解凍囊胚體外培養(yǎng)時(shí)間與妊娠結(jié)局的關(guān)系

周 靜,廖宏慶*,周 俊,聶玉林

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖南衡陽(yáng)421001;2.南華星輝生殖健康?？漆t(yī)院)

解凍囊胚體外培養(yǎng)時(shí)間與妊娠結(jié)局的關(guān)系

周 靜1,2,廖宏慶1,2*,周 俊1,2,聶玉林1,2

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖南衡陽(yáng)421001;2.南華星輝生殖健康?？漆t(yī)院)

目的 比較凍融囊胚周期解凍后體外培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局的影響。 方法 回顧性分析155例首次接受凍融胚胎移植周期(FET)的患者,其中38個(gè)囊胚解凍周期在排卵或肌注黃體酮后4天進(jìn)行解凍復(fù)蘇,培養(yǎng)16～18 h后進(jìn)行移植(16～18 h組),117個(gè)囊胚解凍周期在排卵或肌注黃體酮后4天進(jìn)行解凍,培養(yǎng)2～3 h后移植(2～3 h組),對(duì)兩組患者平均年齡、原發(fā)不孕比例、自然周期比例、移植胚胎枚數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)囊胚比例、移植日內(nèi)膜厚度、臨床妊娠率、胚胎種植率、流產(chǎn)率等數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照分析。 結(jié)果 兩組患者平均年齡、原發(fā)不孕比例、自然周期比例、移植胚胎枚數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)囊胚比例、移植日內(nèi)膜厚度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),16～18 h組臨床妊娠率、種植率與2～3 h組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);16～18 h組的流產(chǎn)率顯著高于2～3 h組(P＜0.05)。 結(jié)論解凍囊胚培養(yǎng)2～3 h移植,能夠有效降低流產(chǎn)率,改善妊娠結(jié)局。關(guān)鍵詞: 凍融囊胚移植; 臨床妊娠率; 種植率

R71

A

隨著序貫培養(yǎng)在生殖領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用,囊胚培養(yǎng)和移植已經(jīng)成為很多生殖中心的常規(guī)應(yīng)用技術(shù)。囊胚培養(yǎng)是檢測(cè)胚胎在體外發(fā)育潛能的有效篩選方法,能淘汰大部分發(fā)育潛能差及染色體異常的胚胎,移植囊胚到宮腔更符合生理狀態(tài),能提高移植周期的種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率[1],還可以通過(guò)減少移植優(yōu)質(zhì)囊胚的數(shù)量達(dá)到降低多胎率發(fā)生的目的。部分生殖中心認(rèn)為囊胚解凍后培養(yǎng)過(guò)夜,能進(jìn)一步篩選有良好發(fā)育潛能的胚胎,可增加胚胎植入子宮內(nèi)膜的機(jī)會(huì),提高臨床妊娠率和種植率[2],但這一方案延長(zhǎng)了體外培養(yǎng)時(shí)間,可能對(duì)其表觀遺傳學(xué)產(chǎn)生不確定影響。本研究回顧性比較了解凍囊胚體外培養(yǎng)2～3 h與16～18 h后移植對(duì)于妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性選擇2012年5月～2014年1月本中心行首次凍胚移植(FET)的夫婦,共解凍155個(gè)周期,女性患者平均年齡31.0±4.5歲。

1.2 內(nèi)膜準(zhǔn)備及分組

月經(jīng)周期規(guī)則/有排卵/卵泡監(jiān)測(cè)內(nèi)膜發(fā)育良好者(厚度＞8 mm)采用自然周期法;行自然周期失敗/無(wú)排卵或既往排卵障礙者采用激素替代法。16～18 h組為排卵后或肌注黃體酮后第4天進(jìn)行解凍復(fù)蘇過(guò)夜培養(yǎng)16～18 h移植,2～3 h組為排卵或肌注黃體酮后第4天進(jìn)行解凍培養(yǎng)2～3 h后移植。

1.3 凍胚選擇及凍融方法

囊胚評(píng)級(jí)按Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),分3個(gè)指標(biāo):囊胚腔的大小,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以及外胚滋養(yǎng)層。根據(jù)囊胚腔的大小分為6級(jí),1級(jí)早期囊胚:囊胚腔小于胚胎體積的1/2;2級(jí)囊胚:囊胚腔超過(guò)胚胎體積的1/2;3級(jí)完全囊胚:囊胚腔幾乎占滿了整個(gè)胚胎;4級(jí)擴(kuò)張囊胚:囊胚體積擴(kuò)大,囊胚腔擴(kuò)張,透明帶變薄;5級(jí)孵化囊胚:部分外胚滋養(yǎng)層細(xì)胞開(kāi)始從透明帶孵出;6級(jí)孵出囊胚:囊胚完全從透明帶中孵出,脫離透明帶。根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分A級(jí):細(xì)胞數(shù)多,緊密成團(tuán),突起明顯;B級(jí):細(xì)胞數(shù)較少,疏散或成群;C級(jí):細(xì)胞數(shù)很少,難以辨別明顯的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)滋養(yǎng)外胚層評(píng)分A級(jí):3級(jí)囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞≥10個(gè),細(xì)胞連續(xù)、飽滿、分界清晰,4～6級(jí)囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞≥15個(gè),細(xì)胞連續(xù)、飽滿、分界清晰;B級(jí):3級(jí)囊胚滋養(yǎng)層10＞細(xì)胞數(shù)≥5個(gè),4～6級(jí)囊胚滋養(yǎng)層15＞細(xì)胞數(shù)≥10個(gè);C級(jí):3級(jí)囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)＜5個(gè),4～6級(jí)囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)＜10個(gè);評(píng)分≥3BB的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚,如有一項(xiàng)評(píng)級(jí)為C,也進(jìn)行冷凍。

凍融采用快速冷凍—快速?gòu)?fù)蘇法,囊胚玻璃化冷凍采用Kitazato公司玻璃化冷凍套裝。按照說(shuō)明書(shū)操作,冷凍時(shí),首先將囊胚皺縮(采用激光打孔法),然后將皺縮好的囊胚依次放入平衡液(ES)中5～10 min,隨后轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液(VS)中,60 s以內(nèi)以最小液滴量放到做好標(biāo)記的(CVM)冷凍鉤上,每桿裝載1～2枚胚胎,迅速投入液氮中,套管保存。玻璃化冷凍囊胚的解凍采用Kitazato公司Vitrification warming套裝。將玻璃化解凍液(TS)37℃預(yù)熱30 min,稀釋液(DS),洗滌液1(WS1)和洗滌液2(WS2)分別取0.5 mL,置于培養(yǎng)皿內(nèi),室溫下平衡30 min。解凍:從液氮中取出冷凍載桿,迅速將裝有胚胎的載桿前端浸入TS液中,1 min內(nèi)將胚胎轉(zhuǎn)移至DS中,3 min后將胚胎轉(zhuǎn)移至 WS1中,作用5 min;最后將胚胎移入WS2中,并將培養(yǎng)皿移到37℃熱板上加熱5 min。解凍結(jié)束后將囊胚轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液中,置培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 h,囊胚腔開(kāi)始擴(kuò)張的囊胚適合移植。

1.4 妊娠判定

移植4周后B超見(jiàn)宮內(nèi)孕囊為臨床妊娠。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

共行解凍患者155人,解凍155個(gè)周期,移植155周期,解凍胚胎300枚,復(fù)蘇胚胎298枚,移植胚胎296枚,平均每周期移植胚胎1.9±0.3枚,移植胚胎中優(yōu)質(zhì)囊胚比例為82.8%(245/296),臨床妊娠104例,周期臨床妊娠率67.1%(104/155),種植145枚,種植率49.0%(145/296);流產(chǎn)13例,流產(chǎn)率12.5%(13/104)。

2.1 復(fù)蘇周期患者一般資料比較

兩組患者平均年齡、原發(fā)不孕比例、自然周期比例、移植胚胎枚數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)囊胚比例、移植日內(nèi)膜厚度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表1)。

2.2 兩組妊娠結(jié)局比較

解凍后2～3 h組和16～18 h組在妊娠率和種植率上均無(wú)明顯差異,2～3 h組的流產(chǎn)率低于16～18 h組(7.7%比26.9%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表2)。

3 討 論

目前,大多數(shù)生殖中心都采用囊胚培養(yǎng)技術(shù)來(lái)達(dá)到挑選優(yōu)質(zhì)胚胎,進(jìn)而提高成功率、降低多胎率的目的。有研究顯示在凍融周期和新鮮周期中移植囊胚數(shù)目相近的情況下,凍融周期能夠獲得更高的臨床妊娠率和胚胎著床率[3-4]。但囊胚解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)于妊娠結(jié)局的影響尚無(wú)定論,有研究認(rèn)為延長(zhǎng)復(fù)蘇后體外培養(yǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)率增加[5],也有研究得出相反的結(jié)論,認(rèn)為延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間不會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)率增加[2]。本研究結(jié)果支持前一種觀點(diǎn)。囊胚解凍后培養(yǎng)2～3 h較培養(yǎng)16～18 h移植具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì):①延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間存在更大的移植取消風(fēng)險(xiǎn)。延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間雖然能夠進(jìn)一步篩選發(fā)育良好的胚胎,但胚胎體外培養(yǎng)條件要求較高,囊胚培養(yǎng)受到空氣質(zhì)量、培養(yǎng)箱與培養(yǎng)液質(zhì)量、胚胎操作等影響,延長(zhǎng)培養(yǎng)16～18 h可能會(huì)因胚胎發(fā)育潛力下降甚至停止發(fā)育,導(dǎo)致移植取消;②存在表觀遺傳學(xué)隱患。多項(xiàng)研究表明種植前胚胎發(fā)育是表觀遺傳學(xué)重組的動(dòng)力學(xué)階段[6],胚胎培養(yǎng)會(huì)改變印記基因調(diào)控[7]。目前體外培養(yǎng)體系并非最理想的培養(yǎng)環(huán)境,胚胎會(huì)通過(guò)改變表觀遺傳學(xué)來(lái)適應(yīng)這些變化。在體外培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng),胚胎所做的適應(yīng)性改變就越多,胚胎發(fā)育受到的潛在影響也就越大。本研究發(fā)現(xiàn)解凍囊胚移植種植率和妊娠率均在較高水平,但16～18 h組的流產(chǎn)率要明顯高于2～3 h組,提示更長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng)對(duì)于胚胎的發(fā)育潛能可能存在不良影響;③胚胎暫停理論。有研究表明在多種哺乳動(dòng)物中都存在一種胚胎自我保護(hù)現(xiàn)象,即胚胎暫停(ED,embryonic diapause)現(xiàn)象[8]。胚胎形成囊胚后如果植入的子宮內(nèi)膜不適宜種植,胚胎會(huì)出現(xiàn)代謝降低發(fā)育暫停的現(xiàn)象,這種現(xiàn)象會(huì)一直維持到適合的子宮內(nèi)膜種植窗出現(xiàn)后,再繼續(xù)發(fā)育進(jìn)行種植,即胚胎具有等待子宮內(nèi)膜的能力,早移植的胚胎較晚移植的胚胎有更多種植的機(jī)會(huì)。本研究結(jié)果顯示,培養(yǎng)2～3 h組種植率數(shù)值上高于培養(yǎng)16～18 h組但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,有待進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行研究;④與卵裂期胚胎相比,囊胚功能復(fù)蘇的判斷時(shí)間較短,復(fù)蘇囊胚通常在2～3 h內(nèi)就可以恢復(fù)膨脹,囊胚腔重新膨脹即標(biāo)志著囊胚功能開(kāi)始恢復(fù)。本研究結(jié)果證明囊胚腔恢復(fù)膨脹是一個(gè)在短時(shí)間內(nèi)有效反映胚胎功能恢復(fù)的形態(tài)學(xué)指標(biāo),能夠?qū)?fù)蘇胚胎進(jìn)行篩選判斷。

表1 復(fù)蘇周期患者一般資料的比較

表2 解凍囊胚體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局的影響(例,%)_

綜上,本研究認(rèn)為解凍囊胚培養(yǎng)2～3 h進(jìn)行移植能夠獲得良好的妊娠率和種植率。解凍后囊胚過(guò)夜培養(yǎng)會(huì)增加流產(chǎn)率導(dǎo)致不良結(jié)局,解凍后2～3 h囊腔膨脹后進(jìn)行移植能夠降低流產(chǎn)率,改善妊娠結(jié)局。

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Effect of the Culture Time for Thawed Blastocysts on Pregnancy Outcome

ZHOU Jing,LIAO Hongqing,ZHOU Jun,et al(The Second Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective To explore the effect of culture time in vitro of thawed blastocysts on pregnancy outcome. Methods The frozen-thawed blastocysts which were thawed at 4 days after ovulation or intramuscular injection of progesterone were selected as study objects,155 patients receiving frozen-thawed embryos transfer(FET)for the first time were analyzed retrospectively.38 patients receiving FETat 16～18 hours after thawing were selected as16～18 hours culture group,117 patients receiving FET at 2～3 hours after thawing were selected as2～3 hours culture group.The average age of the two groups of patients,the proportion of primary infertility,the proportion of the natural cycle,number of transfer embryos,the proportion of high quality transfer blastocyst,and endometrial thickness on transfer day,clinical pregnancy rate,implantation rate,abortion rate data were compared.Results There were no statistical differences between two groups on the average age of the two groups of patients,the proportion of primary infertility,the proportion of the natural cycle,number of transfer embryos,the proportion of high quality transfer blastocyst,and endometrial thickness on transfer day(P＞0.05).The clinical pregnancy rate and implantation rate had no statistical differences between 16～18 hours culture group and 2～3 hours culture group(P＞0.05);the abortion rate in 2～3 hours culture group was significant lower than that in 16～18 hours culture group(P＜0.05). Conclusion Thawed blastocysts cultured for 2～3 hours to transfer could effectively reduce the abortion rate and improve pregnancy outcome.

frozen-thawed blastocyst transfer; clinical pregnancy rate; implantation rate

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.007

2014-07-14;

2014-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31371277).

*通訊作者:E-mail:potlhq@gmail.com.

(此文編輯:朱雯霞)