應(yīng)用SSA報(bào)告載體提高ZFN和CRISPR/Cas9對(duì)豬IGF2基因的打靶效率

吳金青，梅瑰，劉志國(guó)，陳瑤生，叢佩清，何祖勇

1. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

應(yīng)用SSA報(bào)告載體提高ZFN和CRISPR/Cas9對(duì)豬IGF2基因的打靶效率

吳金青1，梅瑰2，劉志國(guó)1，陳瑤生1，叢佩清1，何祖勇1

1. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006；
2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

IGF2(Insulin-like growth factor 2)基因作為最復(fù)雜多樣的生長(zhǎng)因子之一，對(duì)豬胎兒發(fā)育以及出生后生長(zhǎng)發(fā)育和肌肉生成起著非常重要的作用。通過(guò)基因組編輯技術(shù)對(duì)我國(guó)本地豬種的IGF2基因作精確的遺傳修飾，對(duì)于提高本地豬種的瘦肉率具有重要的育種意義。文章在藍(lán)塘豬胎兒成纖維細(xì)胞(Porcine fetal fibroblasts, PEF)中檢測(cè)了鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)和CRISPR/Cas9對(duì)IGF2基因的打靶效率，結(jié)果表明CRISPR/Cas9 對(duì)IGF2基因的切割效率最高可達(dá)9.2%，顯著高于ZFN的切割效率(<1%)，但兩者均未達(dá)到作為體細(xì)胞核移植(Somatic nuclear transfer, SCNT)供體細(xì)胞所需的打靶效率。應(yīng)用SSA (Single-strand annealing)報(bào)告載體篩選技術(shù)來(lái)富集IGF2基因被ZFN和CRISPR/Cas9修飾過(guò)的PEF細(xì)胞，結(jié)果表明，該技術(shù)可使CRISPR/Cas9的打靶效率提高5倍左右，對(duì)ZFN的打靶效率具有更大的增強(qiáng)作用。

IGF2基因；ZFN；CRISPR/Cas9；SSA報(bào)告系統(tǒng)

胰島素樣生長(zhǎng)因子2(或者類胰島素生長(zhǎng)因子2) (Insulin-like growth factor 2, IGF2)[1]，又稱為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素(Somatomedin A)，是目前所知功能最復(fù)雜多樣的生長(zhǎng)因子之一。作為一種胚胎生長(zhǎng)因子，IGF2不僅在胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是一種促有絲分裂肽，對(duì)機(jī)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，并能刺激腫瘤細(xì)胞的增殖。研究表明，豬IGF2基因內(nèi)含子3的3072[2]位點(diǎn)發(fā)生單堿基突變(G→A)會(huì)引起 IGF2基因的抑制因子 ZBED6[3]的蛋白表達(dá)量下調(diào)，進(jìn)而提高IGF2基因的表達(dá)水平，對(duì)促進(jìn)豬肌肉形成具有重要調(diào)控作用。該位點(diǎn)的突變與瘦肉率存在相關(guān)性，可增加3%～4%的瘦肉量。通過(guò)近年來(lái)迅速發(fā)展的基因組編輯技術(shù)對(duì)本地豬種的 IGF2基因內(nèi)含子3的3072位點(diǎn)進(jìn)行精確的G→A點(diǎn)突變操作，在基因組中不引入任何其他的外源DNA序列，這樣可以使本地豬種保持基因組的“純度”，最大限度地保留了其肉質(zhì)優(yōu)良、口感好等優(yōu)良性狀，又能特異地提高其瘦肉率，對(duì)于改良和利用本地豬種資源具有重要的育種意義。

通過(guò)傳統(tǒng)的同源重組方法獲取基因打靶豬不僅工作量大而且效率低下?；蚪M編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶技術(shù)[4](Zinc finger nucleases, ZFN)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)技術(shù)[5]以及 CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9[6, 7]技術(shù)的出現(xiàn)，極大地提高了基因定點(diǎn)修飾的效率和精確性。其中 ZFN和TALEN都是蛋白導(dǎo)向型的基因組編輯技術(shù)，前者通過(guò)一種鋅指蛋白結(jié)構(gòu)識(shí)別基因組序列，后者通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子類似物蛋白識(shí)別基因組序列，兩者都是借助FokⅠ核酸內(nèi)切酶對(duì)靶基因進(jìn)行非特異性切割的基因組編輯技術(shù)。與ZFN和TALEN不同，CRISPR/Cas9技術(shù)是一種RNA導(dǎo)向型的基因組編輯技術(shù)[8]，是由細(xì)菌和古生菌中一種被稱為 CRISPR/Cas的獲得性免疫系統(tǒng)改造而來(lái)。CRISPR位點(diǎn)由一系列保守的重復(fù)序列組成，重復(fù)序列之間被短的間隔序列(Spacer)隔開(kāi)。依靠該免疫系統(tǒng)，細(xì)菌或古細(xì)菌中 Cas核酸酶將入侵的外源DNA切割成小片段，作為間隔序列整合到自身基因組中的 CRISPR位點(diǎn)上，隨后以間隔序列作為模板轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的 CRISPR RNA (crRNA)，crRNA 進(jìn)一步與 trans-activating crRNA (tracrRNA)結(jié)合形成 tracrRNA:crRNA復(fù)合體，用來(lái)引導(dǎo) Cas核酸內(nèi)切酶降解入侵的噬菌體或質(zhì)粒[9]。通過(guò)人工設(shè)計(jì)，可以將tracrRNA和crRNA這兩種RNA改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA (short guide RNA)，足以引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA的定點(diǎn)切割。sgRNA可以構(gòu)建到帶有U6啟動(dòng)子的載體上，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得表達(dá)。構(gòu)建不同的sgRNA表達(dá)載體時(shí)，只需要替換其中20 bp的gRNA序列即可，而不像ZFN和TALEN，需要重新設(shè)計(jì)和組裝與DNA結(jié)合的蛋白序列，使CRISPR/Cas9技術(shù)具有操作更加簡(jiǎn)便和成本更低的優(yōu)勢(shì)。上述3種基因組編輯技術(shù)使基因定點(diǎn)遺傳修飾變得相對(duì)簡(jiǎn)單高效，不僅被應(yīng)用于制備小鼠和斑馬魚等模式動(dòng)物基因敲除模型[8]，而且已經(jīng)成功地用于制備基因敲除豬[10]。

目前應(yīng)用基因組編輯技術(shù)制備基因敲除豬主要有兩種途徑。第一種方法是將表達(dá)ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9的mRNA通過(guò)顯微注射的方法[10]注入豬原核期受精卵當(dāng)中，再通過(guò)胚胎移植的方法獲得基因敲除豬；第二種方法是先制備基因敲除豬胎兒成纖維細(xì)胞系(Porcine fetal fibroblasts, PEF)，然后通過(guò)體細(xì)胞核移植的方法獲得基因敲除豬。第一種方法可以較為快速地獲得基因敲除豬，但是基因敲除豬的遺傳修飾類型、性別和遺傳背景難以控制；而采用第二種方法，不僅可以預(yù)先確定遺傳修飾類型和性別，而且可以獲得遺傳背景完全一樣的基因敲除豬。雖然ZFN和CRISPR/Cas9具有較強(qiáng)的基因組編輯能力，但是多數(shù)情況下，它們的活性往往不夠高，影響獲取基因敲除的PEF細(xì)胞系。因此，需要一種方法可以有效篩選基因組已被修飾過(guò)的細(xì)胞。在HEK293等永生細(xì)胞系中，通過(guò)應(yīng)用SSA(Single-strandannealing)報(bào)告載體[11]以及 Surrogate報(bào)告載體[12]可以有效富集基因組被ZFN和TALEN修飾的細(xì)胞。但是目前還未見(jiàn)關(guān)于在PEF等原代細(xì)胞中應(yīng)用該技術(shù)的報(bào)道。

本研究在PEF細(xì)胞中比較了ZFN和CRISPR/Cas9對(duì)豬IGF2基因打靶效率，并分析了這兩種基因組編輯技術(shù)介導(dǎo)的基因修飾類型的差異性。通過(guò)構(gòu)建SSA報(bào)告系統(tǒng)，利用 T7EⅠ實(shí)驗(yàn)和TA克隆測(cè)序分析方法證明該報(bào)告系統(tǒng)可以顯著提高 ZFN和CRISPR/Cas9對(duì)豬IGF2基因的打靶效率，為今后獲取IGF2定點(diǎn)修飾豬進(jìn)行了有益探索。

1 材料和方法

1.1 材料

藍(lán)塘豬胎兒成纖維細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室分離建立。PX330 (sgRNA/Cas9表達(dá)質(zhì)粒)購(gòu)自Addgene(北京中原公司代理，貨號(hào)：#42230)。pEGFP-SSA載體由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2 方法

1.2.1 IGF2基因靶位點(diǎn)選擇

根據(jù)IGF2基因序列從Sigma公司定制3對(duì)靶向IGF2的ZFN。在3對(duì)ZFN識(shí)別序列范圍內(nèi)，根據(jù)sgRNA基本設(shè)計(jì)原則(序列符合5′-GN19NGG-3′)，并借助軟件分析(http://crispr.mit.edu/)，設(shè)計(jì) 5條靶向豬IGF2基因的sgRNA，具體序列見(jiàn)表1。

表1 靶向IGF2基因gRNA序列信息

圖1 Cas9與sgRNA共表達(dá)載體圖譜(PX330載體)

1.2.2 豬IGF2基因sgRNA/Cas9打靶載體的構(gòu)建

PX330載體可同時(shí)表達(dá)sg RNA和密碼子經(jīng)人源性優(yōu)化的Cas9蛋白(圖1)。根據(jù)表格1中所設(shè)計(jì)的5條sgRNA，合成相應(yīng)的寡核苷酸正負(fù)單鏈，每條單鏈上添加有相應(yīng)的黏性末端。用BbsⅠ(NEB公司)酶切1 μg PX330載體，線性化的質(zhì)粒經(jīng)電泳后，通過(guò)膠回試劑盒(OMEGA公司)回收酶切載體。同時(shí)，對(duì)正負(fù)兩條寡核苷酸鏈進(jìn)行復(fù)性和磷酸化處理，使之形成具有黏性末端的雙鏈DNA短片段。將上述短片段和線性化的PX330載體通過(guò)T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，接著轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。最后挑選細(xì)菌單克隆，通過(guò)測(cè)序鑒定sgRNA表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。

1.2.3 PEF細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

PEF細(xì)胞從藍(lán)塘豬胎兒中分離建立。PEF細(xì)胞在含有20%胎牛血清和雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)的 DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng) 1～2 d后更換一次培養(yǎng)基。PEF細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右的匯合度時(shí)，先用PBS洗滌兩遍，然后用胰酶消化2 min，隨后加入血清終止消化，將消化后的細(xì)胞收集至15 mL的離心管進(jìn)行離心，棄上清后再用PBS洗滌一遍進(jìn)行第二次離心。離心后棄上清，然后用適量Buffer R (Life Technology)溶液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到1.0×107個(gè)細(xì)胞/mL，使用 Neon? 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Life Technology)對(duì)PEF細(xì)胞進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染條件為：1700 V電壓，脈沖20 s，脈沖次數(shù)為1次。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h更換培養(yǎng)基，添加雙抗，在5%的CO2、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。3 d后進(jìn)行流式分析、分選或者收取細(xì)胞提取DNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 T7EⅠ實(shí)驗(yàn)

T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ(T7EⅠ酶)可以用來(lái)檢測(cè)由ZFN或者CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因突變，實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[12]。PEF細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后3 d，或者是經(jīng)分選后再培養(yǎng)一周，使用組織/細(xì)胞提取試劑盒(OMEGA公司)提取細(xì)胞基因組，通過(guò)PCR擴(kuò)增出包含ZFN 和CRISPR/Cas9識(shí)別位點(diǎn)的長(zhǎng)度為663 bp的IGF2基因片段，采用Axgen PCR清潔試劑盒(Axgene公司)純化PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物先在高溫下變性，然后經(jīng)逐步降溫退火形成異源雙鏈DNA，使用T7EⅠ對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行酶切，如果ZFN或CRISPR/ Cas9有活性，會(huì)產(chǎn)生460 bp和203 bp的兩個(gè)片段，可以在聚丙烯酰胺膠中分辨出來(lái)。最后通過(guò)Image J軟件計(jì)算ZFN和CRISPR/Cas9的切割效率，估算其活性。PCR擴(kuò)增IGF2基因的引物如下：

1.2.5 測(cè)序分析

利用LA Taq酶(TaKaRa公司)擴(kuò)增出包含ZFN 和sgRNA所識(shí)別位點(diǎn)的IGF2基因片段，利用瓊脂糖凝膠電泳分離該片段，然后用膠回試劑盒(OMEGA公司)回收，將回收的片段克隆到pMD18-T載體(TaKaRa公司)中，轉(zhuǎn)化后挑選若干個(gè)單菌落，由上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.5 IGF2-SSA報(bào)告載體構(gòu)建及SSA實(shí)驗(yàn)原理

pEGFP-SSA骨架載體上兩段F重復(fù)片段的中間存在 XhoⅠ和 BamHⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)(圖 2A)，先用這兩種內(nèi)切酶對(duì)骨架載體進(jìn)行雙酶切，并回收載體骨架片段。合成含有ZFN和sgRNA識(shí)別位點(diǎn)的兩條互補(bǔ)的寡核苷酸單鏈，經(jīng)高溫變性和復(fù)性后形成兩端分別帶有 XhoⅠ和 BamHⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)粘性末端的短片段，克隆到 pEGFP-SSA骨架載體，構(gòu)建IGF2-SSA報(bào)告載體。SSA報(bào)告系統(tǒng)的檢測(cè)原理如下：當(dāng)報(bào)告載體上的EGFP基因的中間片段(F片段)發(fā)生重復(fù)時(shí)，報(bào)告載體無(wú)法表達(dá)出正常的EGFP蛋白。此時(shí)在兩個(gè)F片段中間插入IGF2基因的sgRNA或ZFN的識(shí)別位點(diǎn)后，在Cas9或ZFN對(duì)報(bào)告載體進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂后，細(xì)胞會(huì)通過(guò)單鏈退火(Singlestrand annealing, SSA)的修復(fù)機(jī)制，利用同源序列互補(bǔ)重構(gòu)出完整的EGFP基因(圖2B)，恢復(fù)熒光表達(dá)。此時(shí)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的綠色熒光水平可以對(duì)sgRNA/Cas9或ZFN的活性進(jìn)行評(píng)估。

圖2 IGF2 SSA實(shí)驗(yàn)原理

1.2.6 流式細(xì)胞分析與分選

先用2%的胰蛋白酶消化貼壁的PEF細(xì)胞，然后用PBS重懸成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)50 μm尼龍膜過(guò)濾到流式管中，在 FACScalibur流式細(xì)胞分析儀上分析細(xì)胞的熒光比例與強(qiáng)度。應(yīng)用FACSAria II流式細(xì)胞分選儀器分選出EGFP陽(yáng)性細(xì)胞，接種至12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶向豬IGF2的CRISPR/Cas9在PEF細(xì)胞中的活性驗(yàn)證

將構(gòu)建好的5條IGF2-sgRNA分別與IGF2-SSA共轉(zhuǎn)染至PEF細(xì)胞中，48 h后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的EGFP熒光表達(dá)情況，并通過(guò)流式細(xì)胞分析術(shù)對(duì)表達(dá)EGFP的細(xì)胞比例進(jìn)行定量，初步評(píng)估5條sgRNA的活性。結(jié)果表明，5條sgRNA均有活性，其中IGF2-sgRNA-2 和IGF2-sgRNA-4的活性最高(圖3)，EGFP熒光比例與只轉(zhuǎn)染SSA報(bào)告載體的對(duì)照相比，都提高了6.5倍。

圖3 利用SSA方法對(duì)IGF2-sgRNA活性評(píng)估

2.2 T7EⅠ酶切檢測(cè)靶向 IGF2基因 sgRNA/Cas9的活性

分別將5條靶向IGF2基因的sgRNA質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染PEF細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞，提取基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增IGF2基因片段，通過(guò)T7EⅠ突變檢測(cè)方法，進(jìn)一步驗(yàn)證IGF2-sgRNA的活性。從圖4中可以看出，除了IGF2-sgRNA-5未能檢測(cè)到460 bp和203 bp酶切條帶，其余4條sgRNA均可見(jiàn)相應(yīng)的酶切條帶，它們的活性分別估算為5.1%、2.7%、7.8%和9.2%。其中IGF2-sgRNA-4的估算活性最高，與SSA檢測(cè)的結(jié)果相符。

圖4 T7E1酶切法檢測(cè)靶向豬IGF2基因的CRISPR/ Cas9活性

2.3 SSA報(bào)告載體法富集被 ZFN與 sgRNA/Cas9修飾過(guò)的細(xì)胞

為了更好地比較 SSA方法對(duì)提高 ZFN和CRISPR/Cas9的打靶效率是否存在差異，本研究選擇IGF2-sgRNA-1與IGF2-ZFN-set3作為比較對(duì)象，因?yàn)閮烧叩陌形稽c(diǎn)基本重合(圖5A)。流式分析結(jié)果顯示，IGF2-sgRNA-1可以使 5.2%的細(xì)胞中的IGF2-SSA報(bào)告載體恢復(fù)EGFP熒光表達(dá)，明顯高于IGF2-ZFN-set3介導(dǎo)1.5%的細(xì)胞表達(dá)EGFP(圖5B)，這表明在該位點(diǎn)上，CRISPR/Cas9的打靶效率明顯高于ZFN。同時(shí)，通過(guò)T7EⅠ突變檢測(cè)方法分別在分選前和分選后的細(xì)胞中檢測(cè)CRISPR/Cas9和ZFN的切割效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分選前的細(xì)胞中，IGF2-sgRNA-1切割的效率為1.6%，而在分選后的細(xì)胞中，其切割效率提高至9.3%，這表明SSA報(bào)告載體方法可以使CRISPR/Cas9的打靶效率提高5倍左右(圖5C)。而 IGF2-ZFN-set3分選前的細(xì)胞中切割效率低于檢測(cè)下限(<1%)，而在分選后的細(xì)胞中提高至 5.1%，這提示SSA報(bào)告載體方法對(duì)低活性的ZFN具有更明顯的提高打靶效率的作用。

圖5 SSA富集ZFN與CRISPR/Cas9基因修飾細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.4 TA克隆測(cè)序分析富集效率和突變類型

TA克隆結(jié)果如表2所示。在轉(zhuǎn)染IGF2-sgRNA-1+SSA后，以分選前的細(xì)胞基因組為模板擴(kuò)增獲得的50個(gè)PCR克隆中，發(fā)生突變的有6個(gè)，打靶效率為 12%；從分選后細(xì)胞基因組為模板擴(kuò)增獲得的48個(gè)PCR克隆中，發(fā)生突變的有7個(gè)，打靶效率為16.7%。這表明SSA報(bào)告載體方法可使CRISPR/Cas9的打靶效率提高至1.4倍。對(duì)于IGF2-ZFN-set3+SSA，從分選前的細(xì)胞基組為模板擴(kuò)增獲得的 60個(gè) PCR克隆中未檢測(cè)到發(fā)生突變的克隆，而從分選后的細(xì)胞基因組為模板擴(kuò)增獲得的30個(gè)PCR克隆中，檢測(cè)到發(fā)生突變的克隆為 5個(gè)，打靶效率為 16.7%。與通過(guò)T7EⅠ突變檢測(cè)的結(jié)果相一致，SSA報(bào)告載體方法對(duì)低活性的ZFN具有更明顯的提高打靶效率的作用。

此外，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，本研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9和ZFN在豬IGF2基因引起的敲除片段大小和突變類型存在差異。從圖6的測(cè)序結(jié)果可以看出，CRISPR/Cas9對(duì)豬 IGF2基因可以引起達(dá)123 bp的缺失，而ZFN對(duì)該基因引起的敲除片段都小于50 bp，說(shuō)明CRISPR/Cas9可能更容易引起較大片段缺失。另外，ZFN在IGF2基因引起80%的缺失突變，其余 20%的突變?yōu)榧扔腥笔в钟胁迦氲膹?fù)合突變；而CRISPR/Cas9對(duì)IGF2基因的同個(gè)位點(diǎn)造成的突變類型中，插入突變高達(dá) 50%，而缺失突變僅占30%，復(fù)合突變占20%(與ZFN相似)(圖7)。這兩種基因組編輯工具引起基因突變類型存在差異可能與兩者所使用的非特異性內(nèi)切酶引起雙鏈DNA斷裂末端不同相關(guān)，其中ZFN的FokⅠ內(nèi)切酶在切割DNA后會(huì)產(chǎn)生粘性末端，而Cas9切割DNA后會(huì)留下平末端。

表2 T7EⅠ實(shí)驗(yàn)和TA克隆實(shí)驗(yàn)對(duì)靶向豬IGF2基因sgRNA和ZFN的效率統(tǒng)計(jì)

圖6 TA克隆測(cè)序分析

圖7 ZFN與CRISPR/Cas9介導(dǎo)IGF2基因突變類型的比較

3 討 論

ZFN是最早出現(xiàn)的基因組編輯工具，在家畜基因敲除研究中已經(jīng)得到了較多的應(yīng)用。Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，采用新霉素(G418)篩選之后ZFN在PEF細(xì)胞中對(duì)豬 Ppar-γ基因的打靶活性僅有 4%，而Watanabe等[14]利用ZFN對(duì)豬IL2RG進(jìn)行基因敲除研究中，ZFN在 PEF細(xì)胞中的打靶效率更低僅為0.5%。上述兩個(gè)研究中基因敲除豬的獲得都是通過(guò)挑選單細(xì)胞克隆方法篩選出基因敲除的細(xì)胞系用于體細(xì)胞克隆。Hauschild等[15]利用ZFN對(duì)豬GGTA1基因敲除研究中，在PEF細(xì)胞中活性也較低，僅有1%，由于該基因表達(dá)與膜蛋白有關(guān)，該課題組通過(guò)借助相應(yīng)的抗體采用磁珠分選的方法獲取了基因敲除細(xì)胞。從上述相關(guān)研究中可以看出ZFN在豬PEF細(xì)胞中的打靶效率相對(duì)比較低，獲取敲除細(xì)胞系的難度較大。CRISPR/Cas9作為最新的基因編輯工具，具有更加高效簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。2014年，周琪課題組通過(guò)受精卵顯微注射CRISPR/Cas9 mRNA的方法，獲得了vWF基因敲除豬，單等位基因的敲除效率高達(dá)68%，雙等位基因敲除效率也達(dá)到了37%[10]。盡管采用受精卵顯微注射CRISPR/Cas9 mRNA的方法獲取基因敲除豬具有較高的效率，然而也存在一定的缺陷，比如利用該方法無(wú)法在基因敲除豬出生前確定其性別及基因修飾的情況。目前尚未見(jiàn)關(guān)于CRISPR/Cas9技術(shù)在PEF細(xì)胞中進(jìn)行基因打靶，進(jìn)而用于體細(xì)胞克隆的研究報(bào)告。

本研究利用ZFN和CRISPR/Cas9對(duì)豬IGF2基因進(jìn)行了定點(diǎn)敲除相關(guān)研究，并通過(guò)SSA方法提高了ZFN和CRISPR/Cas9對(duì)豬IGF2基因的打靶效率。研究表明，從Sigma公司購(gòu)買的3對(duì)ZFN在PEF細(xì)胞中的活性均偏低，都無(wú)法通過(guò)T7EⅠ檢測(cè)出來(lái)，這與靶向豬IL2RG基因[14]和GGTA1基因[15]分別只有0.5%效率和1%的效率相一致。因而，本文構(gòu)建了靶向該基因的5條sgRNA，分別通過(guò)SSA方法和T7EⅠ評(píng)估了它們的活性，其中活性最高的 IGF2-sgRNA-4切割效率接近10%。本研究結(jié)果表明，CRISPR/Cas9對(duì)豬IGF2基因的敲除效率要高于ZFN。然而CRISPR/ Cas9在其他物種中的打靶效率可以達(dá)到80%以上[8]，在顯微注射過(guò)的豬受精卵中的打靶效率也達(dá)到68%，此外本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9對(duì)豬其他基因，如BMP15基因敲除效率也可以達(dá)20%以上(未發(fā)表)。本文認(rèn)為在PEF細(xì)胞中，CRISPR/Cas9對(duì)IGF2基因的打靶效率不夠高的原因可能有兩個(gè)方面：(1)PEF細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率相比于其他細(xì)胞系如HEK293FT細(xì)胞較低；(2)IGF2基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，GC含量很高，甲基化程度高，所設(shè)計(jì)的每條sgRNA的GC含量都在70%以上，可能會(huì)影響其與靶位點(diǎn)的結(jié)合。因?yàn)閆FN和CRISPR/Cas9對(duì)豬IGF2基因的打靶效率都偏低，所以需要有效的方法提高它們的打靶效率。韓國(guó)科學(xué)家利用 Surrogate報(bào)告載體篩選方法在HEK293FT細(xì)胞中可以將ZFN對(duì)TP53基因的打靶效率提高13倍[12]，其他相關(guān)研究通過(guò)SSA報(bào)告載體篩選[11]的方法也可以在HEK293FT和HeLa等細(xì)胞系中將ZFN介導(dǎo)的基因修飾效率提高至不同的程度，但目前尚未見(jiàn)關(guān)于在PEF細(xì)胞等原代細(xì)胞中應(yīng)用這些篩選方法來(lái)提高基因打靶效率的報(bào)道。

本研究應(yīng)用SSA報(bào)告系統(tǒng)，在PEF細(xì)胞中檢測(cè)了其對(duì)靶向豬IGF2基因的ZFN和sgRNA是否具有提高打靶效率的作用，結(jié)果表明SSA報(bào)告系統(tǒng)均可顯著提高兩種基因組編輯工具的打靶效率，而且對(duì)低活性的 ZFN的提高效果更為明顯(表 2)。本研究應(yīng)用SSA報(bào)告系統(tǒng)，在PEF細(xì)胞中只經(jīng)過(guò)一輪細(xì)胞篩選，在Surrogate報(bào)告載體方法中提到采用兩輪細(xì)胞篩選的方法可以進(jìn)一步提高 ZFN的打靶效率[12]，因此，今后可通過(guò)兩輪細(xì)胞篩選方法進(jìn)一步提高ZFN或CRISPR/Cas9對(duì)豬IGF2基因的打靶效率，為獲取IGF2基因定點(diǎn)修飾的藍(lán)塘豬提供研究基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編委: 張 博)

Improving gene targeting efficiency on pig IGF2 mediated by ZFNs and CRISPR/Cas9 by using SSA reporter system

Jinqing Wu1, Gui Mei2, Zhiguo Liu1, Yaosheng Chen1, Peiqing Cong1, Zuyong He1
1. State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China; 2. Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences; State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding, Guangzhou 510640, China

IGF2 (Insulin-like growth factor 2) is a major growth factor affecting porcine fetal and postnatal development. We propose that the precise modification of IGF2 gene of Chinese indigenous pig breed——Lantang pig by genome editing technology could reduce its backfat thickness, and increase its lean meat content. Here, we tested the genome editing activities of zinc finger nucleases (ZFNs) and CRISPR/Cas9 system on IGF2 gene in the Lantang porcine fetal fibroblasts (PEF). The results indicated that CRISPR/Cas9 presented cutting efficiency up to 9.2%, which was significantly higher than that generated by ZFNs with DNA cutting efficiency lower than 1%. However, even by using CRISPR/Cas9, the relatively lower percentage of genetically modified cells in the transfected popula-tion was not satisfied for somatic nuclear transfer (SCNT). Therefore, we used a SSA (Single-strand annealing) reporter system to enrich genetically modified cells induced by ZFN or CRISPR/Cas9. T7 endonuclease I assay revealed that this strategy improved genome editing activity of CRISPR/Cas9 by 5 folds, and was even more effective for improving genome editing efficiency of ZFN.

IGF2 gene; ZFN; CRISPR/Cas9; SSA reporter system

2014-06-19;

2014-08-29

國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)(編號(hào)：2013ZX08006005-005)和國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(編號(hào)：2010CB945404)資助

吳金青，碩士研究生，專業(yè)方向：生物工程。E-mail: jinqingw@163.com

何祖勇，博士，講師，研究方向：動(dòng)物遺傳與育種。E-mail: zuyonghe@gmail.com

10.16288/j.yczz.2015.01.008

時(shí)間： 2014-10-15 8:07:28

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141015.0807.003.html