流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血白血病細(xì)胞在AL復(fù)發(fā)的臨床價(jià)值研究

方健源，謝碧霞，羅 韜，胡淑芬，譚冬梅

(1.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州511400;2.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院血液科，廣東廣州511400)

隨著白血病治療方案的改進(jìn)，白血病治療水平不斷提高，急性白血病(acute leukemia，AL)有了較高的緩解率，但仍有相當(dāng)一部分患者復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為造成白血病復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素是白血病經(jīng)治療后體內(nèi)仍殘留少量的腫瘤細(xì)胞，即存在微小殘留病變(minimal residual disease，MRD)，這些腫瘤細(xì)胞的克隆增殖導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)。白血病細(xì)胞通常表達(dá)異常的表面抗原表型，即白血病相關(guān)表型[1]，具有異常光散射特性，因此能與正常造血成分相互區(qū)別。聯(lián)合利用多種單克隆抗體，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)可以同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞表面不同抗原表達(dá)的多參數(shù)熒光信號(hào)，進(jìn)而識(shí)別完全緩解后混于正常造血細(xì)胞中的MRD。本研究收集AL患者的骨髓和外周血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析，探討FCM檢測(cè)外周血白血病細(xì)胞在AL復(fù)發(fā)的臨床價(jià)值。

材料和方法

一、研究對(duì)象

選擇2012年1月至2013年12月廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院血液科收治的71例AL患者(不包括急性早幼粒細(xì)胞白血病患者)，其中急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)44例、急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)27例，于達(dá)完全緩解時(shí)及鞏固化療期間監(jiān)測(cè)。診斷符合FAB及2008年世界衛(wèi)生組織的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。

二、方法

1.多參數(shù)FCM 采集外周血乙二胺四乙酸二鉀抗凝，利用四色熒光(4種熒光素分別為異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白、別藻青蛋白、多甲藻葉綠素蛋白)直接免疫標(biāo)記法進(jìn)行免疫分型檢測(cè)。在每支檢測(cè)試管中加1×106有核細(xì)胞。根據(jù)每例患者的白血病特點(diǎn)選擇單克隆抗體組合(試劑均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品)，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。至少收集10萬(wàn)個(gè)可供分析的有核細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)收集細(xì)胞，每支試管用配套的CellQuest軟件分析細(xì)胞標(biāo)志。根據(jù)原始細(xì)胞上抗原是否跨系表達(dá)、表達(dá)不同步(不同階段的抗原同時(shí)表達(dá))、表達(dá)過(guò)強(qiáng)、表達(dá)過(guò)弱、丟失等判定是否為MRD，MRD≥0.01% 為陽(yáng)性，否則為陰性。

2.骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè) 骨髓液涂片6～8張，經(jīng)吉姆薩-瑞士染色后，在日本OLYMPAS顯微鏡油鏡下分類(lèi)200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)形態(tài)進(jìn)行不同階段的分類(lèi)計(jì)數(shù)。根據(jù)張之南等[3]主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)判斷療效是否為復(fù)發(fā)。

三、治療方案

AML(非M3)的誘導(dǎo)化療方案采用柔紅霉素加阿糖胞苷、去甲氧柔紅霉素加阿糖胞苷或米托蒽醌加阿糖胞苷方案。骨髓達(dá)完全緩解后采用原方案鞏固強(qiáng)化治療2個(gè)療程，然后分別用中或大劑量阿糖胞苷治療，完成4個(gè)療程休息2個(gè)月，用柔紅霉素加阿糖胞苷和米托蒽醌加阿糖胞苷方案交替治療2個(gè)療程，每療程間隔3個(gè)月，此后停止化療，定期隨訪。ALL治療:誘導(dǎo)緩解為VDCP方案(長(zhǎng)春新堿 2 mg，第 1、8、15、22 天;柔紅霉素45 mg/m2，第1天至第3天，第15天至第16天;環(huán)磷酰胺1 000 mg/m2，第1、15天;潑尼松每天1 mg/kg，14 d)，完全緩解后進(jìn)入鞏固強(qiáng)化治療。

71例AL患者在誘導(dǎo)化療結(jié)束獲得完全緩解后開(kāi)始隨訪，至復(fù)發(fā)隨訪結(jié)束，未復(fù)發(fā)隨訪至今，隨訪時(shí)間1～24個(gè)月，中位數(shù)16個(gè)月。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、FCM檢測(cè)AL患者外周血MRD

以FAB分型骨髓形態(tài)學(xué)作為判斷復(fù)發(fā)的金標(biāo)準(zhǔn);部分患者定期接受多次檢查，外周血MRD結(jié)果以首次結(jié)果為準(zhǔn)。FCM檢測(cè)外周血MRD對(duì)提示AML和ALL復(fù)發(fā)的敏感性和特異性見(jiàn)表1。

表1 FCM檢測(cè)外周血MRD對(duì)提示AL復(fù)發(fā)的敏感性和特異性 [例(%)]

二、外周血 MRD陰性組與陽(yáng)性組復(fù)發(fā)率比較

12例外周血MRD陰性組中有3例(25.0%)患者復(fù)發(fā)，59例外周血MRD陽(yáng)性組中有44例(74.6%)復(fù)發(fā)，MRD陽(yáng)性組復(fù)發(fā)率明顯高于MRD陰性組(P＜0.05)。外周血MRD陰性組與陽(yáng)性組在24個(gè)月隨訪期間的復(fù)發(fā)率比較見(jiàn)圖1。

三、高低外周血MRD水平復(fù)發(fā)率比較

59例AL患者外周血MRD定量值按高M(jìn)RD水平(≥10－2)和低 MRD水平(＜10－2)分成 2組，高M(jìn)RD水平組38例，低MRD水平組21例。2組復(fù)發(fā)例數(shù)分別是37例(97.4%)和10例(47.6%)。高M(jìn)RD水平組復(fù)發(fā)率明顯高于低MRD水平組(P ＜0.05)。

圖1 外周血MRD陰性組與陽(yáng)性組復(fù)發(fā)率比較

討 論

多參數(shù)FCM的免疫分型對(duì)MRD的檢測(cè)已成為研究AL的基本手段，并為AL的診斷、治療及預(yù)后判斷提供重要依據(jù)。趙利東等[4]研究提出誘導(dǎo)治療能殺死大量的白血病細(xì)胞，但尚未徹底清除，少數(shù)患者初次誘導(dǎo)緩解時(shí)MRD值持續(xù)陽(yáng)性直至復(fù)發(fā)。是否達(dá)到完全緩解以及緩解的程度是影響患者預(yù)后的重要參數(shù)之一。臨床上對(duì)AL治療效果的評(píng)價(jià)主要通過(guò)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，其具有一定的局限性，骨髓穿刺取材只能反映一部分的骨髓情況。采用骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)一般在體內(nèi)白血病細(xì)胞數(shù)超過(guò)1%時(shí)方能檢測(cè)到，而體內(nèi)MRD的持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致患者最終白血病的復(fù)發(fā)。從患者角度出發(fā)，反復(fù)骨髓穿刺難以接受，而外周血取材方便，采集外周血無(wú)疑更合適。為此，我們針對(duì)AL患者的骨髓和外周血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析，探討FCM檢測(cè)外周血白血病細(xì)胞在AL復(fù)發(fā)的臨床價(jià)值。

我們用FCM檢測(cè)了71例AL患者的外周血MRD，發(fā)現(xiàn)外周血MRD與患者的預(yù)后有明顯的相關(guān)性。FCM檢測(cè)AL患者的外周血MRD對(duì)提示AL復(fù)發(fā)具有較高的敏感性，AML組與ALL組的敏感性分別為96.6%和88.9%。MAURILLO等[5]將外周血作為 MRD的檢測(cè)對(duì)象，結(jié)果顯示外周血MRD同樣與AML患者的長(zhǎng)期預(yù)后相關(guān)，提示外周血循環(huán)原始細(xì)胞的存在可能與骨髓中的白血病細(xì)胞的持續(xù)存在有關(guān)。本研究中有15例外周血MRD陽(yáng)性但骨髓形態(tài)學(xué)檢查未達(dá)到復(fù)發(fā)的程度，這就提示此部分患者需要進(jìn)一步追蹤觀察，以便采取下一步治療方案。MRD是一個(gè)強(qiáng)烈提示緩解和復(fù)發(fā)的預(yù)后因素。臨床應(yīng)用MRD檢測(cè)可有效指導(dǎo)完全緩解后的治療，根據(jù)MRD的水平進(jìn)行預(yù)后分級(jí)及選擇相應(yīng)的化療方案等。若MRD持續(xù)陰性，可停止治療;若MRD持續(xù)陽(yáng)性，應(yīng)給予患者更強(qiáng)的化療，或考慮骨髓移植。朱勇梅等[6]對(duì)骨髓和外周血中MRD水平比較發(fā)現(xiàn)，兩者會(huì)因檢測(cè)時(shí)間、疾病亞型和治療方案的不同而有所不同，但存在一定的比例關(guān)系。BUCCISANO等[7]認(rèn)為外周血的檢測(cè)同骨髓一樣有意義，如果同時(shí)檢測(cè)外周血及骨髓，可能提高檢出率。如果鞏固化療后外周血的MRD水平高于0.015%，復(fù)發(fā)概率增加。外周血白血病細(xì)胞水平可間接反映骨髓情況，用于治療監(jiān)測(cè)。COUSTAN-SMITH 等[8]研究結(jié)果顯示，在 T-ALL骨髓與外周血MRD有很好的一致性，外周血可以用于檢測(cè)MRD;而在B-ALL，骨髓MRD檢出率高于外周血，但用外周血檢測(cè)MRD可以提供強(qiáng)大的預(yù)后信息。

本研究中12例外周血MRD陰性組復(fù)發(fā)率為25.0%，59例外周血 MRD陽(yáng)性組復(fù)發(fā)率為74.6%，MRD陽(yáng)性組復(fù)發(fā)率明顯高于MRD陰性組，結(jié)果與文獻(xiàn)[9]相近。國(guó)外研究提出，在鞏固治療后用FCM檢測(cè)患者的MRD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每一個(gè)危險(xiǎn)層的MRD陽(yáng)性患者與陰性患者在無(wú)病生存率和總生存率上都有顯著差異。MRD陽(yáng)性患者總的復(fù)發(fā)率為74%，而MRD陰性患者的復(fù)發(fā)率僅為 27%[10]。PAWINSKA等[11]認(rèn)為誘導(dǎo)緩解末 MRD≥10－4的患者需要在治療過(guò)程中嚴(yán)密監(jiān)測(cè)MRD的變化，以便及時(shí)采取有效的治療措施。

本研究表明，高M(jìn)RD水平組復(fù)發(fā)率明顯高于低 MRD水平組。張芳等[12]研究結(jié)果表明，F(xiàn)CM檢測(cè)的MRD水平與復(fù)發(fā)明顯相關(guān)。童春容等[13]提出，大多數(shù)AL為中等危險(xiǎn)性患者，而且即使是一些低危險(xiǎn)性AL患者化療后也會(huì)復(fù)發(fā)，尤其是成年白血病患者，化療后的復(fù)發(fā)率仍較高。因此需要更多的預(yù)后及檢測(cè)療效的指標(biāo)，幫助指導(dǎo)更加個(gè)體化的治療。

綜上所述，F(xiàn)CM檢測(cè)外周血白血病細(xì)胞能很好地提示復(fù)發(fā)，且外周血取材方便，創(chuàng)傷性相對(duì)較輕，對(duì)診斷AL復(fù)發(fā)及指導(dǎo)個(gè)體化治療有重要意義。

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