Caveolae在CGRP保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的作用及機(jī)制

朱 怡,周孝錢(qián),肖云彬,全海燕,駱竟妃,彭虹艷,秦旭平*

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科,湖南衡陽(yáng)421001;2.南華大學(xué)藥物藥理研究所;3.湖南省兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科)

Caveolae在CGRP保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的作用及機(jī)制

朱 怡1,周孝錢(qián)2,肖云彬3,全海燕2,駱竟妃2,彭虹艷2,秦旭平2*

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科,湖南衡陽(yáng)421001;2.南華大學(xué)藥物藥理研究所;3.湖南省兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科)

目的 探討Caveolae對(duì)降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)抑制過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)損傷作用的影響及其機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)HUVECs,分別用CGRP和/或H2O2處理細(xì)胞,光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)和密度的變化;流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞的增殖和周期分布;β-環(huán)糊精(β-CD)用于破壞caveolae結(jié)構(gòu);Western-blot檢測(cè)caveolin-1表達(dá)。 結(jié)果 與正常組比較,CGRP組細(xì)胞密度增加,S期細(xì)胞數(shù)明顯增多,H2O2組細(xì)胞密度降低,S期細(xì)胞數(shù)明顯減少;CGRP預(yù)孵育細(xì)胞能抵抗H2O2引起的細(xì)胞數(shù)目減少;β-CD剝奪膽固醇,破壞caveolae結(jié)構(gòu),HUVECs形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,但CGRP誘導(dǎo)的細(xì)胞密度和細(xì)胞增殖進(jìn)一步提升,恢復(fù)膽固醇后,該作用被取消。與對(duì)照組比較,CGRP組細(xì)胞caveolin-1表達(dá)水平降低(P＜0.05);H2O2組細(xì)胞caveolin-1水平上升(P＜0.05),給予CGRP預(yù)孵育后,能顯著逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的caveolin-1表達(dá)(P＜0.05);β-CD破壞caveolae結(jié)構(gòu)后,增強(qiáng)CGRP下調(diào)HUVECs caveolin-1表達(dá)的作用(P＜0.05),增加膽固醇Caveolae結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)且該作用被削弱。結(jié)論 Caveolae結(jié)構(gòu)完整性對(duì)CGRP保護(hù)H2O2損傷HUVECs有一定影響,破壞caveolae結(jié)構(gòu)能增強(qiáng)CGRP對(duì)H2O2損傷的HUVECs的增殖作用,其機(jī)制可能與增強(qiáng)CGRP下調(diào)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的caveolin-1的表達(dá)有關(guān)。

過(guò)氧化氫; 降鈣素基因相關(guān)肽; caveolae; caveolin-1; 內(nèi)皮細(xì)胞

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是由辣椒素敏感性感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽,是目前發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性最強(qiáng)的舒血管活性物質(zhì)之一,有舒張血管和收縮心肌的作用,抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[1]。Caveolae是細(xì)胞膜表面特異性?xún)?nèi)陷結(jié)構(gòu),是細(xì)胞內(nèi)多數(shù)信號(hào)分子和轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的整合器。caveolin-1是caveolae表面標(biāo)記蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白,并通過(guò)其腳手架區(qū)域在caveolae區(qū)結(jié)合其他信號(hào)分子發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)的作用[2]。前期研究工作表明,CGRP能對(duì)抗H2O2引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,并上調(diào)caveolin-1的表達(dá)[3]。本研究以體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)為研究對(duì)象,采用H2O2誘導(dǎo)損傷建立血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型,通過(guò)觀察HUVECs生長(zhǎng)、細(xì)胞周期分布及caveolin-1蛋白的表達(dá),研究CGRP對(duì)氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用,探討caveolae結(jié)構(gòu)完整性對(duì)CGRP保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞作用的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞株(HUVECs,型號(hào):C-003-5C)由本實(shí)驗(yàn)室保存。 CGRP,β-cyclodextrin(β-CD)為Sigma公司產(chǎn)品,Cholesterol(USA Amresco,Inc.),胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。RPMI-1640的培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,抗體及顯色試劑購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。蛋白印跡所用試劑均為USA Amresco,Inc.公司產(chǎn)品。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

取凍存的HUVECs,解凍后置于50 mL無(wú)菌培養(yǎng)瓶中,加入適量含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長(zhǎng)至80%左右時(shí),用0.25%胰酶消化傳代。取長(zhǎng)勢(shì)良好的3～10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理因素

在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上[3],通過(guò)量效關(guān)系確定H2O2及CGRP作用于HUVECs的濃度。對(duì)照組為0.1%FBS培養(yǎng)的靜止期細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別用H2O2(0.5 mmol/L),CGRP(100 nmol/L),β-CD(5 mmol/L)膽固醇(Cholesterol 25μmol/L)按實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮统绦蛱幚砑?xì)胞(見(jiàn)結(jié)果)。采取細(xì)胞計(jì)數(shù)板和光鏡下肉眼觀察的方法分析細(xì)胞密度的變化。

1.4 Western Blot

各組細(xì)胞棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用冰PBS洗滌3次,加入預(yù)冷的RIPA裂解液臨用前加入0.1 mg/mL PMSF裂解細(xì)胞,置冰上10 min,用細(xì)胞刮匙刮取蛋白,再以超聲波粉碎細(xì)胞,4℃ 10 000 g離心15 min,取上清分裝后于-85℃超低溫冰箱凍存。BCA法測(cè)蛋白質(zhì)含量后,每泳道上30μg總蛋白量進(jìn)行SDSPAGE電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h,加入一抗(兔抗caveolin-1,1∶400;鼠抗β-actin,1∶300)4℃孵育過(guò)夜TBST洗膜8 min/次,洗3次,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1 000)或兔抗小鼠二抗(1∶1 000),室溫下?lián)u床孵育2 h,常規(guī)洗膜,化學(xué)發(fā)光劑顯色,膠片顯影,掃描膠片用凝膠系統(tǒng)分析系統(tǒng)測(cè)光密度值。結(jié)果以各目的蛋白和β-actin的灰度比值表示。

1.5 PI單染流式細(xì)胞術(shù)觀察HUVECs細(xì)胞周期分布情況

取3～10代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HUVECs,以2×105個(gè)/mL接種于50 mL培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.1%FBS培養(yǎng)基同步化細(xì)胞24 h,按分組加入不同的處理因素繼續(xù)孵育后收集細(xì)胞。PBS液清洗3次,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化,吹打成細(xì)胞懸液后,4℃、75 g離心5 min,PBS液清洗3次,棄上清,用體積分?jǐn)?shù)為75%的冰乙醇吹打成單細(xì)胞懸液,吸入到1.5 mL大的EP管,4℃固定過(guò)夜。檢測(cè)前,75 g離心10 min,棄上清,PBS液清洗3次,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L。加PI熒光染料,350目尼龍網(wǎng)濾膜過(guò)濾除去細(xì)胞團(tuán)塊,于4℃避光染色30 min后,上流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)各期細(xì)胞DNA的含量。計(jì)算30 000個(gè)細(xì)胞,觀察細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞周期情況。

一般情況下,細(xì)胞無(wú)增殖活動(dòng)時(shí)皆停留于G0G1期,在某些因素激活下,啟動(dòng)DNA合成進(jìn)入S期(DNA合成期)及M期(DNA分裂期),使細(xì)胞增殖分化。可根據(jù)細(xì)胞周期各時(shí)相比例,計(jì)算增殖指數(shù)(proliferation index,PI),以衡量細(xì)胞的分裂增殖活動(dòng)。PI的計(jì)算公式為:PI=(S+G2M/(G0G1+S+G2M),PI值越大表示細(xì)胞增殖越明顯。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。均采用SPSS14.0 for windows軟件進(jìn)行分析,組間差異比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)及t檢驗(yàn),用P＜0.05判斷統(tǒng)計(jì)差異有無(wú)顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 Caveolae對(duì)CGRP保護(hù)HUVECs生長(zhǎng)作用的影響

HUVECs分別給予CGRP(100 nmol/L)或H2O2(0.5 mmol/L)處理24 h后,光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,CGRP能增加HUVECs的密度,形態(tài)與排列與對(duì)照組無(wú)差別(圖1B),而H2O2組形態(tài)變小變圓,排列不規(guī)則(圖1C)。CGRP預(yù)孵育細(xì)胞30 min能顯著改善H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷作用(圖1D),胞漿變得飽滿(mǎn)。用 β-環(huán)糊精(β-CD)破壞caveolae結(jié)構(gòu)后,光學(xué)顯微鏡下觀察,細(xì)胞密度增加,但形狀不規(guī)則(圖1F);預(yù)先加入膽固醇保護(hù)Caveolae結(jié)構(gòu),細(xì)胞多角形狀更不規(guī)則,與CGRP+H2O2組相比,細(xì)胞密度基本恢復(fù),各組細(xì)胞數(shù)的變化如圖2所示。

圖1 HUVECs形態(tài)學(xué)圖( ×100). A:Control,B:CGRP,C:H2O2;D:CGRP+H2O2;E:β-CD+CGRP+H2O2;F:Cholesterol+β-CD+CGRP+H2O2

圖2 各組細(xì)胞數(shù)的變化

2.2 Caveolae對(duì)HUVECs周期分布的影響

對(duì)細(xì)胞周期圖統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,單用CGRP能使S期細(xì)胞增多(圖3B);H2O2組S期細(xì)胞較正常組減少(圖3C);CGRP預(yù)孵育細(xì)胞30 min使H2O2組S期細(xì)胞明顯增多(圖3D),PI值較H2O2增大(P＜0.05)。說(shuō)明CGRP能夠?qū)笻2O2引起的S期細(xì)胞的減少,促進(jìn)正常和受損HUVECs的增殖。給予 β-CD,細(xì)胞 PI值增大,與CGRP+H2O2組相比,S期細(xì)胞數(shù)目增加;預(yù)先加入膽固醇,該作用被削弱(見(jiàn)表1,P＜0.05)。由此可見(jiàn),caveolae在CGRP促進(jìn)氧化損傷HUVECs S增殖過(guò)程中可能起負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。

圖3 細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞儀代表圖

表1 Caveolae對(duì)HUVECs周期分布影響情況(n=3)_

表1 Caveolae對(duì)HUVECs周期分布影響情況(n=3)_

PI=(S+G2M/(G0G1+S+G2M),PI值越大表示細(xì)胞增殖越明顯;G0/G1:停留于G1/G0期(無(wú)增殖活動(dòng)期)細(xì)胞;S:DNA合成期細(xì)胞;G2/M:DNA合成后期細(xì)胞;a:P＜0.05 vs Control(0.1%FBS);b:P＜0.05 vs H2O2;c:P＜0.05 vs CGRP+H2O2;d:P＜0.05 vsβ-CD+CGRP+H2O2

_Group G0/G1% S% G2/M%PI%________________Control(0.1%FBS)45.7±2.3 41.5±1.5 7.5±0.6 51.7±2.8 CGRP 43.6±3.1 50.1±2.6a 4.6±0.9 55.7±4.1a H2 O2 36.4±2.6 30.6±2.2a 1.4±0.8 45.7±3.4a CGRP+H2 O2 40.8±4.2 45.6±4.1b 10.0±1.2 57.8+5.8b β-CD+CGRP+H2 O2 27.4±4.9 54.2±3.7c 4.0±1.0 68.0±6.2c_Cholesterol+β-CD+CGRP+H2 O2_______________31.4±5.1_________________________39.9±3.3d 7.6±1.2 60.2±6.1d_______________

2.3 CGRP抑制H2O2處理的HUVECs caveolin-1的表達(dá)

單用CGRP能夠降低HUVECs caveolin-1的表達(dá),而用0.5 mmol/L H2O2處理細(xì)胞4 h后,caveolin-1的表達(dá)增加,說(shuō)明H2O2通過(guò)增加caveolin-1的表達(dá)得到抑制細(xì)胞增殖的作用。100 nmol/LCGRP預(yù)孵育30 min后,再給H2O2能夠降低caveolin-1的表達(dá)(P＜0.05)(圖4)。

圖4 CGRP對(duì)H 2 O2處理HUVECs caveolin-1表達(dá)的影響

2.4 Caveolae結(jié)構(gòu)對(duì)CGRP抗氧化損傷作用的影響

如圖5所示,用0.1%FBS同步化細(xì)胞24 h,換含5 mmol/Lβ-CD的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育細(xì)胞0、0.17、0.5、1、4、8、16 h 提取細(xì)胞總蛋白。 Western-blot結(jié)果顯示,β-CD孵育細(xì)胞0.5 h后能夠下調(diào)HUVECs caveolin-1的表達(dá),并且降低幅度最大。由此選定5 mmol/Lβ-CD孵育細(xì)胞0.5 h作為破壞caveolae結(jié)構(gòu)的條件。

如圖6所示,同步化細(xì)胞按照處理因素分組,0.5 mmol/L H2O2處理細(xì)胞4 h后提取細(xì)胞總蛋白。Western-blot結(jié)果顯示:Caveolae結(jié)構(gòu)破壞后,CGRP抑制H2O2引起HUVECs caveolin-1表達(dá)上調(diào)的作用更明顯(P＜0.05);預(yù)先加入膽固醇后,該抑制作用被削弱(P＜0.05)。

圖5 β-環(huán)糊精對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1表達(dá)的影響

圖6 各處理因素下caveolin-1的表達(dá)情況 1:Control(0.1%

3 討 論

本研究顯示,caveolae結(jié)構(gòu)完整性對(duì)CGRP保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞有一定的影響,主要表現(xiàn)在,完整的caveolae結(jié)構(gòu)可以通過(guò)促進(jìn)caveolin-1的表達(dá)降低CGRP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖作用,破壞caveolae結(jié)構(gòu)后,這種作用降低。有研究表明,CGRP還能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞,修復(fù)和改善受損內(nèi)皮的功能,沙坦類(lèi)藥物的降壓和保護(hù)心血管作用與升高高血壓患者體內(nèi)的CGRP水平有關(guān)[4]。

Caveolae是富含膽固醇和蛋白質(zhì),其膽固醇含量占細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇的90%以上,膽固醇在維持caveolae結(jié)構(gòu)完整性扮演重要角色[5]。β-環(huán)糊精能夠結(jié)合膽固醇,導(dǎo)致caveolae在細(xì)胞膜上的形態(tài)發(fā)生變化,變得扁平,數(shù)目減少,從而影響其多數(shù)激酶活性抑制劑的生物學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)用5 mmol/Lβ-CD孵育細(xì)胞30 min后,發(fā)現(xiàn)在該時(shí)間點(diǎn)左右caveolin-1表達(dá)下降幅度最大,可能與小凹結(jié)構(gòu)的破壞以及小凹數(shù)目急劇減少有關(guān)。流失細(xì)胞儀也發(fā)現(xiàn),給予β-CD,細(xì)胞PI值增大,與CGRP+H2O2組相比,S期細(xì)胞數(shù)目增加;預(yù)先加入膽固醇,該作用被削弱,說(shuō)明caveolae在CGRP促進(jìn)氧化損傷HUVECs S增殖過(guò)程中可能起負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。值得注意的是有文獻(xiàn)[6]指出一定劑量的β-CD能夠使內(nèi)皮細(xì)胞的活力下降,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,加用β-CD處理細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率較其他處理因素組有所增加。因此,應(yīng)用β-環(huán)糊精破壞小凹結(jié)構(gòu)引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差,可能與β-CD處理細(xì)胞的時(shí)間和劑量是否有關(guān),這還需進(jìn)一步闡明。本實(shí)驗(yàn)光鏡下顯示,β-CD處理細(xì)胞后,雖然細(xì)胞密度有所增加,但形態(tài)也發(fā)生變化。恢復(fù)膽固醇細(xì)胞形態(tài)也與正常細(xì)胞有所不同,推測(cè)破壞小凹結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的功能可能有影響。

Caveolin-1是組成caveolae結(jié)構(gòu)和維持其完整性的所必需膜蛋白,并且前期工作證明caveolin-1參與負(fù)性調(diào)控細(xì)胞增殖的作用[7]。Caveolin-1已作為研究caveolae結(jié)構(gòu)和功能以及caveolae/caveolin-1復(fù)雜的生物學(xué)功能的標(biāo)志蛋白和工具。本實(shí)驗(yàn)用5 mmol/Lβ-CD處理細(xì)胞30 min,caveolin-1表達(dá)顯著下降;能增強(qiáng)并放大CGRP對(duì)受損細(xì)胞的增殖作用;流式結(jié)果也表明CGRP預(yù)孵育細(xì)胞30 min使H2O2組S期細(xì)胞明顯增多,這一增強(qiáng)效應(yīng)在caveolae結(jié)構(gòu)被破壞后得到放大,可被膽固醇削弱。由此可見(jiàn),CGRP可能是通過(guò)推進(jìn)HUVECs的G1→S期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。Western-Blot結(jié)果顯示同樣的效應(yīng):破壞caveolae后,CGRP下調(diào)氧化損傷HUVECs caveolin-1作用更明顯。說(shuō)明內(nèi)皮細(xì)胞膜表面caveolae結(jié)構(gòu)或者數(shù)量表達(dá)的差異可能是調(diào)節(jié)CGRP受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響因素。實(shí)驗(yàn)對(duì)擬破壞小凹結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞加以膽固醇的供給,發(fā)現(xiàn)膽固醇逆轉(zhuǎn)了β-CD上述的放大效應(yīng),外源性膽固醇結(jié)合了β-CD,通過(guò)阻止β-CD結(jié)合細(xì)胞膜膽固醇破壞小凹結(jié)構(gòu),間接促進(jìn)細(xì)胞膜膽固醇與caveolin-1相連形成caveolae,恢復(fù)其與各種受體結(jié)合的能力,而發(fā)揮caveolin-1對(duì)增殖信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。值得提出的是雖然剝奪膽固醇破壞小凹結(jié)構(gòu)可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目,但就內(nèi)皮細(xì)胞的功能影響來(lái)說(shuō)是否受到影響還需進(jìn)一步研究。

[1]鄧水秀,秦旭平.降鈣素基因相關(guān)肽的血管生物學(xué)功能多樣性[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2006,26(3):246-249.

[2]Santibanez JF,Blanco FJ,Garrido-Martin EM,et al.Caveolin-1 interacts and cooperates with the transforming growth factor-βtype 1 receptor ALK-1 in endothelial caveolae[J].Cardiovasc Res,2008,77(3):791-799.

[3]周孝錢(qián),許俊,唐江瓊,等.CGRP對(duì)氧化損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及Caveolin-1表達(dá)的影響[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2011,39(2):131-134.

[4]CalòLA1,Dal Maso L,Pagnin E,et al.Effect of olmesartan medoxomil on number and survival of circulating endothelial progenitor cells and calcitonin gene related peptide in hypertensive patients[J].J Hypertens,2014,32(1):193-199.

[5]Suetsugu S,Kurisu S,Takenawa T.Dynamic shaping of cellular membranes by phospholipids and membrane-deforming proteins[J].Physiol Rev,2014,94(4):1219-1248.

[6]Kline MA,O'Connor Butler ES,Hinzey A,et al.A simple method for effective and safe removal of membrane cholesterol from lipid rafts in vascular endothelial cells:implications in oxidant-mediated lipid signaling.Methods Mol Biol.2010;610:201-211.

[7]Chen Y,Dai Z,Liu YM,et al.Inhibitory effects of CGRPon vascular smooth muscle cell proliferation:Role of caveolae/caveolin-1/ERK1/2 signal pathway[J].Progress in Biochemistry and Biophysics,2013,40(5):445-453

Role of Caveolae in the Protection of CGRP on the HUVECs Injury Induced by Oxidative

ZHU Yi,ZHOU Xiaoqiang,XIAO Yunbin,et al
(Department of Orthopaedic Surgery,the Second Affiliating Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective To study the role of caveolae on the protective effect of cacitonin gene-related peptide(CGRP)on human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)injury induced by oxidative stress. Methods HUVECs were cultured in vitro,and treated with CGRPor/and hydrogen peroxide(H2O2),the distribution of cell cycles and proliferation of cells were observed by flow cytometry.The density and morphology of cells were observed by optical microscope,β-cyclodextrin(β-CD)was used to injured the structure of caveolae,expression of caveolin-1 was measured by Western blot. Rethods Compared with control group,treatment of CGRPincreased proliferation index(PI)and the number of S phase cells which were inhibited by H2O2;Destruction of caveolae structure could increase the density of cells and change the cells shape;The expression of caveolin-1 was down-regulated by CGRPbut up-regulated by H2O2,respectively.Pretreatment with CGRP,the up-regulation of caveolin-1 induced by H2O2was significantly reverted(P＜0.05).Pretreatment ofβcyclodextrin with cells,the expression of caveolin-1 induced by CGRP was furtherly decressed. Conclusions the destruction of caveolae could increased the proliferative effect of CGRPon HUVECs induced by H2O2,the mechanism involvein change of the expression of caveolin-1.

H2O2; CGRP; caveolin-1; caveolae; endothelial cells

R331.36

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.003

2014-11-02;

2014-12-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(30572192),湖南省青年科學(xué)基金課題(13JJ4121).

*通訊作者,E-mail:qinxp333@hotmail.com.

(此文編輯:秦旭平)