芬太尼對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株Eca109侵襲和基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響

張明鑫，何 平，張靈敏，王景杰(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 70038;西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科; 通訊作者，E-mail:jingjie@fmmu．edu．cn)

麻醉作為腫瘤外科手術(shù)必不可少的環(huán)節(jié)之一，在腫瘤手術(shù)治療中發(fā)揮重要的作用，其對(duì)腫瘤治療的影響受到越來(lái)越多的關(guān)注。最初的研究證實(shí)不同的麻醉方式(局麻vs全麻)可影響免疫系統(tǒng)而影響腫瘤的預(yù)后，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)麻醉藥物不僅對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，同時(shí)還可以直接作用于腫瘤細(xì)胞［1－3］。芬太尼等在癌癥患者手術(shù)、術(shù)后鎮(zhèn)痛及癌痛治療中應(yīng)用廣泛。已有研究證實(shí)，芬太尼可以抑制肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤的惡性生物學(xué)行為，但對(duì)食管癌侵襲的影響罕見(jiàn)報(bào)道［4－9］。大量研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶 2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)與腫瘤的侵襲密切相關(guān)［11，12］。本研究探討了不同劑量芬太尼對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株Eca109侵襲能力的影響及其對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞株及主要試劑

人食管鱗癌細(xì)胞系Eca109購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)基、0．25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，MMP-2(sc-6838)和MMP-9多克隆抗體(sc-6840)及釋辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗購(gòu)自美國(guó)santa cruz公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)于含胎牛血清100 ml/L、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 ng/ml的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、50 ml/L CO2的濕潤(rùn)無(wú)菌環(huán)境。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況每48－72 h傳代1次。

1．3 芬太尼干預(yù)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Eca109細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)需要接種于不同濃度不同的培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染當(dāng)天至細(xì)胞密度為50%左右，每組3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)文獻(xiàn)［6，7］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置劑量組為0(對(duì)照組)，0．5，5，50，500 ng/ml。

1．4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲

用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，取 100 μl細(xì)胞懸液加入 Transwell小室(Matrigel膠已鋪)，培養(yǎng)板內(nèi)加入200 μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h取出小室，棉拭子刮除膜上層的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，0．1%結(jié)晶紫染色10 min，每組隨機(jī)取5個(gè)視野，在顯微鏡下計(jì)算每個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)。

1．5 實(shí)時(shí)定量熒光PCR

收集干預(yù)后的細(xì)胞，常規(guī)Trizol試劑抽提總RNA，按照之前實(shí)驗(yàn)方法行miR-520a定量檢測(cè)［7］，將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95℃變性5 min;95℃ 10 s，60℃20 s，72 ℃ 20 s，78 ℃ 20 s(收集熒光)，共 40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 本實(shí)驗(yàn)用到的RT-PCR引物Table 1 The RT-PCR primer sequence used in the experiment

1．6 蛋白印跡

干預(yù)后48 h常規(guī)提取總蛋白，每種樣本取等量(20 μg)的蛋白，行10%SDS-PAGE凝膠電泳后，半干法轉(zhuǎn)至PVDF硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)好的蛋白印跡膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，脫脂牛奶稀釋的MMP-2和MMP-9的多克隆抗體(1∶500)4℃反應(yīng)過(guò)夜，TBST洗膜5 min×4次，用TBST稀釋辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶2 000)第二抗體室溫下反應(yīng)2 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光檢測(cè)，X線片顯影，掃描圖像，分析結(jié)果。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 芬太尼對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響

通過(guò)隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算染色細(xì)胞數(shù)，以細(xì)胞數(shù)多少判定腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，芬太尼孵育48 h各濃度組細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0．05)，表示芬太尼可以抑制細(xì)胞的侵襲，隨濃度增大，抑制效果呈濃度依賴(lài)性(P ＜0．05，見(jiàn)圖1，2)。

圖1 不同濃度芬太尼對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca109侵襲的影響(×100)Figure 1 Effect of fentanyl on cell invasion of Eca109(×100)

圖2 不同濃度芬太尼對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca109侵襲的影響Figure 2 Effect of fentanyl on cell invasion of Eca109

2．2 芬太尼對(duì)食管鱗癌細(xì)胞MMP2和MMP-9表達(dá)的影響

芬太尼孵育Eca109細(xì)胞48 h，與對(duì)照組相比，各濃度組MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白的表達(dá)均下調(diào)，且隨著濃度增大，抑制效果呈濃度依賴(lài)性(P ＜0．05，見(jiàn)圖3)。

3 討論

世界范圍內(nèi)食管癌的發(fā)病率和致死率分別位于常見(jiàn)腫瘤第八位和第六位，其中食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)在東亞地區(qū)占主要地位，約50%的ESCC病例發(fā)生在中國(guó)［10］。手術(shù)是根治食管鱗癌最重要的治療方式。通過(guò)長(zhǎng)期的努力，近年我國(guó)食管鱗癌的發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，但由于大部分初診病例已為中晚期，故預(yù)后仍不理想。即使行手術(shù)治療，仍容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致不良預(yù)后，5年生存率僅在10%－13%［13］。故探討癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及預(yù)防轉(zhuǎn)移的治療方法意義重大。

芬太尼可用于腫瘤手術(shù)麻醉和癌痛治療。芬太尼能夠在體外實(shí)驗(yàn)中抑制腫瘤細(xì)胞的包括侵襲在內(nèi)的多種惡性表型［4－9］，但芬太尼對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的影響未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。芬太尼可達(dá)到手術(shù)鎮(zhèn)痛效果的血漿濃度是0．23－1．18 ng/ml，其癌痛治療的效應(yīng)室濃度需大于2 ng/ml。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的芬太尼可抑制食管鱗癌細(xì)胞株Eca109的侵襲，呈劑量依賴(lài)性。細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤細(xì)胞脫落轉(zhuǎn)移的主要障礙。大量的研究證實(shí)，MMP-9和MMP-2在包括食管鱗癌的多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分—基底膜Ⅳ型膠原在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11，12］。本研究顯示，芬太尼可能抑制MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)移的作用。

圖3 芬太尼對(duì)細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響Figure 3 Effect of fentanyl on mRNA and protein expression of MMP-2 and MMP-9 in Eca109 cells

在食管鱗癌手術(shù)時(shí)就使用具有抑制轉(zhuǎn)移的芬太尼，對(duì)預(yù)防食管鱗癌的術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有積極的影響。此外，芬太尼還用于癌痛治療，且安全性及耐受性良好，從而可以對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移長(zhǎng)效抑制［14］。為明確其遠(yuǎn)期效應(yīng)及對(duì)患者預(yù)后的影響，有必要通過(guò)大樣本臨床隨機(jī)試驗(yàn)，探討芬太尼術(shù)中及術(shù)后鎮(zhèn)痛應(yīng)用對(duì)于患者生存期的影響。

［1］Cassinello F，Prieto I，del Olmo M，et al．Cancer surgery:how may anesthesia influence outcome［J］．J Clin Anesth，2015，27(3):262－272．

［2］Sun X，Yang C，Li K，et al．The impact of anesthetic techniques on survival for patients with colorectal cancer:evidence based on six studies［J］．Hepatogastroenterology，2015，62(138):299－302．

［3］張靈敏，張明鑫，景桂霞．麻醉對(duì)腫瘤治療及預(yù)后的影響［J］．醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策版)，2010，31(10):46－47．

［4］邢玉英，孟俊青，徐紅萌，等．芬太尼和瑞芬太尼對(duì)人肺癌A549細(xì)胞活力的影響［J］．中華麻醉學(xué)雜志，2012，32(7):817－819．

［5］劉震，阮林．芬太尼和瑞芬太尼對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生物學(xué)特性的影響［J］．臨床麻醉學(xué)雜志，2014，30(8):792－795．

［6］管恩健，覃怡，利莉，等．嗎啡和芬太尼對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞遷移能力的影響［J］．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29(11):2178－2179．

［7］王志學(xué)，雷燕，王利軍，等．芬太尼與5－氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的影響［J］．中國(guó)老年學(xué)雜志，2014，34(12):3276－3278．

［8］Zhang XL，Chen ML，Zhou SL．Fentanyl increases colorectal carcinoma cell apoptosis by inhibition of NF-κB in a sirt1-dependent manner［J］．Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(22):10015－10020．

［9］Nomura Y，Kawaraguchi Y，Sugimoto H，et al．Effects of morphine and fentanyl on 5-fluorouracil sensitivity in human colon cancer HCT116 cells［J］．J Anesth，2014，28(2):298－301．

［10］Siegel R，Naishadham D，Jemal A．Global cancer statistics［J］．CA Cancer J Clin，2013，63(1):11－30．

［11］Yang L，Parkin DM，F(xiàn)erlay J，et al．Estimates of cancer incidence in China for 2000 and projections for 2005［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14(1):243－250．

［12］Chaudhary AK，Pandya S，Ghosh K，et al．Matrix metalloproteinase and its drug targets therapy in solid and hematological malignancies:an overview［J］．Mutat Res，2013，753(1):7－23．

［13］Zhang L，Xi RX，Zhang XZ．Matrix metalloproteinase variants associated with risk and clinical outcome of esophageal cancer［J］．Genet Mol Res，2015，14(2):4616－4624．

［14］Xing SZ，Zhang Y．Efficacy and safety of transdermal fentanyl for the treatment of oral mucositis pain caused by chemoradiotherapy in patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］．Support Care Cancer，2015，23(3):753－759．