毛細(xì)管電泳法測定螺內(nèi)酯片劑中螺內(nèi)酯的含量

于海霞，李 露，馬慧芬，張紅芬，陳安家(山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點實驗室，太原03000;山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院;通訊作者，E-mail:chenanjia888@63．com;共同通訊作者，E-mail:zhanghf_007@6．com)

螺內(nèi)酯片是一種弱的保鉀利尿藥，主要用于水腫性疾病、高血壓、原發(fā)性醛固酮增多癥、低鉀血癥的預(yù)防等。其主要成分螺內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)與醛固酮相似，可與醛固酮競爭遠曲小管及集合管細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的醛固酮受體，進而影響醛固酮和受體結(jié)合，從而阻礙醛固酮誘導(dǎo)蛋白的合成，抑制K+-Na+交換，使鉀的排出減少，可起到保鉀利尿作用［1］。

螺內(nèi)酯片的主要成分螺內(nèi)酯又名安體舒通、螺旋內(nèi)酯，分子式為C24H32O4S，為白色或類白色細(xì)微結(jié)晶性粉末，無臭或有輕微硫醇臭，微有苦味。不溶于水，溶于乙醇，易溶于苯或醋酸乙酯，極易溶于氯仿，熔點 207-208 ℃，其結(jié)構(gòu)如圖 1［2］。

圖1 螺內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of spironolactone

通過系統(tǒng)地查閱國內(nèi)外相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，目前文獻報道的螺內(nèi)酯含量測定方法多采用 HPLC 法［2，3］，尚未見用毛細(xì)管電泳法對螺內(nèi)酯片中螺內(nèi)酯進行含量測定的相關(guān)報道。考慮到毛細(xì)管電泳技術(shù)在藥物分析方面具有高效、快速、分離效能高、進樣量少、污染小及應(yīng)用越來越廣泛等優(yōu)點［4］，本文采用毛細(xì)管電泳法對市售螺內(nèi)酯片中螺內(nèi)酯進行含量測定。

1 儀器與試劑

無水甲醇和乙腈均為分析純，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，二水磷酸二氫鈉，超純水，螺內(nèi)酯片(浙江杭州民生藥業(yè)有限公司，批號:T14J048、T10J504;上海信誼藥廠有限公司，批號:046140702)，螺內(nèi)酯對照品(中國食品藥品檢定研究院)。P/ACE MDQ貝克曼庫爾特毛細(xì)管電泳儀［貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司］，SB-120DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，PHS-3G型PH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，F(xiàn)A2004電子天平(上海衡平儀器儀表廠);

2 方法與結(jié)果

2．1 樣品溶解性的考察

螺內(nèi)酯屬于內(nèi)酯類，不溶于水，易溶于有機溶劑，故溶解時用甲醇而不能用水作為溶劑。實驗采用無水甲醇20 ml溶解螺內(nèi)酯片后用pH 6．5濃度為0．02 mol/L的磷酸鹽緩沖液定容至100 ml，溶液無混濁;若供試品溶液中不加上述緩沖液，峰拖尾嚴(yán)重。故實驗選擇使用無水甲醇20 ml溶解螺內(nèi)酯片后用 pH 6．5濃度為0．02 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋定容至100 ml，搖勻后靜置，待淀粉等輔料沉淀后樣品溶液澄清透明。每次進樣前吸取上清液并用0．45 μm 微孔濾膜過濾。

2．2 溶液的配制

2．2．1 緩沖溶液的配制 精密稱取二水磷酸二氫鈉適量，配制成濃度為0．20 mol/L的儲備液。取適量磷酸鹽儲備液加入適量CTAB及乙腈配制成含0．004 mmol/L CTAB、20% 乙腈及 0．020 mol/L 磷酸二氫鈉的磷酸鹽緩沖液，搖勻，用NaOH調(diào)節(jié)pH至6．5，即得所需電泳緩沖液Ⅰ。量取適量儲備液加水配制成濃度為0．020 mol/L磷酸鹽緩沖液，用NaOH調(diào)pH至6．5，得到用于稀釋樣品和對照品的緩沖液Ⅱ。

2．2．2 對照品溶液的配制 精密稱取螺內(nèi)酯對照品適量，用少量無水甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，繼續(xù)用無水甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制得到0．54 mg/ml的溶液作為螺內(nèi)酯儲備液。精確量取一定量儲備液于容量瓶中，加入pH 6．5的緩沖液Ⅱ，定容，搖勻，得20 μg/ml的對照品溶液。

2．2．3 供試品溶液的配制 每個批號的螺內(nèi)酯分別取20片，精密稱定，研成粉末，精密稱取適量(約相當(dāng)于螺內(nèi)酯50 mg)，置于50 ml燒杯中，加入無水甲醇20 ml，超聲30 min使樣品完全溶解，轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中，加pH 6．5的緩沖液Ⅱ至刻度，搖勻，得供試品儲備液。精密量取5 ml儲備液于25 ml容量瓶中，加入pH 6．5緩沖液Ⅱ，定容，即得供試品溶液。

2．3 電泳條件的選擇

2．3．1 緩沖液濃度的選擇 離子強度可以影響樣品的遷移速度、電流強度及峰寬，離子強度越大，遷移速度越小，電流越大。而電流增大會使產(chǎn)熱增加，引起焦耳熱效應(yīng)使譜帶展寬。離子強度過低會使擴散增加，也會導(dǎo)致峰展寬，而且電泳能力降低;過低的離子強度也會使pH的穩(wěn)定性下降。緩沖液的濃度直接影響離子強度，所以要選擇合適的緩沖液濃度。經(jīng)試驗優(yōu)化后，以濃度為0．020 mol/L的緩沖液最佳。不同濃度緩沖液時電泳峰形見圖2。

2．3．2 緩沖液pH的選擇 緩沖溶液pH可以改變電滲流從而影響樣品的遷移時間，還可以影響樣品解離度進而影響檢測靈敏度，所以緩沖溶液的pH是影響電泳分析的重要因素［4］。故分析時要根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇pH。本文考察了pH范圍在4．5-9．0的磷酸二氫鈉(0．020 mol/L)緩沖液，結(jié)果表明:樣品在pH 6．5時峰形最好，且遷移時間適中。當(dāng)pH＜6．5或＞6．5時峰拖尾嚴(yán)重，故實驗選擇pH為6．5的緩沖液。不同pH緩沖液時的峰形見圖3。

2．3．3 改性劑的選擇 有機溶液加入到緩沖液中可以改變電滲流、改善峰形。采用pH 6．5，濃度為0．020 mol/L的緩沖液時峰有輕微的拖尾，經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)在緩沖液中加入20%乙腈可以明顯改善拖尾，但不能改善前沿峰。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)是一種陽離子表面活性劑，它可以降低樣品吸附從而改善拖尾，并且可以控制電滲流以提高重現(xiàn)性。但是CTAB的濃度要在臨界膠束濃度(9．2 ×10-4mol/L)以下［5-9］，通過實驗發(fā)現(xiàn)濃度為0．004 mmol/L時效果最佳。

圖2 不同濃度緩沖液電泳圖譜對比Figure 2 Electrophoretogram of different concentrations of buffer solutions

圖3 不同pH緩沖液電泳圖譜對比Figure 3 Electrophoretogram of different pH buffer solutions

2．3．4 波長的選擇 應(yīng)用二極管陣列檢測器對螺內(nèi)酯進行在線檢測，在190-400 nm范圍內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)在244 nm處吸收最大、峰形最好。故采用244 nm為檢測波長。

2．3．5 電壓的選擇 電壓的大小可以影響樣品的遷移時間和峰形［10，11］。實驗分別選擇 15 kV、20 kV、25 kV作為分離電壓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電壓為15 kV時樣品的遷移時間過長;25 kV時遷移時間較短但電流增大峰形變差;20 kV時峰形較好且遷移時間不是很長。故實驗選擇20 kV作為分析電壓。

2．4 毛細(xì)管電泳條件

采用貝克曼P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀。未涂層毛細(xì)管柱(75 μm ×57 cm，有效長度10．2 cm);運行緩沖液為含有20%的乙腈和0．004 mmol/L的CTAB的，20 mmol/L的磷酸二氫鈉溶液，pH為6．5;分析電壓為20 kV，檢測波長為244 nm。

2．5 線性關(guān)系的考察

精密量取對照品儲備液適量，分別加pH 6．5緩沖液Ⅱ稀釋至 2 ml，搖勻，得到 1．62，7．56，15．12，19．98，59．94，119．9 μg/ml的螺內(nèi)酯溶液，對應(yīng)編號1-6號，在上述毛細(xì)管電泳條件下進行測定。

以螺內(nèi)酯濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)將所得數(shù)據(jù)進行線性回歸，得回歸曲線，回歸方程為Y=877．7X+4 238(r2=0．991 6)。結(jié)果表明在 1．62-119．9 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見圖 4)。

2．6 精密度試驗

精密吸取線性關(guān)系考察試驗中的5號對照品溶液適量，在上述電泳條件下連續(xù)進樣6次，測得峰面積的RSD為1．1%，表明儀器的精密度良好。

2．7 重復(fù)性試驗

取同一批號螺內(nèi)酯片(批號:046140702)，按照2．2．3項下的方法平行配制6份供試品溶液，在上述電泳條件下進行測定，分別求出螺內(nèi)酯的含量，計算得RSD為3．4%。表明本法的重復(fù)性較好。

圖4 螺內(nèi)酯工作曲線Figure 4 Calibration curve of spironolactone

2．8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(批號:046140702)，分別于配制后0，2，4，6，8 h在上述色譜條件下進樣測定，螺內(nèi)酯峰面積的RSD為2．3%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．9 加樣回收率試驗

在已知含量的供試品溶液(批號:046140702)中，精密加入一定量的對照品溶液使成高、中、低三個不同濃度的供試品溶液，在上述電泳條件下進行測定，求得螺內(nèi)酯的回收率為91．2%-106．6%。

表1 螺內(nèi)酯的加樣回收率Table 1 Sample recovery rate of spironolactone

2．10 供試品中螺內(nèi)酯的含量測定

按2．2．3項下的方法配制三種批號的供試品溶液，在上述電泳條件下進行測定，結(jié)果見表2。

表2 螺內(nèi)酯片中螺內(nèi)酯的含量測定 (n=3)Table 2 Contents of spironolactone in spironolactone tablets(n=3)

上述測定結(jié)果顯示，2個批號(T14J048和046140702)的螺內(nèi)酯片中螺內(nèi)酯的含量符合原衛(wèi)生部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(WS3-B-2411-97)的要求;批號T10J504由于已過保質(zhì)期，從結(jié)果可以看出含量偏低，說明隨著藥品存放時間的延長，螺內(nèi)酯的含量呈現(xiàn)一定的下降趨勢。

3 討論

本實驗在優(yōu)化的樣品制備條件及電泳條件下對螺內(nèi)酯片劑進行了含量測定，結(jié)果表明螺內(nèi)酯片劑的含量可在此條件下獲得。由系統(tǒng)驗證性實驗和樣品含量測定的實驗結(jié)果可看出該法精密度、穩(wěn)定性良好，測定準(zhǔn)確，并且毛細(xì)管電泳測定的方法較之高效液相的方法簡便、快速、分析成本低且污染較小，可作為螺內(nèi)酯制劑中螺內(nèi)酯的質(zhì)量控制方法。

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