水生動物疾病快速檢測技術應用情況研究

◎ 文/張翔 余衛(wèi)忠 蔡晨旭 周密 裴育 馮東岳*

水生動物疾病快速檢測技術能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場篩查，減少帶病流通和帶病養(yǎng)殖等問題，是彌補實驗室檢測周期長、步驟復雜等短板的有效措施，對提升水生動物疾病防控能力、確保養(yǎng)殖生產(chǎn)安全具有重要意義。本研究通過數(shù)據(jù)調(diào)度和實地調(diào)研相結(jié)合的方式，重點就快速檢測常用技術、產(chǎn)品基本情況、產(chǎn)品管理和應用情況、當前主要問題等進行分析，有針對性地提出推動優(yōu)化審批流程、開展產(chǎn)品比對評價、健全完善標準技術、提升科技支撐能力等監(jiān)管建議。

水生動物疾病問題是實現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的瓶頸因素之一。目前，水生動物疾病的診斷、監(jiān)測和檢疫主要以實驗室檢測為主，存在檢測周期長、步驟復雜、難以滿足市場需求等問題。應用快速檢測技術能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場迅速篩查，減少帶病流通和帶病養(yǎng)殖等問題，對提升水生動物疾病防控能力、確保養(yǎng)殖生產(chǎn)安全具有重要意義。

全國水產(chǎn)技術推廣總站、中國水產(chǎn)學會組織成立調(diào)研組先后赴江蘇省、浙江省、廣東省等地進行專題調(diào)研，開展解剖麻雀式調(diào)研，堅持問題導向，既要“把準脈”，更要“開對方”，找到解決問題的辦法?？傮w看，作為實驗室檢測的有力補充，近年來各水產(chǎn)科研院所、高校、企業(yè)等積極開展了水生動物疾病快速檢測技術研發(fā)工作，取得了一定進展，部分產(chǎn)品可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，彌補了實驗室檢測在時效性方面的短板，做到早發(fā)現(xiàn)，早控制。但也存在新產(chǎn)品申請注冊難、標準體系不健全、自主創(chuàng)新能力弱等問題，亟需進一步研究推動解決。

一、水生動物疾病快速檢測常用技術

目前，水生動物疾病快速檢測產(chǎn)品的研發(fā)主要基于分子生物學技術。

（一）分子生物學檢測技術

分子生物學檢測技術通過捕捉鑒定目標病原體的核酸分子以證實病原，近年來在水產(chǎn)病原快速檢測領域發(fā)展迅速。需要注意的是，當分子生物學檢測結(jié)果為陽性時，僅表示檢測樣品中存在病原體的核酸，并不能證明樣品中存在具有感染性的病原體，應綜合考慮臨床癥狀、流行病學等證據(jù)進行判斷。

1.聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）

通過體外擴增水生動物樣品中的特異性靶基因序列檢測病原，其中實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR）是通過設計特異性的熒光標記核酸探針或加入染料，進行PCR擴增來檢測熒光強度，達到鑒定PCR產(chǎn)物（病原體核酸）的技術。該技術以其敏感、特異、穩(wěn)定、可定量的優(yōu)點在我國水生動物疾病檢測實踐中廣泛應用。但qPCR需要由專業(yè)人員使用熱循環(huán)設備在實驗室環(huán)境內(nèi)操作，這限制了該方法在現(xiàn)場篩查和低資源地區(qū)的使用。

2.環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）

該技術可在60℃～65℃、20min～60min實現(xiàn)109倍～1010倍的恒溫核酸擴增。LAMP技術特異性較強，不依賴變溫設備，擴增結(jié)果觀察便捷，適用于即時檢測，且專利保護已經(jīng)過期。但其引物設計難度較高，難以擴增500bp以上的長鏈靶序列。

3.重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）和重組酶介導等溫擴增技術（Recombinase Aided Amplification，RAA）

RPA和RAA能夠?qū)崿F(xiàn)在37℃～42℃的恒溫范圍內(nèi)快速擴增目標核酸。RAA是對RPA的改良，反應的溫度適應性更強。兩種方法對設備要求低，反應試劑已能夠以凍干形式提供。不足之處在于不適合較短靶序列的檢測，并且沒有專門的引物設計軟件。

4.微流控芯片技術

使用微管道（微米級）處理或操縱微小流體，把分離、檢測等操作單元集成到一塊微米尺寸的芯片上，借由微管道形成的網(wǎng)絡，使流體以可控的形式貫穿系統(tǒng)并完成分析全過程的技術。具有體積輕巧、樣品試劑用量少等優(yōu)點，可為LAMP等方法提供微量密閉反應空間，有助于實現(xiàn)高通量和避免氣溶膠污染，提高檢測結(jié)果的準確性。

（二）免疫學檢測技術

免疫學檢測是利用特異性抗原抗體反應檢測病原的診斷技術。由于軟體動物和甲殼動物在病原感染后無抗體產(chǎn)生，難以進行免疫學檢測；魚類和兩棲類存在研究基礎較為薄弱、純病毒獲取難度高導致抗體制備難度較大等問題，免疫學方法進展相對較慢。

1.酶免疫技術

在獸用快速診斷中應用較為廣泛的主要是酶聯(lián)免疫吸附技術（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA），是利用酶標記抗原或抗體以檢測相應抗原或抗體的一種免疫學標記技術。相比于其他一些免疫學檢測方法，ELISA敏感性高、特異性強、檢測時間較短，結(jié)果容易判讀，可實現(xiàn)半定量甚至定量檢測。

2.膠體金技術

膠體金免疫技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的免疫標記技術。目前運用最多的膠體金免疫層析技術（Colloidal Gold Immunochromatography Assay，GICA），以其快速簡便、可對單樣本檢測、可肉眼判讀、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，已成為常用的免疫檢測技術之一。

二、水生動物疾病快檢產(chǎn)品基本情況

本次調(diào)研共收到368條快速檢測產(chǎn)品的問卷信息，去重后得到來自14家企業(yè)的261條產(chǎn)品信息，其中試劑盒類258種，小型儀器設備3種，但沒有產(chǎn)品通過獸藥審批。

（一）檢測試劑盒情況

從疾病類別看，以魚類和蝦類快檢產(chǎn)品為主。共收到魚類疾病快檢試劑盒信息132條，占比51.16%；蝦類試劑盒信息106條，占比41.09%；蟹類、貝類、鱉等其他類共20條，合計占比7.75%。檢測病原涵蓋了魚、蝦、蟹、貝等類別的主要養(yǎng)殖品種。此外，除鮑皰疹病毒病、牡蠣皰疹病毒病和兩棲類蛙虹彩病毒病外，已覆蓋了《一、二、三類動物疫病病種名錄》中全部水生動物病毒病及部分細菌病、寄生蟲病。

從技術原理看，主要采用熒光定量P C R（q P C R）和等溫擴增技術（LAMP）。共收到基于分子生物學原理的產(chǎn)品256條，其中PCR法151條（qPCR法135條）、占比58.5%，等溫擴增法105條、占比40.7%（其中，LAMP法79條，RAA及RPA法共26條，分別占比30.6%和10.1%）；基于免疫學原理的產(chǎn)品2條，占比0.8%，均處于研發(fā)階段。14家生產(chǎn)企業(yè)中，有10家基于qPCR/PCR法進行研發(fā)，可能與現(xiàn)行水生動物疾病診斷標準中多采用qPCR/PCR法有關。

從檢測成本看，單樣本單指標檢測費用普遍在30元～50元。檢測時間根據(jù)技術原理不同有所差別，基于等溫擴增法（LAMP、RAA）的產(chǎn)品，檢測時間在0.5h～1h；基于qPCR法的產(chǎn)品PCR反應時間在1h～1.5h。需要注意的是，基于qPCR原理的快檢產(chǎn)品一般需要進行前處理，即樣品的核酸提取。有的快檢產(chǎn)品沒有包含核酸提取所需的試劑及耗材，需要單獨購買用于核酸提取的試劑盒，這部分的費用和時間（約30min）可能沒有計入廠家反饋的檢測價格和檢測時間。

（二）檢測設備情況

水生動物病原快速檢測設備大多基于qPCR法，以打造便攜的“實驗室”為主要目的，如廣州雙螺旋基因技術有限公司和浙江正合谷生物科技有限公司生產(chǎn)的手提式移動“實驗室”等。這類檢測設備一般包含三個部分：一套固定的檢測箱，包括用于振蕩、離心、加熱的儀器；一套試劑盒，用于檢測（不同）病原的試劑盒；一套相關軟件，用于處理試驗流程及結(jié)果。

三、水生動物疾病快檢產(chǎn)品管理、研發(fā)、生產(chǎn)和應用情況

（一）管理方面

《獸藥管理條例》明確用于診斷動物疾病的診斷制品屬于獸藥，《獸用生物制品經(jīng)營管理辦法》明確獸醫(yī)診斷制品納入獸用生物制品管理。在新產(chǎn)品研發(fā)方面，實施注冊管理；在企業(yè)準入方面，實施獸藥生產(chǎn)許可證和獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）管理。對申請批準文號的，依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》和國家標準進行審查和核發(fā)，對申請批簽發(fā)的按批簽發(fā)程序進行審核。據(jù)了解，目前沒有任何一種水生動物疾病快檢產(chǎn)品通過獸藥審批。

（二）研發(fā)方面

通過中國專利檢索平臺檢索及初步統(tǒng)計，水生動物疾病診斷或檢測相關的授權發(fā)明專利共248項，包含魚類121項、蝦類87項、蟹類12項、貝類21項、其他類7項，獲得授權的申請單位以水產(chǎn)科研教學單位為主，通過成果轉(zhuǎn)化等方式與企業(yè)開展合作，進行推廣應用。近年來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、科學技術部、國家自然科學基金委員會等部門機構的一些科研項目中，包含水生動物疾病快速檢測技術開發(fā)與應用等內(nèi)容。

（三）生產(chǎn)方面

本次調(diào)研的生產(chǎn)企業(yè)有14家，規(guī)模大小不一，注冊資金差異較大，最低為100萬元，最高為8000萬元。生產(chǎn)企業(yè)主要分布在沿海省份，整體呈現(xiàn)由南至北遞減的趨勢。其中，具備GMP認證生產(chǎn)車間的共5家，占比36%。

（四）應用方面

應用方面主要集中在三個環(huán)節(jié)，為養(yǎng)殖水生動物或水產(chǎn)品檢測提供初篩結(jié)果。一是養(yǎng)殖生產(chǎn)環(huán)節(jié)。從種源到養(yǎng)成水產(chǎn)品流入餐桌，包括育種公司、育苗公司、苗種標粗場，養(yǎng)殖戶和流通商等。二是生產(chǎn)服務環(huán)節(jié)，包括水產(chǎn)養(yǎng)殖調(diào)水用品銷售門店、水產(chǎn)飼料銷售門店、社會第三方檢測機構和保險公司等。三是流通監(jiān)管環(huán)節(jié)，包括水產(chǎn)技術推廣系統(tǒng)、水生動物疾病預防控制系統(tǒng)和海關部門等。

四、存在問題

（一）“證”的問題，獲得注冊審批難

水生動物疾病診斷產(chǎn)品需申請獸藥注冊證書。按照《獸醫(yī)診斷制品注冊分類及注冊資料要求》，臨床試驗“由不少于3家獸醫(yī)實驗室對3批診斷制品進行適應性檢測，并出具評價報告”，其中，“獸醫(yī)實驗室”應為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部考核合格的省級以上獸醫(yī)主管部門設置的獸醫(yī)實驗室。但目前我國“獸醫(yī)實驗室”主要承擔陸生動物疫病檢測相關技術支撐工作，尚不覆蓋水生動物疾病內(nèi)容。目前水生領域沒有實驗室通過獸醫(yī)實驗室考核。如在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部設立的水生動物疫病重點實驗室或《國家水生動物疫病監(jiān)測計劃》參考實驗室等水生領域?qū)嶒炇议_展臨床試驗，則可能存在由于不能滿足法規(guī)要求，導致注冊申報無效的風險。水生動物疾病快檢產(chǎn)品臨床驗證難。

（二）“用”的問題，管理機制不健全

藥殘檢測等食品安全領域的快檢技術已由《食品安全法》和《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》明確了法律地位和適用范圍，而水生動物疾病快檢僅在《魚類產(chǎn)地檢疫規(guī)程》《甲殼類產(chǎn)地檢疫規(guī)程》《貝類產(chǎn)地檢疫規(guī)程》中，明確了在水產(chǎn)苗種產(chǎn)地檢疫工作中可應用“農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準的快速檢測試劑盒進行檢測”。在快檢技術可應用的其他領域，例如育苗、疾病監(jiān)測、水產(chǎn)品初加工原料檢測等環(huán)節(jié)沒有明確規(guī)定，快檢的具體適用范圍、效力等尚處于空白狀態(tài)，采用快檢得到的陽性結(jié)果不能直接作為定性及檢疫依據(jù)，仍需送實驗室檢測以獲得檢測報告。因此，亟須進一步明確快檢技術在水生動物疾病全鏈條防控中的作用和地位。

（三）“標”的問題，標準體系不完善

快速檢測技術涉及的學科領域較多，唯一的國家標準《快速檢測 術語與定義》屬于術語類標準。在行業(yè)標準方面，目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的含有水生動物疾病快速檢測方法的7項行業(yè)標準均采用LAMP法，疾病種類包括鯉春病毒血癥、草魚出血病、傳染性造血器官壞死病、鯉浮腫病、桃拉綜合征、白斑綜合征、對蝦病毒性偷死病，尚不能覆蓋疫病名錄中魚類和甲殼類的病毒病等，快檢標準數(shù)量不足，方法單一，難以滿足行業(yè)實際需求。此外，標準物質(zhì)的缺失制約了診斷制品發(fā)展。各生產(chǎn)單位目前所用的“質(zhì)量標尺”各不相同，直接影響了產(chǎn)品性能評價，可能出現(xiàn)不同廠家的產(chǎn)品，對同一樣品的檢測出現(xiàn)結(jié)果差異。

（四）“質(zhì)”的問題，自主創(chuàng)新能力弱

多數(shù)快檢產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)規(guī)模較小、資金實力偏弱、研發(fā)投入比例小，缺乏自主知識產(chǎn)權，技術水平良莠不齊，存在低水平重復研究、產(chǎn)品同質(zhì)化等問題。部分企業(yè)自身不具備GMP資質(zhì)，不同批次產(chǎn)品的質(zhì)量存在波動。整體來看，現(xiàn)有的水生動物疾病快檢產(chǎn)品檢測假陽性率偏高，靈敏度、精確性、可重復性等性能普遍不夠穩(wěn)定，部分關鍵酶主要依靠進口；產(chǎn)品對檢測人員的技術水平仍有一定要求，無法實現(xiàn)“樣品進，結(jié)果出”，檢測成本仍然偏高，技術水平及自主創(chuàng)新能力需要進一步提升。

五、對策建議

（一）推動優(yōu)化審批流程

一是加強與獸藥審批部門對接?？紤]到體外診斷制品強調(diào)特異性、敏感性，不直接作用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，對動物群體及個體不存在安全風險，與對疫苗及血清的安全、有效、穩(wěn)定的要求有所不同。建議結(jié)合實際簡化申報技術要求，實施與預防、治療用生物制品的差別化管理，縮短準入周期。二是推動出臺水生動物防疫實驗室規(guī)范管理制度，啟動國家水生動物疾病參考實驗室、專業(yè)實驗室申報與評估，為快檢產(chǎn)品開展臨床試驗、標準物質(zhì)和標準樣品制備等工作提供技術支撐。

（二）開展產(chǎn)品比對評價

2022年新修訂的《魚類產(chǎn)地檢疫規(guī)程》《甲殼類產(chǎn)地檢疫規(guī)程》《貝類產(chǎn)地檢疫規(guī)程》為快檢產(chǎn)品應用留出了空間。針對目前沒有快檢產(chǎn)品獲得新獸藥批準文號的現(xiàn)狀，建議可參照陸生動物疫病快檢產(chǎn)品評價方法，對水生動物疾病診斷產(chǎn)品實施評價和指定使用范圍。在現(xiàn)行注冊基礎上，委托國家水生動物疾病參考實驗室提供標準物質(zhì)，并開展水生動物快速診斷產(chǎn)品的比對評價，經(jīng)評價合格后用于水產(chǎn)苗種產(chǎn)地檢疫、國家或地方水生動物疾病監(jiān)測等工作，為相關工作提供參考和技術支撐。

（三）健全完善標準技術

目前，單一的水生動物疾病快速檢測診斷方法已不能作為國家標準或行業(yè)標準單獨立項。建議相關單位在制修訂水生動物疾病診斷方法類標準時，可將成熟適用的快速檢測方法納入其中，為出具檢測報告等提供相關依據(jù)，并鼓勵相關企業(yè)積極參與到標準制修訂工作中。同時，考慮到在流行病學方面病原菌株/毒株的變化，針對核酸擴增類快檢產(chǎn)品，應根據(jù)病原的主要流行株及時更新引物、探針等，以提高檢測的特異性和敏感性，更好地滿足市場需求。

（四）提升科技支撐能力

一是突出政府規(guī)范管理的導向性。針對產(chǎn)品同質(zhì)化嚴重，產(chǎn)品以仿制為主的問題，從審批端入手，在新獸藥證書、批準文號審批上嚴格把關，提升產(chǎn)品質(zhì)量控制水平。通過研究開發(fā)費用稅前加計扣除等政策，引導企業(yè)加大研發(fā)投入。二是強化企業(yè)科技創(chuàng)新主體地位。國外獸用生物制品企業(yè)多具有較強的研發(fā)創(chuàng)新能力，研發(fā)投入一般占年銷售額10%～15%。引導有條件的企業(yè)加大科研投入，建立研發(fā)中心，聯(lián)合水產(chǎn)科研教學單位開展產(chǎn)學研合作，開發(fā)水生動物疾病快速診斷和高通量檢測產(chǎn)品，不斷夯實酶、抗體等診斷關鍵試劑的研制基礎，搭建推廣應用平臺，向?qū)I(yè)化和規(guī)模化發(fā)展。