四翅濱藜鹽脅迫應(yīng)答基因AcPsbQ1的克隆及其在酵母中的功能分析

孫新華，賈攀，張繼超，潘洪玉

吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，長春 130062

四翅濱藜鹽脅迫應(yīng)答基因AcPsbQ1的克隆及其在酵母中的功能分析

孫新華，賈攀，張繼超，潘洪玉

吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，長春 130062

光系統(tǒng)II亞基蛋白Q(Photosystem II subunit Q, PsbQ)是組成光系統(tǒng)II(PSII)復(fù)合體的重要外周蛋白之一，對(duì)維持PSII放氧活力起重要作用。在鹽脅迫下，高濃度的Na+和Cl-在葉綠體中積累會(huì)嚴(yán)重破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)，抑制光合作用，使植物生長緩慢。文章通過篩選鹽生植物四翅濱藜(Atriplex canescens) cDNA文庫，獲得一個(gè)在PSII中與放氧關(guān)系密切的放氧復(fù)合體蛋白基因PsbQ，命名為AcPsbQ1(GenBank登錄號(hào)：KJ027025)。AcPsbQ1基因開放閱讀框?yàn)?99 bp，編碼由233個(gè)氨基酸組成的前體蛋白。為了研究該基因的功能，文章克隆了AcPsbQ1基因并轉(zhuǎn)化至酵母中，高鹽和干旱脅迫處理實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn) AcPsbQ1基因酵母相比于野生型酵母對(duì)高鹽和干旱有更強(qiáng)的耐受力。為了進(jìn)一步研究AcPsbQ1是否參與植物抗逆應(yīng)答反應(yīng)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定AcPsbQ1在脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)變化。結(jié)果表明，用0.4 mol/L NaCl處理四翅濱藜12 h后，AcPsbQ1基因的表達(dá)量明顯高于未處理的對(duì)照，表明AcPsbQ1基因的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，同時(shí)，干旱脅迫也會(huì)提高AcPsbQ1基因的表達(dá)水平。上述結(jié)果表明該基因可能參與鹽生植物四翅濱藜的抗逆脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

四翅濱藜；AcPsbQ1；鹽誘導(dǎo)；酵母表達(dá)；qRT-PCR

鹽脅迫是植物生長發(fā)育的主要限制因子之一，會(huì)同時(shí)造成滲透脅迫和離子脅迫，二者聯(lián)合起來使植物體發(fā)生多種生理生化變化。大多數(shù)植物對(duì)鹽脅迫非常敏感，在鹽脅迫下，植物生長緩慢，高濃度的Na+和Cl-在葉綠體中積累，嚴(yán)重破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)，大大抑制光合作用，最終引起作物減產(chǎn)。植物通過調(diào)節(jié)相關(guān)的代謝途徑、激發(fā)自身體內(nèi)的分子信號(hào)傳遞從而形成新的離子平衡和滲透壓進(jìn)而提高植物自身對(duì)外界鹽脅迫的耐受力。在分子水平，高鹽脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物中耐鹽及其他脅迫信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生變化，提高植物體內(nèi)參與抗鹽脅迫的蛋白質(zhì)或其他小分子含量進(jìn)而增強(qiáng)其抗鹽性。近年來，將挖掘出的植物抗鹽基因通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)入植物從而提高植物的抗逆性已取得了很大的進(jìn)展。

四翅濱藜(Atriplex canescens)又稱灰毛濱藜，屬藜科濱藜屬，是世界干旱、半干旱地區(qū)的典型植物，有極強(qiáng)的耐鹽、干旱、低溫、堿等優(yōu)良特性；適生范圍廣泛，可作為優(yōu)良的鹽堿地改良品種，有生物吸鹽器之稱[1,2]。在鹽脅迫條件下，四翅濱藜能將吸收的鹽分積累到葉片表面形成一層白色屑狀物體，從而提高對(duì)高鹽的抗性。此外，SaiKachout等[3]報(bào)道由于四翅濱藜對(duì)Cu、Pb、Ni和Zn等重金屬離子具有較強(qiáng)的吸附能力，故可作為礦井和重金屬污染較嚴(yán)重地區(qū)良好的生物修復(fù)樹種。

光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)在高等植物完成光合作用的過程中發(fā)揮重要作用，其核心功能是將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。PSⅡ復(fù)合體可分為兩個(gè)功能域：(1)電子傳遞功能域，由PSⅡ核心、內(nèi)周捕光色素蛋白和外周捕光色素蛋白組成；(2)放氧復(fù)合體(Oxygen evolving complex，OEC)，PSⅡ的放氧復(fù)合體催化水分子的裂解，釋放出氧氣和質(zhì)子。在高等植物中，核基因PsbO、PsbP和PsbQ分別編碼PSⅡ的33 kDa、24 kDa和17 kDa放氧復(fù)合體蛋白(這3個(gè)蛋白也被稱為OEE1、OEE2和OEE3)，這3個(gè)外周蛋白位于PSⅡ囊腔側(cè)面，緊密結(jié)合在PSⅡ的錳簇周圍，起維持PSⅡ放氧活力的關(guān)鍵作用[4,5]。其中PsbQ編碼的17 kDa蛋白已在菠菜、小麥、水稻、玉米、擬南芥等多種植物中發(fā)現(xiàn)。研究表明，PsbQ蛋白通過調(diào)節(jié)放氧復(fù)合體與Ca2+、Cl-的結(jié)合從而優(yōu)化光氧化水釋放氧的過程[6～8]。最近，RNAi技術(shù)應(yīng)用到 PsbQ的功能研究。Yi等[9]證明當(dāng)光照不足時(shí)，擬南芥PsbQ蛋白對(duì)維持光系統(tǒng)Ⅱ的組裝和穩(wěn)定是必須的。擬南芥缺失PsbQ蛋白后，錳簇更容易從PSⅡ解離下來，同時(shí)不能有效的重新組裝到PSⅡ上，這導(dǎo)致了低光照條件下PSⅡ的有效數(shù)量不足進(jìn)而使光合作用受阻。本實(shí)驗(yàn)室以鹽生灌木四翅濱藜(A.canescens)為研究材料，前期構(gòu)建了鹽(0.4 mol/L NaCl)脅迫下四翅濱藜的全長cDNA文庫，通過測(cè)序獲得300余個(gè)ESTs[10]，其中分離得到一個(gè)PSⅡ中與放氧關(guān)系密切的放氧復(fù)合體蛋白AcPsbQ1的全長cDNA。本研究對(duì)四翅濱藜AcPsbQ1基因序列與表達(dá)特性等進(jìn)行了分析，同時(shí)模擬鹽脅迫和干旱脅迫，分析了轉(zhuǎn)AcPsbQ1基因酵母菌株對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性，初步探討了AcPsbQ1在四翅濱藜耐鹽過程中的功能。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌E.coli DH5α(本實(shí)驗(yàn)室保存)；釀酒酵母菌株INVSc1與表達(dá)載體pYES-DEST52(Invitrogen公司)；由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的文庫大腸桿菌菌株DH10B；Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 四翅濱藜AcPsbQ1基因全長cDNA的獲得及序列分析

提取用鹽(0.4 mol/L NaCl)脅迫處理2月齡的四翅濱藜莖葉RNA，進(jìn)而構(gòu)建全長cDNA文庫，通過Gateway重組到載體pYES-DEST52，以載體pYESDEST52上游引物 T7、下游引物 R為測(cè)序引物[10]，將片段長度超過1 000 bp的文庫克隆測(cè)序，其中獲得一個(gè)四翅濱藜編碼PsbQ蛋白的cDNA全長序列。

1.2.2 AcPsbQ1基因轉(zhuǎn)化酵母并進(jìn)行脅迫處理

將載體pYES-AcPsbQ1和空載體pYES-DEST52通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)至酵母菌株INVSc1，詳細(xì)的酵母轉(zhuǎn)化及檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[11]。

配制NaCl終濃度為1 mol/L、1.5 mol/L的鹽模擬脅迫固體培養(yǎng)基和山梨醇終濃度為 1.5 mol/L、2 mol/L的干旱模擬脅迫固體培養(yǎng)基。對(duì)驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)基因重組酵母INVSc1(pYES2-AcPsbQ1)和轉(zhuǎn)空載的對(duì)照酵母 INVSc1(pYES-DEST52)進(jìn)行鹽脅迫和干旱脅迫。將轉(zhuǎn)基因酵母和對(duì)照一起接種于葡萄糖終濃度為2%的SC-U液體培養(yǎng)基，200 r/min、30℃培養(yǎng)24 h，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液在600 nm波長處的吸光值OD600。取等量菌體離心，用含2%半乳糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體，并將OD600調(diào)為0.4，200 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)24 h后調(diào)整兩種重組酵母的OD600至2，將上述菌液分別稀釋0、10、100、1000、10000倍后，取2 μL菌液點(diǎn)在含脅迫劑的固體培養(yǎng)基(2%半乳糖)上，30℃培養(yǎng)3 d后，比較鹽脅迫和干旱脅迫條件下菌落的差異，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)AcPsbQ1基因表達(dá)水平

四翅濱藜在Hoagland(pH 5.8)培養(yǎng)液中水培2月后，用0.4 mol/L NaCl、20% PEG6000、0.2 mol/L NaHCO3和低溫(4℃)分別處理0、6、12、24和48 h后收集樣品，用Trizol 提取四翅濱藜總RNA。參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser)說明書進(jìn)行cDNA合成。以四翅濱藜管家基因Eukaryotic elongation factor1A(eEF1A)為內(nèi)參，引物序列為：

以合成的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。采用 2?ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcPsbQ1基因全長cDNA的獲得及序列分析

經(jīng)測(cè)序，獲得一個(gè)編碼四翅濱藜光系統(tǒng)PSII亞基Q的cDNA序列，故命名為AcPsbQ1。序列分析表明AcPsbQ1基因含有完整的開放閱讀框，為699 bp。該基因5′非編碼區(qū)為48 bp，3′非編碼區(qū)為115 bp，其中包括一個(gè)可能為多聚腺苷酸化信號(hào)的特征序列AATGAA序列，Poly A尾長23 bp。開放閱讀框起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼233個(gè)氨基酸。在ExPASY網(wǎng)站和NCBI在線分析可知，該氨基酸序列包括2個(gè)結(jié)構(gòu)域，N端第1～84氨基酸為轉(zhuǎn)運(yùn)肽，第85～233氨基酸為成熟蛋白。用蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)軟件WoLFPSORT(http://wolfpsort.seq.cbrc. jp/) 在線預(yù)測(cè)AcPsbQ1蛋白定位在葉綠體上。

AcPsbQ1轉(zhuǎn)運(yùn)肽由84個(gè)氨基酸組成，分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖 1)：第 1～52氨基酸為葉綠體導(dǎo)向結(jié)構(gòu)域(Chloroplast import domain, CID)，可以形成雙性β折疊(β-sheet forming domain 46～52)；第53～84氨基酸為包含疏水域(h domain 64～79)的類囊體轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(thylakoid transfer domain, TTD)。蛋白質(zhì)疏水性分析分別表明該蛋白N端轉(zhuǎn)運(yùn)肽疏水性較強(qiáng)，其切割位點(diǎn)前(第60～80氨基酸)有一段疏水性急劇變化的區(qū)域，成熟蛋白區(qū)域親水氨基酸分布均勻，屬親水性蛋白。

利用BioEdit和ClustalW程序?qū)?種不同植物的 PsbQ基因所編碼的前體蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析(圖 1)，結(jié)果表明 AcPsbQ1成熟蛋白與其他物種PsbQ成熟蛋白的同源性很高，但N端的轉(zhuǎn)運(yùn)肽保守性較低。將AcPsbQ1前體蛋白與已深入研究的植物PsbQ前體蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析和同源性分析，并用ClustalX和 MEGA4軟件繪制進(jìn)化樹，AcPsbQ1前體蛋白的氨基酸序列與菠菜(P12301.1)、海蓬子(ABQ23675.1)、擬南芥(At4g05180)、煙草(AAW80967.1) PsbQ前體蛋白序列相似性分別為87%、81%、73%、72%(圖1、圖2)。

圖2 AcPsbQ1與其他植物PsbQ蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 轉(zhuǎn)AcPsbQ基因重組酵母的鑒定與抗鹽、抗干旱性分析

釀酒酵母菌株 INVSc1是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，故可用 SC-U缺陷型培養(yǎng)基初步篩選獲得的轉(zhuǎn)化子，再將挑取的INVSc1(pYES2- AcPsbQ1)陽性克隆，以特異引物和載體上的通用引物進(jìn)行菌液 PCR鑒定，進(jìn)一步鑒定重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。

分別用高濃度的 NaCl和山梨醇模擬鹽脅迫和干旱脅迫，對(duì)陽性的重組酵母(pYES- AcPsbQ1)與對(duì)照酵母(pYES-DEST52)進(jìn)行鹽脅迫和干旱處理(圖3)。在含 1 mol/L NaCl的培養(yǎng)基上，重組酵母(pYESAcPsbQ1)與轉(zhuǎn)空載體(pYES-DEST52)酵母生長都受到抑制，當(dāng)培養(yǎng)基中的NaCl濃度升高至1.5 mol/L，兩種酵母生長被顯著抑制，但轉(zhuǎn)AcPsbQ1基因重組酵母長勢(shì)明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)空載體酵母，表明AcPsbQ1基因的轉(zhuǎn)入表達(dá)使轉(zhuǎn)基因重組酵母細(xì)胞對(duì)鹽脅迫的抗性明顯提高。轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)干旱脅迫的耐受力強(qiáng)于對(duì)高鹽的耐受力，干旱脅迫結(jié)果表明1.5 mol/L的山梨醇已顯著抑制了對(duì)照酵母的生長，而轉(zhuǎn) AcPsbQ基因酵母可以在脅迫培養(yǎng)基上正常生長。在2 mol/L山梨醇培養(yǎng)基上，對(duì)照酵母的存活率為零，而轉(zhuǎn)AcPsbQ1基因重組酵母仍有較高的存活率，表明AcPsbQ1基因表達(dá)后可以明顯提高酵母對(duì)干旱的抗性。

圖3 轉(zhuǎn)化酵母INVSc1(pYES-AcPsbQ1)和INVSc1 (pYES-DEST52)在鹽和干旱脅迫條件下的生長狀況

圖4 AcPsbQ1在逆境脅迫下的表達(dá)情況

2.3 AcPsbQ1基因的誘導(dǎo)表達(dá)特性

為了探究AcPsbQ1基因?qū)}脅迫和干旱脅迫的應(yīng)答響應(yīng)，對(duì)四翅濱藜幼苗用NaCl和PEG6000模擬鹽和干旱脅迫進(jìn)行了處理，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明(圖4)，在0.4 mol/L 的NaCl脅迫下，AcPsbQ1基因在四翅濱藜中的表達(dá)明顯受鹽誘導(dǎo)。在NaCl脅迫初期，AcPsbQ1基因表達(dá)量增加，隨后有所下降，但仍明顯高于對(duì)照，脅迫12 h后基因表達(dá)量達(dá)到最大，表明AcPsbQ1基因的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)。20%PEG誘導(dǎo)初期，AcPsbQ1基因略有下降，但脅迫24 h后基因表達(dá)量明顯升高。堿(0.2 mol/L NaHCO3)誘導(dǎo)初期AcPsbQ1基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，脅迫12 h后其表達(dá)量開始下降，低溫(4℃)刺激四翅濱藜6 h后，AcPsbQ1基因相對(duì)表達(dá)水平下降0.6倍，但12 h后基因表達(dá)水平又恢復(fù)至脅迫處理前水平，此后基本保持不變。

3 討 論

通過篩選四翅濱藜的全長cDNA文庫，獲得四翅濱藜抗性cDNA全長序列AcPsbQ1，該基因編碼PSⅡ亞基Q的前體蛋白，許多葉綠體蛋白都是在細(xì)胞質(zhì)中合成的較大的前體蛋白，利用N末端的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，跨膜運(yùn)輸進(jìn)入葉綠體內(nèi)行使功能[12]，PsbQ前體蛋白作為葉綠體蛋白也是如此。其前體的N端帶有一段含有84個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，該轉(zhuǎn)運(yùn)肽包含葉綠體導(dǎo)向結(jié)構(gòu)域CID和類囊體轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域TTD。PsbQ蛋白作為高等植物放氧復(fù)合體的一部分，但不是PSⅡ放氧功能的必需蛋白[13]。最近的研究表明 PsbQ蛋白在維持PSⅡ的結(jié)構(gòu)完整性、增強(qiáng)PSⅡ?qū)Νh(huán)境適應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用。研究表明，PsbQ蛋白可以穩(wěn)定其他外周蛋白與PSⅡ的結(jié)合，Kakiuchi等[14]證明PsbQ與PsbO和PsbP存在互作關(guān)系，并且可以恢復(fù)N端缺失的 PsbP蛋白與 PSⅡ的結(jié)合能力。同時(shí)，PsbQ、PsbO和PsbP一起參與和維持外周捕光色素蛋白復(fù)合體(主要指LHCII復(fù)合體)的完整性，確保PSⅡ的光能吸收過程順利進(jìn)行[15]。Allahverdiyeva等[16]發(fā)現(xiàn)擬南芥 PsbQ缺失突變體通過影響短期協(xié)調(diào)機(jī)制而改變光合機(jī)構(gòu)對(duì)變化環(huán)境的適應(yīng)能力，如PsbQ蛋白缺失植株的非光化學(xué)猝滅過程和狀態(tài)轉(zhuǎn)換的速率發(fā)生明顯了變化。

鹽害是植物生長過程中一種重要的非生物脅迫，高濃度的直接破壞PSⅡ的結(jié)構(gòu)，使其光合作用受阻。同時(shí)，鹽脅迫降低PSⅡ光反應(yīng)中心D1蛋白及其他相關(guān)蛋白的合成速率進(jìn)而抑制植物自身對(duì)PSⅡ的修復(fù)[17,18]。研究表明鹽脅迫能提高PsbQ基因的轉(zhuǎn)錄水平。Sugihara等[19]用凝膠雙向電泳技術(shù)研究紅樹鹽脅迫下蛋白的差異表達(dá)時(shí)，檢測(cè)出一些鹽脅迫應(yīng)答蛋白，其中就包括PsbQ，該研究認(rèn)為PsbQ和PsbP一起維持NaCl脅迫下PSⅡ的活性。在高濃度的鹽脅迫條件下(150 mmol/L NaCl)，PsbQ和PsbP亞基很容易與 PSⅡ發(fā)生解離，PsbQ基因轉(zhuǎn)錄水平的升高被認(rèn)為是可能參與PSⅡ的修復(fù)與重裝進(jìn)而保證放氧復(fù)合體放氧能力[20]。當(dāng)受到高鹽和干旱刺激后，四翅濱藜AcPsbQ1基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，表明該基因參與四翅濱藜的鹽、干旱脅迫應(yīng)答過程。qRTPCR結(jié)果表明，AcPsbQ1基因?qū)A(0.2 mol/L NaHCO3)和低溫(4℃)刺激的應(yīng)答比較微弱，基因表達(dá)水平略有下降。

真核生物的一些耐鹽相關(guān)基因具有功能保守性，高等植物的抗逆脅迫應(yīng)答及其信號(hào)分子傳遞的分子機(jī)制與酵母細(xì)胞具有一定的相似性[21]。同時(shí)，很多從植物中分離出來的的抗逆相關(guān)基因在酵母中表達(dá)后可以明顯提高酵母細(xì)胞對(duì)鹽脅迫的耐受力[22]。因此利用簡單的酵母系統(tǒng)來分離鑒定高等植物功能保守的抗性基因是行之有效的快捷途徑。PsbQ蛋白作為光系統(tǒng)Ⅱ的主要成分可以維持高鹽脅迫下PSⅡ的完整性，通過提高光合作用和加強(qiáng)代謝來增強(qiáng)植物抗逆性[23]。Banieka等[24]利用酵母表達(dá)系統(tǒng)篩選馬鈴薯高溫脅迫相關(guān)的抗逆基因，其中包括11個(gè)與光合作用密切相關(guān)的基因，如光系統(tǒng)Ⅱ亞基蛋白 R(PsbR)、葉綠素 a/b結(jié)合蛋白(Cab)等，這些從馬鈴薯中篩選出來的與光合作用相關(guān)的基因在酵母中過表達(dá)均提高了酵母細(xì)胞對(duì)高溫的抗性。本研究中，AcPsbQ1在酵母中直接表達(dá)提高了酵母對(duì)鹽和干旱脅迫的抗性，表明PsbQ可能直接參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，但其在植物抗逆反應(yīng)過程的具體作用和機(jī)制還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]李敬濤, 余剛, 陳宣明, 范臻, 劉金亮, 潘洪玉. 四翅濱藜 AcDHN基因的克隆及其抗逆功能分析. 植物生理學(xué)報(bào), 2012, 48(7): 676-682.

[2]余剛, 李敬濤, 孫新華, 劉金亮, 潘洪玉. 四翅濱藜LRR類受體蛋白激酶基因在酵母中的表達(dá)及抗逆分析.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版), 2012, 5(6): 1257-1263.

[3]Kachout SS, Leclerc JC, Mansoura AB, Rejeb MN, Ouerghi Z. Effects of heavy metals on growth and bioaccumulation of the annual halophytes: Atriplex hortensis and A. rosea. J Appl Sci Res, 2009, 5(7): 746-756.

[4]Ido K, Nield J, Fukao Y, Nishimura T, Sato F, Ifuku K. Cross-linking evidence for multiple interactions of the PsbP and PsbQ proteins in a higher plant photosystem Ⅱsupercomplex. J Biol Chem, 2014, 289(29): 20150-20157.

[5]Liu HJ, Zhang H, Weisz D A, Vidavsky I, Gross ML,Pakrasi HB. MS-based cross-linking analysis reveals the location of the PsbQ protein in cyanobacterial photosystem Ⅱ. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(12): 4638-4643.

[6]?kerlund HE, Jansson C, Andersson B. Reconstitution of photosynthetic water splitting in inside-out thylakoid vesicles and identification of a participating polypeptide. Biochim Biophys Acta, 1982, 681(1): 1-10.

[7]Kuwabara T, Murata T, Miyao M, Murata N. Partial degradation of the 18-kDa protein of the photosynthetic oxygen-evolving complex: a study of a binding site. Biochim Biophys Acta, 1986, 850(1): 146-155.

[8]Ghanotakis DF, Babcock GT, Yocum CF. Calcium reconstitutes high rates of oxygen evolution in polypeptide depleted photosystem Ⅱ preparations. FEBS Lett, 1984, 167(1): 127-130.

[9]Yi XP, Hargett SR, Frankel LK, Bricker TM. The PsbQ protein is required in Arabidopsis for photosystem II assembly/stability and photoautotrophy under low light conditions. J Biol Chem, 2006, 281(36): 26260-26267.

[10]Li JT, Sun XH, Yu G, Jia CG, Liu JL, Pan HY. Generation and analysis of expressed sequence tags(ESTs) from halophyte Atriplex canescens to explore salt-responsive related genes. Int J Mol Sci, 2014, 15(6): 11172-11189.

[11]孫新華, 李敬濤, 劉言志, 賈承國, 潘洪玉. 四翅濱藜AcERF1基因的克隆及其在酵母中的抗逆分析. 植物生理學(xué)報(bào), 2013, 49(8): 811-816.

[12]Robinson C, Kl?sgen RB. Targeting of proteins into and across the thylakoid membrane: a multitude of mechanisms. Plant Mol Biol, 1994, 26(1): 15-24.

[13]Ifuku K, Sato F. A truncated mutant of the extrinsic 23-kDa protein that absolutely requires the extrinsic 17-kDa protein for Ca2 +retention in photosystem Ⅱ. Plant Cell Physiol, 2002, 43(10): 1244-1249.

[14]Kakiuchi S, Uno C, Ido K, Nishimura T, Noguchi T, Ifuku K, Sato F. The PsbQ protein stabilizes the functional binding of the PsbP protein to photosystem Ⅱ in higher plants. Biochimica et Biophysica Acta, 2012, 1817(8): 1346-1351.

[15]Allahverdiyeva Y, Suorsa M, Rossi F, Pavesi A, Kater MM, Antonacci A, Tadini L, Pribil M, Schneider A, Wanner G, Leister D, Aro EM, Barbato R, Pesaresi P. Arabidopsis plants lacking PsbQ and PsbR subunits of the oxygen-evolving complex show altered PSⅡ super-complex organization and short-term adaptive mechanisms. Plant J, 2013, 75(4): 671-684.

[16]Ifuku K. The PsbP and PsbQ family proteins in the photosynthetic machinery of chloroplasts. Plant Physiol Biochem, 2014, 81: 108-114.

[17]Allakhverdiev SI, Nishiyama Y, Miyairi S, Yamamoto H, Inagaki N, Kanesaki Y, Murata N. Salt stress inhibits the repair of photodamaged photosystem Ⅱ by suppressing the transcription and translation of psbA genes in Synechocystis. Plant Physiol, 2002, 130(3): 1443-1453.

[18]Murata N, Takahashi S, Nishiyama Y, Allakhverdiev SI. Photoinhibition of photosystem Ⅱ under environmental stress. Biochimica Biophysica Acta, 2007, 1767(6): 414-421.

[19]Sugihara K, Hanagata N, Dubinsky Z, Baba S, Karube I. Molecular characterization of cDNA encoding oxygen evolving enhancer protein 1 increased by salt treatment in the mangrove Bruguiera gymnorrhiza. Plant Cell Physiol, 2000, 41(11): 1279-1285.

[20]Tada Y, Kashimura T. Proteomic analysis of salt-responsive proteins in the mangrove plant, Bruguiera gymnorhiza. Plant Cell Physiol, 2009, 50(3): 439-446.

[21]Nylander M, Heino P, Helenius E, Palva ET, Ronne H, Welin BV. The low temperature and salt induced RCI2A gene of Arabidopsis complements the sodium sensitivity caused by a deletion of the homologous yeast gene SNA1. Plant Mol Biol, 2001, 45(3): 341-352.

[22]Kanhonou R, Serrano R, Palau RR. A catalytic subunit of the sugar beet protein kinase CK2 is induced by salt stress and increases NaCl tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Plant Mol Biol, 2001, 47(5): 571-579.

[23]Roose JL, Wegener KM, Pakrasi HB. The extrinsic proteins of Photosystem Ⅱ. Photosynth Res, 2007, 92(3): 369-387.

[24]Gangadhar BH, Yu JW, Sajeesh K, Park SW. A systematic exploration of high-temperature stress-responsive genes in potato using large-scale yeast functional screening. Mol Genet Genomics, 2014, 289(2): 185-201.

(責(zé)任編委: 賴錦盛)

Cloning and characterization of a salt responsive gene AcPsbQ1 from Atriplex canescens

Xinhua Sun, Pan Jia, Jichao Zhang, Hongyu Pan
College of Plant Science, Jilin University, Changchun 130062, China

PsbQ is an extrinsic subunit of the photosystem II in eukaryotic photosynthetic organisms. Numerous studies have demonstrated that PsbQ can stabilize the inorganic cofactors and enhance the oxygen release in PSII. The decrease of photosynthesis rate under salinity condition is normally attributed to the high concentration of injurious ions, such as Na+and Cl-, which accumulate in the chloroplast and damage thylakoid membrane under salinity stress. In this study, AcPsbQ1 was isolated from a halophyte Atriplex canescens cDNA library. The AcPsbQ1 contains anopen reading frame of 699 bp encoding a 233 amino acid protein. In order to investigate its function, AcPsbQ1 was cloned and transformed into Saccharomyces cerevisiae INVSc1. The heterologous expression of AcPsbQ1 in transgenic yeast significantly helped to increase the adapting and recovery ability of yeast cells under the salt and drought. Quantitative real-time PCR assay was performed to reveal the expression pattern of AcPsbQ1 under different abiotic stresses. On exposure to NaCl stress, the transcript level of AcPsbQ1 was significantly enhanced. AcPsbQ1 expression level was also up-regulated under drought stress. These results indicated that AcPsbQ1 might involve in the response to salt stress in A. canescens.

Atriplex canescens; AcPsbQ1; salt stress response; yeast expression; qRT-PCR

2014-07-15;

2014-10-26

吉林省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)研發(fā)項(xiàng)目(編號(hào)：2013C001)，農(nóng)業(yè)部抗病蟲轉(zhuǎn)基因大豆新品種培育項(xiàng)目(編號(hào)：2013ZX08004004)和國家科技支撐計(jì)劃課題項(xiàng)目(編號(hào)：2014BAD14B02)資助

孫新華，碩士研究生，專業(yè)方向：真菌分子生物學(xué)與植物抗逆及抗病基因工程。E-mail: xinhua_sun@126.com

潘洪玉，教授，研究方向：植物病原真菌分子生物學(xué)、抗病基因工程及抗逆基因工程以及植物病害生物防治。E-mail: panhongyu@jlu.edu.cn

10.16288/j.yczz.2015.01.012

時(shí)間： 2014-11-5 10:17:55

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141105.1017.002.html