂，多見部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡或者核固縮，壞死顯著。TUNEL法發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組癌組織凋亡指數(shù)顯著低于對(duì)照組；蛋白免疫印跡法檢測(cè)表明，2組的TLR4表達(dá)未有顯著差異，而實(shí)驗(yàn)組cleaved caspase-3表達(dá)顯著低于對(duì)照組，這與TUNEL法的結(jié)果一致；這些結(jié)果均提示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是TLR4信號(hào)抑制種植瘤的作用機(jī)制之一。

綜上所述，在結(jié)腸癌細(xì)胞CT26裸鼠種植瘤模型上這一體內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件下，阻斷TLR4信號(hào)通路，可以抑制種植瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。這為闡明TLR4誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的分子信號(hào)機(jī)制提供了初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

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Effect of blocking TLR4 signaling pathway on the growth and apoptosis of tumors of colorectal cancer cell line CT26 implanted in nude mice

He Huixin，Jiang Mengping，Liu Huiling，Jiang Jie，Wei Xiuqing. Department of Gastroenterology，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China

ObjectiveTo investigate the effect of blocking TLR4 signaling pathway on the growth and apoptosis of the tumors of colorectal cancer cell line CT26 implanted in nude mice.Methods Twelve nude mouse models implanted with colorectal cancer cell line CT26 were established and randomly divided into the treatment and control groups.In the treatment group，the animals were injected with CLI-095（3 mg／kg），a TLR4 signaling pathway blocker and those in the control group were injected with the equivalent dose of DMSO.Growth curves of the implanted tumors were measured.Pathological changes of the implanted tumors were observed by HE staining.The apoptosis of the implanted tumors was detected by TUNEL staining.The expression levels of TLR4，cleaved caspase-3 and alternative proteins were determined by Western blot.ResultsMean tumor size in the treatment group was（2.39±0.32）cm3，significantly larger than（1.77±0.25）cm3in the control group（t＝3.817，P＝0.004）.The tumor cells in the treatment group were arranged at a high density and merely partial necrosis was observed，whereas those in the control group were distributed at a low density in disorder and severe necrosis was noted.In the treatment group，the apoptosis index of tumor tissues was（9.86±2.80）%，significantly lower compared with（22.57±4.93）%in the control group（t＝－7.091，P＜0.001）.The expression of TLR4 protein in tumor tissue did not significantly differ between two groups（P＞0.05），whereas the expression of cleaved caspase-3 protein in the treatment group was significantly lower than that in the control group.ConclusionBlocking TLR4 signal pathway can inhibit the apoptosis of the tumors of colorectal cancer cell line CT26 impalnted in nude mice and promote the growth of tumors.

Colorectal cancer；TLR4；Apoptosis；Implanted tumor

2014-12-06）

（本文編輯：楊江瑜）

10.3969／g.issn.0253-9802.2015.04.003

國家自然基金面上項(xiàng)目（81470848，81272640）

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科

，尉秀清，E-mail：wei-xiuqing＠163.com